インビボ マウス顎下腺における血管透過性検出

本プロトコルは、マウス顎下腺におけるタイトな内皮接合部の機能を評価するためのin vivo傍細胞透過性検出尺度を記載する。それにもかかわらず、2つの光子レーザー走査顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡の利点があるだけでなく、より深い組織や画像をより明確に検出するためにも使用できます。この実験は、異なる組織、特に動物の表面組織および器官の血管透過性を評価するための良好な方法尺度を提供する。

まず、透過性アッセイ用の蛍光シグナル間の干渉を最小限に抑えるために、フルオレセイン、イソチオシアネート、標識デキストラン、ローダミンB(明確な励起発光スペクトルで標識されたデキストラン)などの適切なトレーサーを選択します。微量を滅菌リン酸緩衝生理食塩水に希釈して1ミリリットルあたり100ミリグラムのストックにし、摂氏マイナス20度の光から保護されたアリコートを保管します。8〜10週齢の雄野生型マウスに麻酔をかけた後、マウスの頭頸部をそっと持ち、眼球の片側をわずかに突き出させる。

100マイクロリットルの蛍光トレーサー溶液混合物を含むインスリン注射器を、目の角に沿って目に対して直角に挿入します。注射後、マウスを四肢と頭をテープで留めた状態で仰臥位で段ボールにすばやく置きます。顎下腺またはSMGの分離の場合、実体顕微鏡下で、一般的な組織ハサミで首の表皮を切断して、SMGの両側を露出させます。

次に、鈍い組織分離針を使用して、腺組織、血管、および腺構造に損傷を与えることなく、カプセルを腺表面から穏やかに分離します。カスタマイズしたホルダーを負圧装置に接続し、負圧効果が適切に達成されているかどうかを事前に確認してください。露出したSMGをカスタマイズしたホルダーにそっと置き、マウスの体からできるだけ離して負圧吸引によって組織を吸い上げて、呼吸やその他の状態によって引き起こされるモーションアーチファクトを減らします。

腺の部位が選択された直後にイメージングを開始します。Z軸に沿って、腺の表面から最大70〜140ミクロン離れた組織にステップインした連続画像を取得して、3次元構造を生成します。次に、血管のタイムラプス画像を取得し、SMGにおける血管透過性を測定する。

[エクスプローラ]ダイアログボックスで、[新しいフォルダの追加]をクリックし、ファイル名を変更します。次に、取得列に戻ります。XYでは、フォーマットは512 x 512で、速度は400ヘルツです。

双方向X"をオンにし、ズーム倍率を0.75に設定し、ズームを1.5に設定します。次に、取得モードでXYTを選択して、タイムラプス画像を取得します。実験の必要性に応じて、持続時間を20秒、30分以上に設定します。

条件を設定したら、をクリックしますライブ「写真形成フレーム内の2つのチャネルと重なり合うチャネルの血管イメージングを観察し、関心のある領域を選択します。クリック開始"イメージングを開始します。インビボ血管透過性アッセイ、およびマウスにおける血管の3次元画像。

顎下腺がここに示されています。対照群では、両方のトレーサーがSMGの血管に存在していた。FD4は分子量が小さいため、血管から腺房や管の基底側に漏れ出し、腺房や管の形状をはっきりと描くことができました。

RD70は、大きな血管と微小血管に分布していました。ダクト結紮群ではFD4とRD70の両方が腺房の基底側に溢出しており、ダクト結紮が内皮バリア機能を破壊し、高分子への透過性を高める可能性があることが示されました。また、半定量的なFD4およびRD70蛍光強度の結果から、これらの観察結果が確認された。

3次元画像は、対照群と比較して、結紮群の血管周辺のFD4およびRD70のはるかに不明瞭な蛍光を示した。慎重なSMGの分離と適切な配置と顕微鏡は、検出を成功させるための不可欠な前提条件です。手順に従って、赤血球の動きを結婚させることによって血流速度を計算することができ、蛍光標識された血球の浸潤を追跡することができます。