この作品は、NIH グラント GM59354 シャロン E. Bickel に授与によって支えられました。Q. ウイ グエンにアン Lavanway 共焦点顕微鏡のヘルプとテクニカル サポートに J. エミリアーノ リード蛍光腕プローブの生成のためのプロトコルの開発に支援ありがちましょう。また、有用な議論やアドバイスのためのショウジョウバエのコミュニティで多くの同僚らを感謝いたします。

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著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

私と中期 prometaphase の腕の結束の状態を評価するプローブの魚の使用私のショウジョウバエの卵母細胞はショウジョウバエの減数分裂の分野の重要な進歩。歴史的に、ショウジョウバエ研究者は成熟卵11,18,19腕結束の早期喪失を推論するための遺伝子検査に限られています。今、紹介した方法で腕の結束の状態ことができます試金する魚を使用して直接。大きく腕結束の早期喪失の物理的な証拠を取得する機能は、ショウジョウバエの卵母細胞腕凝集度と染色体紡錘の早期喪失につながるメカニズムを研究に利用可能なアプローチのレパートリーを展開します。
重要なステップ 成熟したショウジョウバエの卵母細胞における染色体腕に沿ってシングル コピー シーケンスに交配する蛍光プローブの成功した可視化のために必要な重要なパラメーターの系統的解析を施しておりませんが、おりますが、この手法の成功に貢献するかもしれない要因の次の一覧。約 0.8 Mb Xの間隔をカバーする BAC プローブを重複する六つの組み合わせを用いて腕プローブを生成-染色体腕。小さい地域をまたがる少ない BACs を使用して私たちの初期の試みは成功しなかった。また、フラグメントし、Alexa 647 と終り分類前に BAC DNA を増幅する方法を使いました。ラベルの貼られた制限のフラグメントの大半はだった 100 200 bp 長い (図 2)、厚い組織21を通じて効率的な拡散に必要な 150 のヌクレオチドのターゲット サイズと同様です。大規模なショウジョウバエの卵母細胞の形態を維持がもプローブの浸透を許可する固定条件が不可欠です。室温ヘプタンを 37 ° C に予熱した修正プログラム ソリューションに追加することにより、以前使用していた固定法23を変更しました。固定のため体温の低下と同様、卵黄膜を浸透させるヘプタン添加が腕の凝集度の可視化に成功した固定状況に寄与していることが可能だと考えています。
存在する欠陥の定量化を可能にするサンプル サイズが必要です 1 つときに早期喪失結束のための試金、低中程度のレベルで。多数の成熟した卵子を得るためには、他の26,27をふるい併用成人女性のミキサー破壊を使用しました。ここで述べる手に 20-25 女性から卵巣を解剖、手動分離後半のピペッティングによる卵母細胞をステージします。ミキサー/篩方法もこのプロトコルで動作しますが、手解剖の利点の 1 つが、ふるいステップなし卵時間を費やす少ない固定の後期の可能性が減少する前にバッファーに私人工卵による発症活性化。さらに、このメソッドは、開始材料として少ない女性を必要とする、試薬の小さいボリュームを使用複数遺伝子の処理を容易にするすべてのワークフローを単純には。
成熟卵の手郭清とマニュアルの分離卵黄膜と卵殻膜の除去のための「ロール」に卵母細胞の十分な量を提供して交配の洗浄の最後に 75-150 の卵母細胞になります。1 つのトリックの収率を最大限に卵子を逮捕された中期郭清25前に男性の不在で yeasted バイアルに処女雌を保持することです。絨毛と卵黄の膜を削除するローリング卵母細胞は卵母細胞を破壊することを避けるために優しいタッチで行う必要があります。しかし、卵子の 100% から絨毛と卵黄膜を削除は現実的な目標ではありません、卵母細胞の損失の結果だけ過剰なローリングします。したがって、各ローリング サイクルする必要があります停止するとき卵不足絨毛と卵黄膜の約 75-85%。
制限 生成と成熟したショウジョウバエの卵母細胞の結束の状態を監視するアームのプローブを使用して私たちの成功にもかかわらず、プロシージャはまだ制限から苦しみます。Pericentromeric プローブの信号を検出する失敗したほとんどの腕プローブ信号は弱いまたはイメージを描き、卵子の約 15-20% で欠席します。要因の 1 大きい腕プローブ (100-200 のヌクレオチド) 対番オリゴヌクレオチド プローブ (22-28 ヌクレオチド) の差分の浸透があります。また、腕プローブよりも明るくなっている信号で番プローブにより認識される大きな反復配列。卵母細胞と卵母細胞の減数分裂期染色体の配置の向きは、イメージングとも課題を提示.減数分裂の染色体が細胞の皮質に近い比較的、上、マウントする際、卵の向きを制御することはないです。したがって、卵子の一部の減数分裂の染色体があります、coverslip と信号強度から 100-200 μ m と品質が低下する場合が卵母細胞の大部分をイメージしようとしたとき。これらの制限は、最終的な定量的分析に含まれる卵の数がプロトコルで処理卵母細胞の数よりもかなり低いという意味します。100 卵母細胞腕結束の状態を決定する 2 つの独立準備が必要になりますほとんど。レーザー共焦点顕微鏡を用いた凝集欠陥の定量化における追加の制限要因は典型的な Z シリーズ (約 5 分) をキャプチャするために必要な時間キャプチャー エリアが 1,024 × 512 ピクセルに限定される場合も。つまり制御と実験的遺伝子型 (100 卵) における結束性の比較は画像コレクション時間の約 16 時間を必要とします。
変更とトラブルシューティング 我々 は細胞学的位置 7B 6E19 X染色体を認識するプローブを用いた腕の結束の状態を監視することができた。X染色体上のより遠位の場所に交配するプローブは、キアズマ メンテナンス障害検出より望ましいかもしれません。さらに、他の研究者は、他の染色体の腕の凝集を分析したい場合があります。我々 はない、座位をプローブを試みている、またX染色体の 2 階-3 C 領域を認識するプローブの探索可能なシグナルの結果、予備的なデータを示しています。しかし、限られた予備的なデータに基づき、2 階-3 C プローブの信号かもしれません 7B 6E プローブよりも少ない「コンパクト」。魚信号がしっかりといくつかの卵母細胞の染色体の鮮明な他の卵母細胞の染色体に交配信号はかなり拡散。信号のこれらの相違は 2 つの細胞の場所の染色体形態の本物の違いを反映して、かどうか 2 つのハイブリダイゼーション効率の変動はプローブ、または異なる卵子間だけ確率変動徹底的な分析が必要です。
重要なは、6 e 7B プローブのもいくつか卵母細胞のびまん性染色体信号を見ましたこれはしばしば解析から除外を必要とします。さらに、信号の品質および 7B 6E プローブの異なる製剤間の明るさの変化を気づいている、これはその画像を必要なパラメーター調整。交配温度 42 ° c を上げる拡散信号と卵母細胞数下がりませんでしたが、それは番オリゴヌクレオチド プローブの信号に影響を与える深刻な。私たちはまた (80 ° C) 低い温度で長く変性のステップを試みたがこの治療に信号強度を増加もびまん性と卵母細胞の数を減らしたことを見つけたより良い染色体形態24を維持する努力、染色体の魚の信号。我々 はまた細胞領域 5 e 7B をスパン約 1.5 Mb 間隔に対応する 12 の重なり合う BACs を使用して明るい腕信号を取得ましょう。12 BAC プローブを使用している場合、信号強度の変動の程度だけでなく、信号に欠けている卵子の割合が 6 BACs が腕プローブに使われたときよりも異なっていた。またより魚信号が大きく、個々 の染色分け体に対応するスポットを解決することが難しく、12 の BAC プローブを使用する場合、凝集性欠陥のスコアに挑戦的だった。新しく準備されたプローブを信号が得られない場合、研究者は増幅のサイズを確認する必要があります、制限消化 BAC DNA 最後のラベルに使われるフラグメントが 100-200 bp の範囲の内で主にことを確認します。これは成功したプローブの準備の最も重要な要因の 1 つになります。
今後の方向性 免疫染色を含めるプロトコルの適応し同様、画像の取得を強化する将来の仕事には、他の研究者の利益となる大きな改善となります。イメージ コレクション中に高速画像取得と同様、軸ディメンション内のイメージの大きい数を集める結束欠陥の定量化のために有利でしょう。共焦点走査型レーザー用撮像パラメーターの最適化、0.25 μ m だった魚のかなり漂白を避けるために Z シリーズに使用できる最小のステップ サイズが信号を発見しました。ただし、Z スタック未満 0.25 μ m で区切られている魚信号、このステップ サイズは焦点間の「スペース」をキャプチャする失敗可能性があります、したがって結束欠陥の数を過小評価する可能性があります。回転のディスク共焦点画像集録速度が信号を漂白せずに使用するステップ サイズを小さくできます。これより正確な画像再構成軸ディメンションを提供として結束欠陥で分析する卵子の数が大きい許可でしょう。さらに、腕の結束の状態の魚の可視化による免疫染色を組み合わせる機能はプロトコルを大幅強化するでしょう。準備作業の数、スピンドル染色交配の手順を実行しました。しかし、堅牢なスピンドルの染色は卵母細胞のごく一部のみに表示されます。また、理由は明確ではないが、高レベル魚スプリアスの囲まれた減数分裂の染色体魚や免疫染色が結合されたとき。さらに魚のプロシージャのこの技術の機能大幅拡大に向けて前後に免疫染色を許可するプロトコルを最適化する作業です。

有糸分裂と減数分裂時の染色体の分離が適切な必要とその姉妹染色分け体の凝集性の確立、維持、・連携1,2のリリースします。凝集度は S 期の間に確立され、姉妹を保持する物理の連携を形成するコヒーシン複雑、により媒介される染色分け体一緒に。減数分裂、クロス オーバーの遠位結束も組換え同族体を一緒に保持する機能し、この物理的な関連付けにより、適切な方向 (図 1)3,4、減数分裂に 2価の紡錘 5。リリース アームの後期で結束対極スピンドルに分離する同族体が可能します。ただし、腕結束がある場合途中で失われた組換え同族体の物理的な接続を失う、異数性配偶子 (図 1) につながることができます、ランダムに分離します。
人間の卵子の染色体分配のエラー6、ダウン症候群などの先天異常と流産の原因、その発生率は、母体年齢7とともに指数関数的に増加します。胎児卵母細胞で姉妹染色分け体の凝集が確立され、出生前に減数分裂組み換えが完了しました。卵母細胞、中期前期私排卵までと逮捕この逮捕中に、組換え同族体の継続的な物理的な連合の依存姉妹染色分け体結束。したがって、減数分裂と正常妊娠の転帰の間に正確な分離は、最大 5 年間の凝集力がそのまま残ること必要があります。
人間の卵子の減数分裂長期逮捕時に結束の早期喪失は母親年齢の効果に貢献する提案されているし、証拠の複数のラインは、この仮説8,9をサポートします。ただし、ヒトの卵母細胞の減数分裂の結束を研究の課題を考えると、この現象の私達の理解の多くは、モデル生物5,10、11,12,の使うことで13,14,15。
ショウジョウバエの卵母細胞は減数分裂の結束と染色体の偏析の研究のための多数の利点を提供しています。単純な遺伝的アッセイ異数性配偶子から子孫を回復し、 Xの忠実度を測定することができます-大規模な11,16,17染色体分離。さらに、1 つも減数分裂期組換え同族体 missegregate アーム結束11,18,の早期喪失と一貫性のある表現型、私ために染色体分離エラーが発生するかどうかを決定可能性があります19. 直接ショウジョウバエの卵母細胞の減数分裂の結束の状態の観察が可能な蛍光現場の交配 (魚) を使用しても。反復的な衛星シーケンスに交配する蛍光のオリゴヌクレオチドが使用されているため 10 年以上 pericentromeric 結束の成熟したショウジョウバエ卵4、20アームの分析を監視するには凝集度は、はるかに困難されています。腕の結束の状態の可視化には、シングル コピーの大規模な地域にわたるプローブ シーケンスし、アーム結合が存在しないときに個々 の妹のため目に見えるシグナル染色分け体が発生するには十分に明るいですが必要です。さらに、卵母細胞固定条件と分類された Dna のサイズは大きな成熟したショウジョウバエ卵母細胞 (200 μ m 幅 500 μ m 長で) に浸透21を促進する必要があります。最近、腕プローブが正常に利用いる prometaphase で信号の検出できませんでした述べたけど、著者、後期中ショウジョウバエ卵母細胞染色分け体を可視化するまたは中期卵22を逮捕しました。ここでは、 Xの生成のための詳しいプロトコルを提供-私と中期染色分け体結束 prometaphase の妹の早期喪失の試金する私たちを許可している卵母細胞調製条件と魚プローブ染色体腕私卵。減数分裂の結束の維持に必要な遺伝子の製品を識別するために私たちを有効に、これらのテクニックになります他の姉妹のために試金する染色分け体結束異なった遺伝子型の成熟のショウジョウバエ卵の欠陥します。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi Prep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Prep BAC clone DNA</td></tr><tr><td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td><td>Sigma</td><td>WGA2</td><td>Amplify BAC clone DNA</td></tr><tr><td>ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit</td><td>Invitrogen</td><td>A21676</td><td>Label BAC clone DNA</td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals &amp;amp; Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Note: &lt;/strong&gt;All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Prepare 10% stock&lt;br/&gt; Freeze aliquots</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;rsquo;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>&lt;strong&gt;Toxic:&lt;/strong&gt; wear appropriate protection. Prepare 100&amp;micro;g/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 &amp;deg;C. Prepare 1 &amp;micro;g/ml solution in 2X SSCT before use.</td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Sigma</td><td>D-8906</td><td></td></tr><tr><td>Drierite</td><td>Drierite Company</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td>Prepare 10 mM stock</td></tr><tr><td>dTTP (10 &amp;micro;mol, 100 &amp;micro;l)</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>1277049</td><td>Prepare 1 mM stock</td></tr><tr><td>EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>Prepare 250 mM stock</td></tr><tr><td>100% ethanol (molecular grade, 200 proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)</td><td>Sigma</td><td>E-3889</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyde</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>&lt;strong&gt;Toxic:&lt;/strong&gt; wear appropriate protection</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td>&lt;strong&gt;Toxic: &lt;/strong&gt;wear appropriate protection</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>737-151</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-4</td><td>&lt;strong&gt;Toxic:&lt;/strong&gt; wear appropriate protection.</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Millipore</td><td>HX0603-4</td><td>&lt;strong&gt;Toxic:&lt;/strong&gt; wear appropriate protection.</td></tr><tr><td>Hydroxylamine</td><td>Sigma</td><td>438227</td><td>Prepare 3 M stock</td></tr><tr><td>4.9 M Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>104-20</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;&amp;Yuml; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;&amp;Yuml; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (0.1mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>P8920-100</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S209-500</td><td>Prepare 3M stock</td></tr><tr><td>Sodium cacodylate</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1131</td><td>&lt;strong&gt;Toxic: &lt;/strong&gt;wear appropriate protection. Prepare 400mM stock</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Sodium chloride</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Note: &lt;/strong&gt;All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0</td></tr><tr><td>20X SSC (Saline Sodium Citrate)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 300 mM sodium citrate</td></tr><tr><td>2X cacodylate fix solution</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Toxic:&lt;/strong&gt; wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA</td></tr><tr><td>1.1X Hybridization buffer</td><td></td><td></td><td>3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate</td></tr><tr><td>Fix solution</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Toxic: &lt;/strong&gt;wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution</td></tr><tr><td>PBSBTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100</td></tr><tr><td>PBSTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Trition X-100</td></tr><tr><td>Extraction buffer (PBSTx + Rnase)</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Trition X-100, 100 &amp;micro;g/mL RNase</td></tr><tr><td>2X SSCT</td><td></td><td></td><td>2X SSC, 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>2X SSCT + 20% formamide</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Toxic:&lt;/strong&gt; wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide</td></tr><tr><td>2X SSCT + 40% formamide</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Toxic:&lt;/strong&gt; wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide</td></tr><tr><td>2X SSCT + 50% formamide</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Toxic:&lt;/strong&gt; wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Enzymes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AluI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0137S</td><td></td></tr><tr><td>HaeIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0108S</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>RsaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0167S</td><td></td></tr><tr><td>BfuCI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0636S</td><td></td></tr><tr><td>100X BSA</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>Comes with NEB enzymes</td></tr><tr><td>10X NEB buffer #2</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes</td></tr><tr><td>Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/&amp;micro;l</td><td>Roche/Sigma</td><td>3333566001</td><td></td></tr><tr><td>TdT buffer</td><td>Roche/Sigma</td><td></td><td>Comes with TdT enzyme</td></tr><tr><td>Cobalt chloride</td><td>Roche/Sigma</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Toxic: &lt;/strong&gt;wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme</td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/mL)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cytology Tools etc.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>#5 INOX, Biologie</td></tr><tr><td>9&amp;rdquo; Disposable glass Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td>Autoclave to sterilize</td></tr><tr><td>Shallow glass dissecting dish</td><td></td><td></td><td>Custom made</td></tr><tr><td>Deep well dish (3 wells)</td><td>Pyrex</td><td>7223-34</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-104</td><td>Used to cover deep well dishes</td></tr><tr><td>Frosted glass slides, 25 x 75 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>48312-002</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td></td><td></td><td>homemade</td></tr><tr><td>Prolong GOLD mounting media</td><td>Molecular Probes</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Compressed-air in can</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000, spectrophotometer</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table top microfuge at room temperature</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table top microfuge at 4 &amp;deg;C</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven or incubator with rotator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1RSi laser scanning confoal</td><td>Nikon</td><td></td><td>40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables etc.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microfuge tubes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;micro;l microfuge tubes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l PCR tubes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic container with tight fitting lid</td><td>Various</td><td></td><td>To hold Drierite</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Various</td><td></td><td>disposable wipes</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Various</td><td></td><td>paraffin film</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC purified 5&#039;-labeled oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the &lt;em&gt;X&lt;/em&gt; chromosome</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image Analysis Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Version 6.3</td></tr></tbody></table>

using fluorescence in situ hybridization (fish) to monitor the state of arm cohesion in prometaphase and metaphase i drosophila oocytes

ヒトでは、卵母細胞における染色体分離エラーが流産や先天性欠損症の大半を担当です。さらに、女性の年齢、妊娠 aneuploid 胎児が大幅に増加、このような現象のリスクは母体年齢効果と呼ばれます。減数分裂の分裂時の正確な染色体分離の要件の 1 つは妹のメンテナンス卵母細胞が発生する拡張前期期間中に染色分け体結束。人間のモデル生物細胞学的証拠では、老化の過程減数分裂凝集度を劣化させることを示唆しています。人間の卵子に偏析エラーは減数分裂の間に最も普及している、さらに、私は、腕の結束の早期喪失と一貫性のあります。モデル有機体の使用は、凝集度の年齢依存性損失の根底にあるメカニズムの解明にとって重要です。キイロショウジョウバエでは、卵母細胞の減数分裂の凝集の制御を勉強するためのいくつかの利点を提供しています。しかし、最近まで、遺伝テストのみでした腕結束異なった遺伝子型の異なる実験条件下で卵母細胞の損失の分析に利用できます。ここでは、詳細なプロトコルで、私は、ショウジョウバエの卵母細胞を逮捕された中期の腕 prometaphase の結束の交配 (魚) を直接可視化する蛍光その場で使用するため欠陥を提供。X染色体の遠位腕に交配魚プローブを生成および共焦点 Z スタックを収集、研究者が 3 つの次元での個々 の魚信号数を視覚化して姉妹かどうかを決定する染色分け体腕区切られました。手順では、ショウジョウバエの卵母細胞の何百もの arm 結束欠陥を定量化可能です。そのため、このメソッドは、結束のメンテナンスだけでなく、老化プロセスの間に死につながる要因に寄与するメカニズムを調査するため重要なツールを提供します。

X染色体の細胞学的地域 6E 7B に交配腕プローブで得られた画像を図 5に示します。共同の DAPI、ローカライズ信号でこの検出結果の例は、背景から識別しやすいと正常に異なった遺伝子型19腕結束の欠陥を定量化するために使用されています。結束性欠陥の定量化は制限された prometaphase に私と中期私段階;核膜崩壊前に卵母細胞は、解析19から除外しました。卵母細胞の染色体に囲まれて離散円形領域は周囲の細胞より暗いので DAPI チャンネルでスキャンする場合、そのまま核封筒は明らかです。
図 5Bは、デコンボリューションとコントラスト強化後個々 の Z シリーズの最大輝度投影相関を示しています。結束性欠陥の定量化は、各プローブの魚数信号、重なる DAPI 信号を決定する必要があります。このような分析では、3 つの次元でマージされた画像の可視化が不可欠です。明確にすべての 3 次元の DAPI 信号に関連付けられている魚スポットのみが分析に含まれます。
そのまま姉妹染色分け体の凝集度は腕と番の両方のプローブ (図 5 b、左) の 2 つの魚のスポットとして立証されます。いずれかのプローブの 3 つまたは 4 つの区切られた魚スポットを含む卵母細胞凝集欠陥 (図 5 b右) を持っていると見なされます。最低限個々 のスポットとして分類される、2 つの魚の信号を最小スポット径に対応する距離によってすべての 3 つの次元で区切る必要があります。魚の 2 つのスポットを接続する薄いかすかな糸は、珍しいことではないです。このような信号は完全に分かれているとは見なされません、結束性欠陥のインスタンスとしてカウントされません。
7B 6E 腕の交配のプローブ約 15-20% イメージ化卵母細胞の完全に欠いていた信号や信号は自信を持ってスコアには弱すぎます。さらに、約 5% イメージ卵子の展示びまん性の染色体信号の広域とこれらは分析から破棄されました。対照的に、卵母細胞の番交配信号がないか、またはあまりにもスコアにびまん性に遭遇する稀でした。
7B 6E 腕プローブは prometaphase アーム結束欠陥を定量化する広く使用されており、中期私逮捕のショウジョウバエの卵母細胞遺伝子型の異なる19。ときコヒーシン サブユニット SMC3 はねられた中期前期、含まれる分析成熟した卵子の 16.3% 中 2 アーム スポット、腕結束の早期喪失を示すものよりも大きかった。対照的に、わずか 5.1% SMC319の正常なレベルに含まれている卵の分離アーム スポットを見ました。興味深いことに、腕結束回数欠陥ノックダウン遺伝子型、姉妹染色分け体の番地域19に分かれていたのほとんどの上昇だった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig1.jpg"> 図 1: 逮捕拡張の前期の間に結束の年齢依存性損失女性減数分裂の染色体分配のエラーで、卵の異数性発生ことができます。結束は姉妹の間の黒いバーで表される染色分け体。腕結束組換え同族体を一緒に保持する機能し、後期で正確な分離に必要な私。腕の結束が途中で失われた染色体紡錘により異数性卵の結果、発生します。この図は参照19から適応されました。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56802/56802fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig2.jpg"> 図 2: BAC 断片化と増幅 (左) と 3 つの異なる BACs のため (右) 制限酵素消化後の DNA の分子のサイズ。400 増幅 DNA 産物の ng は、最初の 3 つの車線に表示されます。最後の 3 つの車線は、一晩の制限のダイジェストの後の DNA のフラグメントを表示します。増幅された DNA の製品範囲 200 bp 3 kb まで。制限のダイジェストが 100-200 bp からほとんどのフラグメント、フラグメントが大きい後 (最大 500 bp) が表示されていた。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56802/56802fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig3.jpg"> 図 3: 細胞診ツール。プロトコルで使用されるツール: 鉗子 (#5 ・ デュモン); (1) 組(2) 高純度タングステン針;(3) 深井皿カバー;(4) 浅いガラス皿; を解剖(5) 引っ張られたパスツール ピペット。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56802/56802fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig4.jpg"> 図 4。配置と卵の圧延のためのスライドの移動。(A)スライドの図は、プロトコルで説明されているように卵の圧延用を設定しました。暗い領域では、スライドの曇らされたガラスの部分を示します。#2 のスライドの動きベクトルの方向を圧延卵母細胞中(B) 。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56802/56802fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig5.jpg"> 図 5。魚はアッセイの結果です。(A) ショウジョウバエの X染色体および 2 つのプローブ (6 BACs) 腕し、プロトコルで説明されている 22 オリゴヌクレオチド pericentromeric プローブのハイブリダイズ概略図を示しています。便宜上、7B 6E 7B プローブのラベルは、2 階-3 C プローブは 3 c. というラベルの付いた(B)そのままアーム結合 (2 つの腕プローブ スポット、1 つの相同物) と中断腕結束 (3 ~ 4 腕プローブ スポット) の魚の結果 (7B 6E プローブ) の代表的なイメージ。DNA は青、腕プローブ信号は黄色、番プローブ信号は赤。画像は、デコンボリューションとコントラスト強化後 Z シリーズの最大強度突起に対応します。スケール バー = 2 μ m。この図は参照19から適応されました。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56802/56802fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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蛍光 In situ ハイブリダイゼーション FISH を使用した前中期および中期 I ショウジョウバエ卵母細胞のアーム凝集状態のモニタリング |発達 |生物学 |ビデオ

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase とを逮捕した中期ショウジョウバエ卵。このプロトコルは、減数分裂の腕の結合はそのままか、異なった遺伝子型の崩壊かどうかを決定するのに適しています。

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

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11.3K ビュー.  Dartmouth College. この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase とを逮捕した中期ショウジョウバエ卵。このプロトコルは、減数分裂の腕の結合はそのままか、異なった遺伝子型の崩壊かどうかを決定するのに適しています。

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

遺伝学

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

発生生物学

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

生物学

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

神経科学

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila melanogaster. Therefore, it is an excellent model to study heterochromatin formation and maintenance. Polytenized cells, such as the ones found in salivary glands of third instar D. melanogaster larvae, provide an excellent tool to observe the chromatin amplified nearly a thousand times and have allowed researchers to study changes in the distribution of heterochromatin in the nucleus. Although the observation of heterochromatin components can be carried out directly in polytene chromosome preparations, the localization of some proteins can be altered by the severity of the treatment. Therefore, the direct visualization of heterochromatin in cells complements this type of study. In this protocol, we describe the immunostaining techniques used for this tissue, the use of secondary fluorescent antibodies, and confocal microscopy to observe these heterochromatin aggregates with greater precision and detail.

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

This protocol aims to visualize heterochromatin aggregates in Drosophila polytene cells.

ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

要約

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この動画の章

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

ショウジョウバエ・ウーサイトにおける核移動

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる

ホールマウントRNAを蛍光

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

ショウジョウバエ唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

要約

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ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる

ホールマウントRNAを蛍光

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

ショウジョウバエ・ウーサイトにおける核移動

ショウジョウバエ唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色