Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
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この研究が、ノバルティス財団医療 - と (ピム) 生物学研究、ゴットフリートとジュリア ・ バンガーター ・ Rhyner 財団 (MW、ピムと) と (ピム) にフリブール大学の研究プールによって財政上支えられる部分で。追加の助成金 (KAB SM し) 外国の学者のスイス政府優秀奨学金があります。テクニカル サポート、イザベルの Fellay と Solange Kharoubi ヘスに感謝します。

人間の赤血球は、Swissethics (swissethics.ch) のガイドラインに従って、健康なドナーの血液から得られました。
注:マラリア寄生虫文化 (3 7) や EV 生産以前に記載された Mbagwu、ら。11 マラリアは人間の病原体、取り扱いの地域の規制にご相談ください。文化べき滅菌全体の時間。
1 EVs の蛍光標識
注: 次の手順は、EV 膜の脂質領域で大きな脂肪族尾安定緑色蛍光色素 (PKH67) を組み込むラベリング技術の利点をかかります。200 μ L の最終 PKH67 の 20 μ M の最終的な集中を含むボリュームを染色で反応を行います。周囲温度 (20-25 ° C) ですべての手順を実行します
<ol><li>微量遠心チューブに 1 mL の PBS で EVs の場所 100 μ。</li>
	<li>ペレットに最大速度 (20,000 x g) 7 分で微量遠心チューブ内の EVs を遠心します。 注: とくにヘモゾインが EVs に存在するので赤暗い茶色ペレットを観察すべき。服従上清は赤みを帯びた、EVs が分離します。</li>
	<li>遠心分離の後に、任意の EVs を削除を避けるために、慎重に、上清を吸引しています。 注: は、再現性と染色の効率を高めるために希釈 C で EVs を再前にバッファーの残りの量を最小化します。</li>
	<li>希釈 C の 100 μ L で EV ペレットを再懸濁します (EV 停止 X 2) と完全な分散を保証するためにゆっくりピペットで移しなさい。</li>
	<li>新しい遠心チューブを準備し、PKH67 エタノール色素溶液の 4 μ L を希釈 C. 渦もミックスの 100 μ L に追加します。汚れる前にすぐにこの 2 x 色素溶液 (40 μ M) を準備します。 注: 異種染色避けるために、EV のペレットに直接に PKH67 エタノール色素溶液を追加しないでください。</li>
	<li>急速に、染料の解決 (手順 1.5) × 2 の 100 μ L で EV 懸濁液 (手順 1.4) X 2 の 100 μ L を結合します。その後、上下に 10 回ピペッティングによるサンプルをミックスします。</li>
	<li>5 分孵化の間に 3-4 回ボルテックスによって光とミックスから保護から 5 分ステップ 1.6 EV/色素サスペンションを孵化させなさい。 注: EV/染料懸濁液をインキュベート時間が長くなるメリットもありません、染色が速いので。</li>
	<li>血清の等しいボリューム (200 μ L) を追加することによって染色反応を停止し、余分な染料のバインドを許可する 1 分間インキュベートします。 注: 染色を停止する前に、20 分 20,000 × g で遠心分離による EVs から血清を使い果たします。</li>
	<li>PBS 洗浄 3 回、20,000 x g で 5 分間でスピンダウンの最終濃度 1 μ g/μ L に到達する PBS 100 μ L に EVs を再懸濁します。</li>
</ol>2. 共焦点顕微鏡を用いた電気自動車の吸収を可視化します。
注: 次のプロトコルでは、EV ガラス coverslips 上に成長した内皮細胞によって内面の追跡について説明します。血管内皮細胞は、12に記載されている半不死化ひと骨髄内皮細胞です。
<ol><li>無菌環境での作業、0.01% ポリ-L-リジン (RT) 室温で 10 分間を超えると coverslips をコートします。</li>
	<li>ポリ L リジン ソリューションを吸引し、完全に乾燥する coverslips を許可します。</li>
	<li>トリパン ブルー色素排除と診断を使用して実行可能な内皮細胞数を実行します。</li>
	<li>1 x 105 1 mL の完全培の内皮細胞成長ポリ L リジン コーティング coverslips にサプリメントのミックスを含むし、単分子層に成長する細胞の内皮細胞を転送します。 メモ: メディアに含まれる成長因子細胞単層を形成し、タイトな接合を形成することができます。</li>
	<li>セルは、単層を形成、一度慎重に培地を吸引し、セルを洗浄して新鮮培地 1 mL を追加します。洗濯物をもう一度繰り返します。PKH67 ラベル EVs の 50 μ g を追加し、4 時間インキュベートします。 注: 吸収の時間の最適なポイントを見つけるには、時間コースを実行することができます。</li>
	<li>4 時間後、培地を吸引し、洗浄 3 回過剰および非連結の EVs を削除する PBS のセル。PBS で 3% パラホルムアルデヒド溶液中 15 分間とセルを修正します。 注: メタノール固定プロセス中にアクチンを破壊できます。したがって、定着剤または他の溶剤系の定着剤を含む任意のメタノールを回避することをお勧めします。定着剤としてメタノール無料ホルムアルデヒドを使用することをお勧めします。</li>
	<li>PBS で 3 回洗浄を行う。慎重に 250 μ l 添加 0.1% のセルを permeabilize PBS でトリトン X-100。室温で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>3 回を PBS で洗浄します。非特異的結合をブロックする RT で 30 分のブロック バッファー (PBS で 5 %bsa) の 400 μ L を追加します。</li>
	<li>PBS で 1 回洗浄を行う。各カバー スリップあたり 200 μ L PBS/1% BSA にファロイジン原液の 5 μ L に希釈して染色液を準備します。ピペット 200 μ L、coverslip の染色液のルートで 20 分間インキュベートし、</li>
	<li>3 回を PBS で洗浄します。30 の DNA を counterstain 最終濃度 200 μ L の PBS で 2 μ G/ml ヘキスト 33342 で s。</li>
	<li>400 μ L の PBS を追加することによって、coverslip x 2 を洗います。慎重に、coverslip 鉗子でつかんで滴スライド ガラスにメディアをマウント antifade の上に反転します。優しくティッシュで余分なメディアを削除して各側は爪のポーランド語のシールします。</li>
	<li>4 ° C で光から保護されたスライドを保存します。</li>
	<li>レーザー励起 543、488、405 nm と 63 X 450-470 nm (青色)、505 530 nm (緑)、620 で蛍光排出量 1.3 NA 石油目的で共焦点顕微鏡を使って細胞を可視化する nm。 注: 典型的な F アクチン染色結果は図 1のとおりです。</li>
</ol>3. 血管内皮細胞の透過性
注: 内皮細胞の透過性は、単層の内皮細胞にローダミン B イソチオ シアン酸デキストラン (平均 MW 70,000) の転送を測定することによって評価されます。デキストランは、血管透過性を研究するための優れたツールを提供します。
<ol><li>0.4% トリパン ブルー色素排除と診断を使用して実行可能な血管内皮細胞を数えます。</li>
	<li>24 ウェル培養挿入 (0.4 μ m 孔サイズ) や差別化された単分子膜を形成するため、少なくとも 5 日間妨げられていないままに合流点 105セル × 0.6 の密度で内皮細胞をプレートします。媒体ごとの 2 日目を更新します。</li>
	<li>細胞が単層に達すれば、EVs を読み込む (1 mL に 50 μ g) 上部室に。ローダミン デキストランを最終濃度 20 mg/mL でトップの井戸に追加します。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
	<li>40 μ L 中因数からの蛍光発光を測定することによっても下に蛍光のデキストランの転送を監視します。544 nm 励起と測定について 590 nm 発光マルチラベル プレート リーダーを設定します。 注: 拡散デキストランの量が原液と確立の較正曲線を用いて定量化することができます。さらに、運動の実験は、時間コース (図 2) の間に外側室内の中の小さなサンプルを削除することによって実行できます。どんな治療がなくて、デキストランに細胞膜を通して拡散します。</li>
</ol>4. ピューロマイシン感度を決定します。
注: レンチ ウイルスと細胞を伝達する前にそれはその特定のセル行の選択した薬の殺す曲線を決定することが重要。すべてのセルを殺すために必要な薬物濃度の最小量を決定する、選択した薬の増分の用量を用いた線量応答実験を実行します。各哺乳類セルライン、実験する前に、別の感受性を持っているので抗生物質の最適濃度を決定して下記のとおり殺すカーブ滴定法を開発してください。
<ol><li>検定を使用してセルをカウントします。サプリメントのミックスを含んでいる完全な内皮細胞成長媒体で 1 × 105細胞/ml の濃度で内皮細胞を再懸濁します。</li>
	<li>内皮細胞成長培地を 100 μ l 添加の最終巻の 96 ウェル プレートにプレート 1 x 10 の4セルです。</li>
	<li>0.1 10 μ G/ml の濃度に抗生物質を添加した培地を 100 μ l 添加 (図 3参照)。</li>
	<li>20 × 対物を使用して顕微鏡下で 2 日ごと細胞生存率を調べる。10-14 日の培養し、細胞増殖によって 2-3 日毎ピューロマイシンを含むメディアを交換します。</li>
	<li>各ウェル、ミックスに 10 μ L/ウェル MTS 試薬を追加し、標準培養条件で 37 ° C で 4 時間インキュベートします。</li>
	<li>シェーカーで簡単にプレートを振るし、490 プレート リーダーを用いた処理と未処理のセルの吸光度を測定 nm (図 3)。</li>
</ol>5. 血管内皮細胞のレンチウイルスベクターの伝達
<ol><li>プレート 1 × 105 1 mL の完全培地における内皮細胞伝達の前日。セルが 50-80% の confluency に達したときは、情報伝達を実行します。</li>
	<li>氷の上のレンチ ウイルスを解凍し、凍結融解サイクルを避けるためにウイルス株の因数を作る。30 の 200 x g で材料をスピン上流出を避けるために開く前に管内の s。</li>
	<li>最終 8 μ G/ml の濃度で細胞に hexadimethrine ブロマイドを追加します。 しかし、いくつかのケースでは、セルのために有毒がある場合があります注: Hexadimethrine 臭化伝達効率ができます。したがって、最適な濃度は、伝達の前に殺害の曲線を実行することによって決定する必要があります。</li>
	<li>ミックスに軽くプレートを旋回します。感染症 (MOI) の適切な多様性でウイルス粒子 (0.5-2 x 106粒子) の間の適切な量を追加し、軽く 30 の板を渦巻きを混在させる s。</li>
	<li>RT で伝達効率を高めるための 300 x g で 45 分間の遠心でミックスを細胞ウイルスの粒子を遠心します。37 ° C で細胞ウイルスの粒子の混合物を一晩インキュベートします。</li>
	<li>削除ウイルス粒子含有培地では慎重に、適切に廃棄します。新鮮な予め温めておいた完全な培養液中に置き換えます。</li>
	<li>2 日目は、ピューロマイシンを選択を開始: メディアを取り出して、ピューロマイシン セクション 4 (図 3) で定める以前の正しい濃度を含む新鮮な培地に交換します。</li>
	<li>ピューロマイシンを選択後細胞を収穫し、製造元の指示に従ってキットを分離する RNA を使用して RNA を分離します。</li>
	<li>選択した cDNA 合成を行う逆のトランスクリプションを用いた Mirna キット (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>引用プロトコル13によると qPCR 反応を設定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia.">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria.">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727 (2016).</li><li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria.">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li><li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. 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著者が明らかに何もありません。

トキソ プラズマ、トリパノソーマ、リーシュ マニア、トリコモナスを含むいくつかの寄生虫が感染させた宿主細胞によって電気自動車のリリースをトリガーします。、病原体によってリリースされた EVs は宿主の免疫応答を調節したり寄生虫6間の携帯電話の通信を仲介します。まだ、これらの小胞がマラリア病に貢献する方法を示唆する少し証拠があります。ここでは、<e...

世界保健機関によると 2015 年に世界的なマラリアの 2 億 1200 万の新しいケースもあったし、約 429,000 人が死亡、子供 5 歳未満年齢1の主に。血管機能障害と関連付けられる多くの場合、深刻な病気につながるメカニズムには、不明確な2が残っています。マラリア原虫感染は分泌細胞小胞 (Ev) として知られている小さい bi 脂質膜球です。知られているこれらの EVs が潜在的に関連する宿主の免疫応答、感染プロセスに感染。しかし、ほとんどはマラリア感染症3の間にこれらの小胞の正確な機能について知られています。彼らは 2 つの重要な役割を果たすことが可能です: 1 つの手を貢献するかもしれない病因活性化マクロファージ4,の5;その一方で、寄生虫および寄生虫とホスト6,7間通信調停をする可能性があります。実際には、寄生虫は、EVs を介してお互いの間蛋白質または核酸を転送できます。たとえば、トリパノソーマrhodesiense EVs 毒性因子 Serum Resistance-Associated (SRA) を転送することができます、他t. グリコシルホスファチジルイノシトールとホストの両方の赤血球8をターゲットすることができます。さらに、マラリア感染は、EVs 内で核酸を転送することによってお互いの間通信します。これにより最適化し、その成長を同期する寄生虫です。実際には、EVs がガメトサイト変換の主要なレギュレータをしてしたがって、伝送ステージ7の規則に貢献。
だけでなく、EVs は寄生虫を規制する、彼らはまた寄生虫ホストの相互作用を仲介します。最近、内側から Ev を含む宿主由来の Microrna (Mirna; 21-25 のヌクレオチド9の範囲で小さな RNA 種) ひと内皮細胞によってとられたことを発見しました。EVs の miRNAs 形成 Ago2 と複雑な安定 (メンバーによる RNA サイレンシングの複雑な)、受信者のセルに届けた後は特にサイレンシング遺伝子発現、細胞10のバリヤ特性に影響を与えることができます。標準的なプロトコルは、EVs の機能を調査するために開発されています。ここでは、我々 はまず受信者細胞による吸収を調査する EVs の蛍光ラベリングを可能にするプロトコルをについて説明します。さらに、共焦点の顕微鏡を使用して、セル内の EV の運命を追跡することが可能です。いくつかの蛍光染料は、EVs を追跡する使用ことができます。アミン反応性色素、5-(and-6) Carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) と小胞内カルセイン AM になる蛍光を一度。明るくより均一な信号を与えるので PKH、両親媒性ラベルを使うことが望ましい。このアプローチは、EVs と受信者の細胞間の相互作用を理解するための重要な情報を提供します。一方、いくつかのケースで EVs は細胞の表面に結合、いくつかの小胞急速にとられる。取り込み時に EVs は、出す規制機能の細胞に彼らの貨物を提供します。
ここでは、細胞膜を通して蛍光デキストランの転送を定量化することで培養内皮細胞のバリア機能を測定するためのプロトコルについて述べる。敏感なトレーサーは放射性標識マーカーなど使用できます。ただし、使用するため特別な安全上の注意が必要です。他のアッセイは、内皮下電気抵抗 (TEER) タイト結合の整合性を測定するなどの in vitroバリア機能を測定する存在します。最終的に蛍光抗体法で ZO-1、タイト結合蛋白を可視化によりよく10としてタイト結合の整合性の評価ができます。EVs は規制の潜在的な特性を持ついくつかの貨物を含む複雑な異種のエンティティであるので、レシピエントの細胞への影響を研究する特定の RNA をノザンに便利です。したがって、利息10の miRNA を表現する安定したセルラインを生成することを目的とするプロトコルを定義するもできます。

<table><tbody><tr><td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&amp;ndash;Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insert with PET membrane transparent Falcon&amp;nbsp;for plate 24 wells</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth&amp;nbsp;Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>hsa-mir-451a&amp;nbsp;RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

マラリアは、原虫によって引き起こされる生命にかかわる病気、マラリア最もアフリカ大陸で流行しているとほとんどマラリア関連の死の責任世界的に。マラリアに感染した人々 の病気の進化に影響を与える組織、血管不全、および炎症性応答の寄生虫隔離を含むいくつかの要因。マラリアの感染赤血球 (内側) リリース小さな細胞小胞 (Ev) 寄生虫とホスト間の病態と細胞のコミュニケーションを仲介する貨物分子の種類を含みます。EVs は効率的に彼らが彼らの機能を調節する細胞によってとられます。ここで寄生虫ホストの相互作用における Ev の役割に対処するための戦略を議論します。まず、緑細胞リンカー染料を使用してラベリングおよび血管内皮細胞による EV 内面を追跡するために簡単なメソッドを説明します。第二に、蛍光に分類されたデキストランを使用して血管内皮細胞単層膜の透磁率を測定する簡単な方法を報告する.最後に、内皮細胞の機能に小さな非コード RNA 分子の役割を調査する方法を示します。

ここでは、EVs の宿主細胞との相互作用を調査するプロトコルについて述べる.蛍光に分類された EVs の取り込みは、共焦点顕微鏡 (図 1) によって監視されます。取り込みを追跡する EVs とインキュベーション時間を最適化できますが、内皮細胞は効率的に、EVs を取る。細胞内の EVs のより良いローカライズのファロイジンをアクチンを染色します?...

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

この作品は、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によるリリース細胞小胞 (Ev) の役割を調査するプロトコルについて述べる.特に、我々 は EVs 血管内皮細胞との相互作用に焦点を当てます。

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K ビュー.  University of Fribourg. この作品は、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によるリリース細胞小胞 (Ev) の役割を調査するプロトコルについて述べる.特に、我々 は EVs 血管内皮細胞との相互作用に焦点を当てます。

ビデオ: Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

免疫・感染学

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

医学

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

要約

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脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流の定量的解析

不定冠詞

脳から隔離された白血球の単離と解析

高収率の精製

フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

アン

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯熱マラリア原虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

要約

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脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

不定冠詞

脳から隔離された白血球の単離と解析

高収率の精製

フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

アン

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流の定量的解析

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯熱マラリア原虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定