このプロトコルの目的は、ショウジョウバエ細胞におけるヘテロクロマチン集合体を可視化することである。これを達成するために、我々は第三のインスター幼虫の唾液腺に見られるポリテン細胞を使用するこれらの細胞のゲノムはほぼ千回増幅され、染色体は界面細胞の特徴を保存する。彼らは明確に定義されたテロメアを持っており、すべてのセントロメレスが凝集するクロモセンターと呼ばれる橋があり、それは主にヘテロクロマティックです。
第3のインスター幼虫組織を用いて、異なる遺伝子変異体の背景における異血球性凝集体の変化を評価することもできる。第3のインスター幼虫培養を最適化するには、まず5〜10日の成人を収集し、標準メディアの広い首のボトルに50の周りを入れる必要があります。男性25名、女性25名。
ボトルを25°Cの温度インキュベーターに12時間置きます。インキュベーション時間が経過したら、成人を取り除き、新しいボトルに移して手順を繰り返します。胚を摂氏18度で22時間成長させてください。
幼虫の収集のために、あなたはあからさまな球形を持っていない放浪幼虫を、選択することを確認してください。15組の唾液腺を解剖するか、顕微鏡下で抗議阻害剤を持つ冷たいPBSで30分の期間にできるだけ多くを解剖する。唾液腺を氷冷PBSで別のチューブに移します。
冷たいPBSプラス抗議阻害剤で一度洗います。覚えておいてください、常に組織がチューブの底に達するのを待ちます。最後のステップからPBSを取り除いた後、1つのX群ガム固定バッファーと50%メタノール+2%ホルムアルデヒドを直接0.5ミリリットル加えます。
穏やかな回転で摂氏4度で2時間インキュベートする。トリストリトンバッファーで5分間の回転洗浄を1回行い、1ミリリットルを加えます。常に組織がチューブの底に到達するのを待ちます.
注:組織がチューブの底に到達するのを待ちます。上記と同じトリストリトンに加えて、軽度の揺れで摂氏37度で2時間、唾液腺をインキュベートします。BO3バッファーで洗浄し、15分間軽度の揺れで37°CでBO3プラス10ミリモルDTTでインキュベートします。
インキュベーション期間の終わりに、1ミリリットルのBO3バッファー単独で洗浄を行う。唾液腺を1ミリリットルの緩衝Bで室温で2時間回転してインキュベートする。すべてのバッファーBを取り外し、目的のバッファーAプラス抗体を追加します。
この場合、私たちはイリジウム銀行からHP 1、A C 1 8 9を使用します。回転で4度で一晩で3,000で1。この時点で、揺れが気泡を発生しないことが重要であり、抗体に損傷を与える可能性があります。
バッファーBで15分の洗剤を与え、室温で攪拌するごとに1ミリメートルを使用します。腺は、二次抗生物質カップルと一緒にバッファBに移され、4度の回転下で2時間参照する。このステップでは、二次抗体を光から保護するために、チューブをアルミ製の箔で覆うことが重要です。
室温で2x15分のワッシャーを行い、シドックスやOHなどのDNAマーカーを用いて1ミリリットルのバッファーB.Incubateで回転させ、室温で1ミリリットルのバッファーBに1ミリリットルに溶解し、回転させます。バッファーBで1回洗浄し、PBSで1回、室温で回転しながら10分間洗浄します。最後に、唾液腺をスライドに取り付け、カバースリップ付きのプールを作ります。
唾液腺をプールの真ん中に入れ、シディブラーで覆います。気泡の変形を避けるために、粘性液体をあちこちに伸ばす。その後、すべてのスライドを透明なマニキュアで密封します。
蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で観察します。同じ日にサンプルが観測されない場合は、光から4度で保存します。ショウジョウバエ唾液腺におけるHB1単染色の代表的な結果は、図1に示されている。
肯定的な結果は、A、アテロ色集または凝縮物のような1つの焦点点を観察することです。負の結果は信号または分散信号ではありません。Cでは二重点のように二重信号が観測されることもありますが、通常は少量で発生します。
それらが棒グラフとして表すことができるデータを分析するために、異なる変異背景を持つHP1の分布を比較する。例えば、図2では、98%の核が1点の分布を示していることがわかります。そして、野生型の2つの病巣の2%。
変異体において、割合が変化し、かつ2つの病巣の存在が40%に増加した図3は、単染色における代表的なトリメチル化リジン9H3を示す。ショウジョウバエ唾液腺がBの1つの焦点を観察する結果、それは色凝集体または凝縮物で有利な結果であり、Cの二重または三重の信号はまれに見られるが、少量である。このプロトコルの最後に、状態制限にもかかわらずHP1タンパク質のジアクロマチック凝縮物を見ることができるでしょう、それは良い最初のアプローチになるでしょう。
