フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価

この方法は、状態が腸バリアの完全性を変更するかどうか、または潜在的な治療法が腸バリアの完全性を維持できるかどうかについての質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vivoでの腸透過性を評価および定量するための非侵襲的で低負担の技術を提供することです。まず、マウスを4時間絶食させ、次に38ミリメートル22ゲージの滅菌湾曲経管栄養針を使用して、200マイクロリットルのFITCデキストラン懸濁液を経口経管栄養で各マウスに投与します。

最初の経管投与後にタイマーを開始し、各経管栄養の間に5〜10分待って、経管投与後1時間を維持しながらin vivo測定を可能にします。残りのFITCデキストラン懸濁液を標準曲線に保ちます。スタートボタンを押したままにしてマシンとソフトウェアを起動し、システムをウォームアップさせます。

[デバイスの状態]をクリックし、続行する前に、構成されているすべてのデバイスが[OK]と表示されていることを確認してください。次に、新しいスタディをクリックし、目的の名前でファイルを保存します。次に、学習オプションをクリックします。

試料IDを入力し、正しいレーザーを選択して実験します。次に、電気シェーバーを使用して腹部から毛皮を取り除き、乾燥を防ぐために獣医用軟膏を目にたっぷりと塗ります。イメージングチャンバーを開き、動物をスキャンプレートの上に背側に置きます。

次に、手足と尾をテープで固定します。次に、描画ツールを使用してスキャンする領域を選択します。肝臓のすぐ上から直腸までの腹部の全幅を含めるようにしてください。

次に、[変更]ツールをクリックして、描画した領域を調整します。スキャン解像度を2.0ミリメートルに設定し、[開始]をクリックしてスキャンを開始します。次に、選択したファイル名で画像ファイルを見つけて開き、同期された設定ですべてのファイルを同時に開きます。

画像設定ツールバーを使用して、[画像の同期] ボタンと [スケールの同期] ボタンを使用して画像設定を同期し、正確な比較を行います。次に、調整されたスケールで画像を保存します。画像化システムに関連するソフトウェアを使用して、均一にスケーリングされた画像上の各動物および対照マウスの腹部蛍光を比較する。

経管投与の4時間後に滅菌チューブに各マウスから糞便ペレットを採取する。次に、チューブを氷の上に置き、暗所に置きます。次に、血液サンプルを9, 390 x gで室温で10分間遠心分離します。

次に、血漿を新しい滅菌チューブに移し、暗闇の中で氷の上に置いておきます。50ミリグラムの糞便サンプルを200マイクロリットルのPBSで希釈し、血漿をPBSで1対2の比率で希釈します。100マイクロリットルのサンプルと標準物質を不透明な黒色の96ウェルプレートにプレートします。

蛍光プレートリーダーで、485ナノメートルで励起し、530ナノメートルで吸収する蛍光を読み取ります。最後に、蛍光を標準曲線の既知の濃度と比較することにより、サンプルあたりのFITCデキストランの濃度を決定します。in vivo蛍光の分析は、対照食のみを投与されたマウスは、イヌリン補充食を摂取したマウスと比較して、FITCデキストランの肝摂取量が多く、腹腔内の残留蛍光レベルが高いことを示しました。

イヌリン補充食を投与されたマウスは、対照食のみを投与されたマウスと比較して、血漿中のFITCデキストランのレベルが有意に低かった。一致して、イヌリン食を摂取したマウスは、対照食のみを摂取したマウスよりも糞便中のFITCデキストランのレベルが有意に高かった。対照マウスの糞便中のFITC−デキストランのレベルが低いことは、適切に排泄されるのではなく、腸の障壁を通って循環に浸透したことを示している。

血漿中の高レベルのFITCデキストランは、この発見を補強しました。この手順を実行するときは、タイミングが不可欠です。蛍光の読み取りとサンプルの収集は、個々のマウスの経管投与後1時間および4時間にできるだけ近づけて行う必要があります。