このプロトコルは、C.Elegansを動員して体壁筋肉の生体内カルシウムイメージングを行う2つの方法を提供する。この方法は、カルシウムホメオスタシスおよびカルシウム処理に関連する質問、および遺伝的に難解な生物におけるアクセス可能なシナプスに関する質問に答えるのに役立ちます。この技術は、カルシウム恒常性の筋肉を調節するメカニズムをよりよく理解することができ、したがって、カルシウムサイクリングの誤調節を通じて励起収縮結合に影響を与える条件または分子経路を同定する上で重要である可能性がある。
これらの方法は、神経生物学、発生生物学、細胞生物学などの研究分野に関する洞察を提供することができます。これらの技術は、様々な細胞タイプおよびC.elegans、他の関連線虫ならびにフィルサファット幼虫を研究するために適応することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションは、実験者が解剖技術を理解し、適切に固定化された動物からのカルシウム過渡症を正確に評価できるように非常に重要です。
蛍光イメージング用の顕微鏡を設置して開始します。カルシウムレベルの急激な変化を追跡するために、100ヘルツでフルフレームイメージングが可能な科学的CMOSカメラを使用してください。ImageJで実行されているマイクロマネージャーソフトウェアを使用して、カメラの取得とLED蛍光励起を制御します。
外部のオープンソースマイクロコントローラボードに接続するオープンソースの電子プラットフォームプラグインを使用して、蛍光励起を制御する外部タイミングパルスを管理します。タイミングロジックを制御するには、製造元の指示に従ってソフトウェア内のマイクロマネージャ取得プロトコルをアクティブにします。2 つの LED を使用して、青色光でチャネル ロドプシンを刺激し、RCaMP の変化を記録します。
470ナノメートルのピーク入場波長とバンドパスフィルタを持つam LEDでチャネルロドプシンを活性化し、594ナノメートルのピーク入場波長とバンドパスフィルタを備えたLEDでRCaMPを励起します。両方のLEDを同時に照らし、二色ビームコンバイナを使用して同じ光路に光を伝達します。原稿の方向に従ってTTL信号によって制御されるソリッドステートスイッチでLED照明のタイミングを制御し、現在制御された負荷ノイズリニア電源装置でLED強度を設定し、次にブルーライトシミュレーションプロトコルをシミュレータにプログラムします。
この実験では、RCaMP蛍光のみを2秒間撮影した後にブルーライトシミュレーションをオンにし、50ミリ秒間隔の5ミリ秒の青色光パルスを2ミリ秒で使用してチャネルロドプシンを活性化します。解剖準備を使用する場合は、低光でC.elegans解剖を行う。原稿の指示に従って調製されたカルシウム細胞外溶液の1ミリモルで満たされたシリコーンコーティングカバースリップベースで解剖皿に動物を置きます。
ワームの後側に沿って青い着色と液体局所皮膚接着剤を使用して動物を接着します。そしてガラスの針を使用して接着剤およびワームインターフェイスに沿って横のキューティクルの切開を行う。口のピペットを使用してワームキャビティから内臓を取り除き、動物のキューティクルフラップを接着して、画像撮影のために腹側内側の体壁の筋肉を露出させます。
ナノビーズ調製物を使用する場合は、蒸留水を使用して5%アグラ溶液を最終体積100ミリリットルにする。パスツールピペットを使用して、溶融アグラ溶液をガラススライドに一滴置き、すぐに優しく圧力をかけて2番目のガラススライドを上に置き、アグラのパッドを作成します。上部スライドを取り外し、パッドの中央に約4マイクロリットルのポリスチレンナノビーズを取り外します。
低照度でナノビーズ溶液に4〜6個のC.elegansを加え、動物が互いの上に横たらないようにし、慎重にカバースリップを上に置きます。イメージを作成する準備ができたら、準備したスライドまたは解剖皿を顕微鏡に置き、10倍の倍率と明るいフィールド照明を使用してワームを見つけて集中します。RCaMP蛍光励起の60倍の倍率に切り替えて、外陰部の前部および正しい声面にある心室の内側の身体壁の筋肉を識別する。
次に、トグルを引き出してデータ取得ソフトウェア内のライブをクリックして、接眼眼機からカメラへの画像経路を変更します。データ取得ソフトウェアの ORI ボタンをクリックし、フォーカスしている筋肉の周りにボックスを作成します。刺激装置で、以前にプログラムされた青色光刺激経路をオンにし、イメージングソフトウェアの取得をクリックして画像をキャプチャします。
C.elegansが全トランスレチナルで成長し、正常にレチナルを組み込み、チャネルロドプシンを活性化すると、カルシウム一過性を誘発することができる。動物が全トランスのレティナルにさらされない場合、筋肉カルシウム一過性は引き起こされません。このプロトコルは、sca-1遺伝子によってコードされるサルコプラスムレチクルムカルシウムポンプに影響を与える機能sca-1変異体の喪失を調査するために使用された。
しかし、RCaMP蛍光のベースラインレベルの増加する解剖製剤は、対照と比較して突然変異体において観察され、突然変異が安静細胞質カルシウムの上昇レベルを必要とすることを示唆した。sca-1変異体のピークカルシウムレベルは、対照と比較して有意に減少した。しかし、上昇したピークタイムや半分の減衰時間には変化は見られなかった。
重要なことに、同様の結果は、技術的に挑戦的でないナノビーズ調製物を使用して観察することができる。カルシウム活性化大きなカリウムチャネルを破壊する機能スロ突然変異体の喪失は、C.elegansにおけるカルシウム処理に間接的に影響を与える突然変異体を調査するために評価された。RCaMPのベースラインレベルを測定した場合、変異体はコントロールと比較して増加した蛍光を示した。
カルシウム一過性の運動学を評価する際には、ピークカルシウムレベルに変化は見られなかった。しかし、slo-1(eg142)変異体はピーク時まで有意に上昇を示した。手順を完了するときに覚えておかねばならない最も重要なステップは、全トランスの残用で実験動物を準備することです。
このステップがなければ、チャネルロドプシンは不活性になり、光誘発カルシウム過渡性が引き起こされるのを防ぎます。この手順に従って、カルシウム恒常性の変化が観察された機能への影響を評価するために、電気生理学および行動解析を行うことができる。ここで概説する固定化法を用いて、カルシウムダイナミクスのさらなる探査への道を開き、はるかに挑戦的でないビーズ固定化技術を使用して、光遺伝学的神経刺激および筋肉カルシウム過渡症の捕獲に応じて同等の結果を観察できることを実証する。
