Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection at JoVE.com

Diese Studie wurde von der Novartis-Stiftung für medizinische und biologische Forschung (um PYM), der Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (für MW und PYM) und den Forschungspool der Universität Freiburg (um PYM) teilweise finanziell unterstützt. Weitere Beihilfen gehören die Schweizer Regierung Excellence Scholarships für ausländische Wissenschaftler (zur KAB und SM). Wir danken Isabelle Fellay und Solange Kharoubi Hess für technischen Support.

Menschlichen Erythrozyten stammen aus dem Blut von gesunden Spendern, gemäß den Richtlinien des AGEK (swissethics.ch).
Hinweis: P. Falciparum Parasit Kulturen (3 7) und EV Produktion waren zuvor beschrieben in Mbagwu, Et Al. 11 da p. Falciparum ein menschlicher Erreger handelt, wenden Sie sich an die örtlichen Vorschriften Handhabung. Die Kulturen aufbewahrt werden sterile die gesamte Zeit.
(1) Fluoreszenz Kennzeichnung des EFD
Hinweis: Das folgende Verfahren nutzt die Kennzeichnung Technologie, einen grünen Fluoreszenzfarbstoff (PKH67) stabil zu integrieren mit großen aliphatischen Schwänzen in der Lipid-Region der EV-Membran. Die Reaktion erfolgt in einem 200 µL letzte Band mit einer Endkonzentration von 20 µM von PKH67 Färbung. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur (20-25 ° C)
<ol><li>Platz 100 µg des EFD in 1 mL PBS in einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Zentrifugieren der EVs in einem Microcentrifuge Schlauch mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 x g) für 7 min zu Pellets. Hinweis: Da im Rahmen des EFD Hemozoin vorliegt, ist ein rot-dunkel bräunlicher Pellet hinzuweisen. Wenn der Überstand rötlich ist, haben die EVs lysiert.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach Zentrifugation überstand sorgfältig, um zu vermeiden, entfernen EVs. Hinweis: Minimieren Sie die Menge der verbleibenden Puffer vorhanden ist, bevor resuspending EVs im Verdünnungsmittel C um Reproduzierbarkeit und Effizienz der Färbung zu erhöhen.</li>
	<li>Aufschwemmen EV Pellet in 100 µL Verdünnungsmittel C (2 X EV Suspension) und sanft pipettieren, komplette Dispersion zu versichern.</li>
	<li>Bereiten Sie einen neuen Microcentrifuge Schlauch und 100 µL des Verdünnungsmittels C. Vortex gut mischen fügen Sie 4 µL der PKH67 ethanolische Farbstofflösung hinzu. Bereiten Sie diese 2 X Farbstofflösung (40 µM) unmittelbar vor der Färbung. Hinweis: Um zu vermeiden, heterogene Färbung, fügen Sie die PKH67 ethanolische Farbstofflösung direkt zum EV Pellet.</li>
	<li>Kombinieren Sie schnell, die 100 µL 2 X EV Suspension (Schritt 1.4) mit 100 µL 2 X Farbstofflösung (Schritt 1.5). Dann mischen Sie die Probe durch Pipettieren nach oben und unten 10 Mal.</li>
	<li>Inkubieren Sie die EV/Farbstoff Suspension aus Schritt 1.6 für 5 min geschützt vor Licht und Mischung von vortexen 3-4 Mal während der Inkubation 5 min. Hinweis: Inkubation der EV/Farbstoff Suspension für längere Zeiten bietet keinen Vorteil, denn die Färbung so schnell.</li>
	<li>Stoppen Sie die Färbung Reaktion durch Zugabe von ein gleiches Volumen (200 µL) des Serums zu und inkubieren Sie für 1 min zur Bindung von überschüssigen Farbstoff zu ermöglichen. Hinweis: Vor dem Anhalten der Färbung, zum Abbau des Serums von EVs durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 20 min.</li>
	<li>3 Mal mit PBS waschen und Spin-down bei 20.000 x g für 5 min. Aufschwemmen der EVs in 100 µL PBS, eine Endkonzentration von 1 µg/µL zu erreichen.</li>
</ol>2. visualisieren Sie Aufnahme des EFD konfokalen Mikroskopie
Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Verfolgung von EV Internalisierung von Endothelzellen auf Glasdeckgläser angebaut. Die Endothelzellen sind semi-verewigt menschlichen Knochenmark Endothelial Zellen wie in12beschrieben.
<ol><li>Arbeiten in einer sterilen Umgebung, Mantel Deckgläsern mit einem Überschuss von 0,01 % Poly-L-Lysin für 10 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Aspirieren Sie die Poly-L-Lysin-Lösung und lassen Sie Deckgläsern vollständig trocknen.</li>
	<li>Führen Sie eine tragfähige Endothelzellen Zählung verwenden Trypan blau Ausgrenzung und eine Hemocytometer.</li>
	<li>1 x 105 Endothelzellen in 1 mL der komplette Endothelial Zelle Wachstumsmedium, enthält die Ergänzung-Mischung, um die Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläsern und lassen die Zellen wachsen zu einem monomolekularen Film zu übertragen. Hinweis: Das Medium enthält Wachstumsfaktoren, die Zellen zu einem monomolekularen Film bilden und tight Junctions bilden können.</li>
	<li>Sobald die Zellen einer monomolekularen Film bilden, sorgfältig aspirieren Sie das Medium und 1 mL frisches Medium, die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie noch einmal waschen. Fügen Sie 50 µg des EFD PKH67 beschriftet und 4 h inkubieren. Hinweis: Um den optimalen Zeitpunkt für die Aufnahme zu finden, kann ein zeitlichen Verlauf erfolgen.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach 4 h das Medium, und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS, Exzess und ungebundenen EVs zu entfernen. Befestigen Sie die Zellen mit 3 % Paraformaldehyd Lösung mit PBS-Puffer für 15 Minuten. Hinweis: Methanol kann bei der Fixierung Aktin stören; Daher empfiehlt es sich, jede Methanol, Fixiermittel oder andere Lösungsmittel Fixiermittel enthalten zu vermeiden. Es empfiehlt sich, frei von Methanol Formaldehyd als Fixiermittel verwenden.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS. Fügen Sie sorgfältig 250 µL von 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer für die Zellen permeabilize. 5 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal mit PBS. Fügen Sie 400 µL blocking-Puffer (5 % BSA mit PBS-Puffer) für 30 min bei RT, unspezifischen Bindung zu blockieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Bereiten Sie die Färbelösung durch Verdünnung 5 µL der Phalloidin Vorratslösung in 200 µL PBS/1% BSA pro jedes Deckglas. Pipettieren 200 µL der Färbelösung auf das Deckglas und 20 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal mit PBS. Counterstain die DNA für 30 s mit Hoechst 33342 auf eine Endkonzentration von 2 µg/mL in 200 µL PBS.</li>
	<li>Waschen Sie 2 x das Deckglas durch Zugabe von 400 µL PBS. Vorsichtig das Deckglas mit Zange greifen und auf der Oberseite einen Tropfen Antifade Montage Medien auf einen Objektträger zu invertieren. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Medien mit einem Tuch und versiegeln Sie jede Seite mit Nagellack.</li>
	<li>Lagern Sie die Folien bei 4 ° c lichtgeschützt</li>
	<li>Visualisieren Sie die Zellen mit einem confocal Mikroskop am Laser Erregungen 405, 488 und 543 nm und einer 63 X 1,3 NA Öl Ziel mit fluoreszierenden Emissionen bei 450-470 nm (blau), 505-530 nm (grün) und 620 nm. Hinweis: Typische F-Aktin Färbung Ergebnisse sind in Abbildung 1gezeigt.</li>
</ol>(3) Endothelzellen Durchlässigkeit
Hinweis: Endothelzellen Durchlässigkeit wird durch die Messung der Übertragung von Rhodamin B erfolgt-Dextran (durchschnittliche MW 70.000) über die Endothelzellen Monolage beurteilt. Dextran bietet ein ausgezeichnetes Werkzeug zur vaskulären Permeabilität zu studieren.
<ol><li>Graf tragfähige Endothelzellen mit 0,4 % Trypan blau Ausgrenzung und eine Hemocytometer.</li>
	<li>Platte die Endothelzellen bei einer Dichte von 0,6 x 105 Zellen bis Mündung in 24-Well-Zellkultur-Einsätze (0,4 µm Porengröße) und lassen Sie ungestört für mindestens 5 Tage, differenzierte Monolagen zu bilden. Aktualisieren Sie das Medium jeden zweiten Tag.</li>
	<li>Sobald die Zellen einer Monoschicht erreichen, laden die EVs (50 µg in 1 mL) auf die obere Kammer. Fügen Sie die Rhodamin-Dextran zum oberen Brunnen in einer Endkonzentration von 20 mg/mL. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Überwachen Sie die Übertragung von fluoreszierenden Dextran nach unten gut durch Messung der Fluoreszenzemission von 40 µL Medium Aliquote. Richten Sie den Multilabel Mikrotestplatte Leser auf 544 nm Anregung und 590 nm Emission für Messungen. Hinweis: Die Menge an diffusen Dextran kann mit Kalibrierkurven gegründet mit der Stammlösung quantifiziert werden. Darüber hinaus können kinetische Experimente durchgeführt werden, durch das Entfernen von kleiner Proben des Mediums Außenkammer in einen zeitlichen Verlauf (Abbildung 2). Auch ohne Behandlung wird die Dextran durch die Zelle Monolage diffundieren.</li>
</ol>4. bestimmen Sie Puromycin Empfindlichkeit
Hinweis: Vor transducing die Zelllinien mit Lentivirus, ist es wichtig, die Kill-Kurve eines ausgewählten Arzneimittels für diese bestimmte Zelle Zeile zu bestimmen. Zur Bestimmung des Mindestbetrag der Wirkstoffkonzentration notwendig, alle Zellen zu töten, eine Dosis-Antwort-Experiment mit inkrementellen Dosen des Medikaments ausgewählten durchführen. Weil jede Zeile Säugetier-Zelle verfügt über eine andere Empfindlichkeit vor dem experimentieren, sollte die optimale Konzentration des Antibiotikums bestimmt werden, durch die Entwicklung der Kill-Kurve-Titration wie unten aufgeführt.
<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit den Hemocytometer. Aufschwemmen der Endothelzellen in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL in komplette Endothelial Zelle Wachstum-haltigem Medium der Supplement-Mix.</li>
	<li>Platte 1 x 104 LiPo-Zellen in einer 96-Well-Platte in einem Endvolumen von 100 µL des Mediums Endothelial Zelle Wachstum.</li>
	<li>100 µL der Antibiotika zu einer Konzentration von 0,1-10 µg/mL-haltigem Medium hinzufügen (siehe Abbildung 3).</li>
	<li>Die Zellviabilität alle 2 Tage unter einem Lichtmikroskop mit einem 20 X Objektiv zu prüfen. Kultur der Zellen für 10-14 Tage und das Medium mit Puromycin alle 2-3 Tage je nach Zellwachstum zu ersetzen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL/Well MTS Reagenz in jede Vertiefung, Mischung, und 4 h bei 37 ° C im standard Kulturbedingungen inkubieren.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platte kurz in einen Shaker geben und Messen Extinktion von behandelten und unbehandelten Zellen mit einem Teller Reader auf 490 nm (Abbildung 3).</li>
</ol>(5) Transduktion von Endothelzellen mit Lentivirale Vektor
<ol><li>Platte 1 x 105 Endothelzellen in 1 mL der kompletten Medium am Vortag Transduktion. Führen Sie Transduktion, wenn die Zellen 50-80 % Konfluenz erreicht haben.</li>
	<li>Tauen Sie die Lentivirus auf Eis auf, und machen Sie Aliquote der viralen Bestände, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Spin-down das Material bei 200 X g für 30 s in Röhren vor dem öffnen um Verschütten zu vermeiden.</li>
	<li>Die Zellen in einer Endkonzentration von 8 µg/mL Hexadimethrine Bromid hinzufügen. Hinweis: Hexadimethrine Bromid hilft die Transduktion Effizienz, jedoch in einigen Fällen für die Zellen giftig sein könnte. Daher sollte die optimale Konzentration bestimmt werden, durch die Durchführung einer Tötung Kurve vor der Transduktion.</li>
	<li>Schwenken Sie die Platte vorsichtig mischen. Fügen Sie die entsprechende Menge der Viruspartikel (zwischen 0,5-2 x 106 Teilchen) am geeignet Multiplizität der Infektion (MOI) und wirbeln die Platte vorsichtig für 30 s zu mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zelle-viralen Partikel Mix in der Zentrifuge bei RT für 45 min bei 300 X g zur Steigerung der Effizienz der Transduktion. Über Nacht inkubieren Sie die Zelle Viruspartikel Mischung bei 37 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das virale Partikel-haltigen Medium und entsprechend entsorgen. Ersetzen Sie es mit frischen, vorgewärmten komplette Kulturmedium.</li>
	<li>Starten Sie die Auswahl mit Puromycin am zweiten Tag: das Medium zu entfernen und ersetzen es durch frisches Medium mit der richtigen Konzentration von Puromycin wie zuvor im Abschnitt 4 (Abbildung 3).</li>
	<li>Zellen nach Puromycin Auswahl zu ernten und RNA mit einer RNA Isolierung Kit nach den Anweisungen des Herstellers zu isolieren.</li>
	<li>Ausführen cDNA Synthese mit dem ausgewählten MiRNAs mit Hilfe einer reversen Transkription kit (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Die qPCR-Reaktion nach der zitierten Protokoll13eingerichtet.</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation.">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles.">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li><li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia.">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria.">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727 (2016).</li><li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria.">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li><li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port:+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake.">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li><li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes.">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li><li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis,+clinical+features,+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria.">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li><li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions.">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis.">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einige Parasiten, einschließlich Toxoplasma, Trypanosomen und Leishmanien Trichomonas auslösen die Freigabe der EVs von der infizierten Wirtszelle. Je nach Erreger können freigegebene EVs vermitteln zelluläre Kommunikation zwischen den Parasiten6bzw. der Host Immunantwort modulieren. Jedoch gibt es wenig Hinweise darauf, wie diese kleinen Bläschen zu Malaria Krankheit beitragen. Hier haben wir mehrere Möglichkeiten, um die Funktion des EFD bei Plasmodium Infektion untersuchen beschrieben. Zum Beispiel kann die Aufnahme von EVs von Empfängerzellen in Vivo effizient durch Beschriften sie mit den PKH67 Leuchtstofffärbung überwacht werden. Mehrere Steuerelemente müssen durchgeführt werden, um die Spezifität der Kennzeichnung zu gewährleisten. Es ist wichtig zu beachten, dass einmal mit dem Verdünnungsmittel C gemischt, die PKH67 Farbstoff Form Aggregate tendenziell, und es daher notwendig ist, ein Steuerelement mit dem Farbstoff allein ohne EVs die unspezifische Färbung bestimmen. Konfokale Mikroskopie ist die Methode der Wahl zur Unterscheidung Bläschen an der Oberfläche gebunden und durch den Empfängerzellen wirklich verinnerlicht. Darüber hinaus bietet es ein hervorragendes Werkzeug zum Nachverfolgen und überwachen die Anzahl der Bläschen, die von den Zellen aufgenommen. Unklar bleibt allerdings, wie EVs in den Empfängerzellen14verarbeitet werden; Durchführung von daher einen zeitlichen Verlauf mit Zeit-Punkte 2, 4 und 8 h, möglicherweise sehr nützlich, um die optimalen Bedingungen für die Aufnahme zu bestimmen. Die Zugabe der subzellulären Fach Marker lässt sich der EVs in den Zellen zu verfolgen von konfokalen Mikroskopie. EV Aufnahme nachweislich Membranfusion per Endozytose15auftreten. Die Fusion kann durch Kennzeichnung EVs mit Octadecyl Rhodamin B (R18) überwacht werden. Die Verschmelzung des EFD mit der Zellmembranen führt zu einer Verwässerung der R18, führt zu einem Anstieg der Fluoreszenz16. Aufnahme des EFD durch Endozytose kann studiert werden, mithilfe von spezifischen Inhibitoren von Aktin, Mikrotubuli und Dynamin10.
Um die Physiologie des EFD zu studieren, ist es möglich, beschriften Sie die iRBCs direkt mit der PKH Farbstoffe und Co Kultur iRBCs mit Endothelzellen. Das Problem hierbei ist, dass die Zellen unterschiedliche Medien benötigen und Gaszusammensetzungen und die Menge der EV-Transfer könnte niedrig sein. Darüber hinaus können vesikuläre verschmolzen mit einem fluoreszierenden Proteinen in den Spender Zellen in Vitro und in Vivoausgedrückt werden. Allerdings wurde so weit es nicht mit iRBCs getestet
Infizierte Erythrozyten sind Cytoadherent zu den Microvasculature des Gehirns, in einem Prozess gedacht, um zu zerebralen Malaria17verantwortlich sein. Daher ist die Übertragung von Parasiten Material über EFD Endothelzellen und daher Gefäßfunktion18beeinflussen. Der in-vitro- Test hier beschrieben wird, bietet eine einfache Möglichkeit, einige der grundlegenden Eigenschaften der endothelial Zellen, wie zum Beispiel seine Durchlässigkeit19zu untersuchen. Zusätzliche Tests wie TEER oder Immunostaining mit ZO-1 bieten weitere Informationen über die engen Kreuzung Integrität10.
Darüber hinaus erweist die in-vitro- Modell sich ein mächtiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen hinter der zellulären Kommunikation zwischen Parasiten und Wirtszellen zu studieren werden. Neben der Aufnahme ermöglicht dieses Setup die Untersuchung der molekularen Mechanismen in diesen Prozess einbezogen. Zum Beispiel haben wir die Übertragung der miR451a an den Akzeptor-Zellen durch Real-Time PCR und Fluoreszenz in Situ Hybridisierung überwacht. Darüber hinaus beschreiben wir Zelllinien überexprimiert eine besondere MiRNA, um die Rolle von diesen kleinen RNA in Gefäßfunktion10direkt ansprechen zu generieren. Jedoch sollte mehrere Steuerelemente ausgeführt werden, einschließlich Tests nicht ausgestrahlt Zellen, da die Signalweiterleitung selbst die zelluläre Funktion beeinträchtigen könnten. MiRNA-Inhibitoren ist darüber hinaus lässt sich die Wirkung der MiRNAs neutralisieren.

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation gab es 212 Millionen neue Fälle von Malaria im Jahr 2015 weltweit und rund 429.000 Menschen starben, vor allem Kinder unter fünf Jahren Alter1. Die Mechanismen, die schwere Krankheit, die oft mit vaskuläre Dysfunktion assoziiert wird, bleiben unklar2. Plasmodium- iRBCs absondern, kleine Bi-Lipidmembran Sphären als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt. Es ist bekannt, dass diese EVs den Infektionsprozess und die Host-Immunantwort auf eine Infektion potenziell relevant sind; jedoch ist wenig bekannt über die genaue Funktion von diesen kleinen Vesikeln in Malaria-Infektion3. Es ist möglich, dass sie zwei wichtige Rollen spielen: auf der einen Seite könnte sie zur Pathogenese beitragen, durch die Aktivierung von Makrophagen4,5; und auf der anderen Seite könnten sie zellulare Kommunikation zwischen Parasiten und zwischen Parasiten und Host6,7vermitteln. In der Tat können Parasiten Proteinen oder Nukleinsäuren untereinander über EFD übertragen. Z. B. Trypanosomen Trypanosomen Rhodesiense EVs Virulenzfaktor Serum Resistance-Associated (SRA) zu übertragen und kann gezielt andere T. Trypanosomen und Host Erythrozyten-8. Darüber hinaus kommunizieren p. Falciparum- iRBCs zwischen einander durch die Übertragung von Nukleinsäuren im EFD. Dadurch können die Parasiten zu optimieren und das Wachstum zu synchronisieren. In der Tat EVs möglicherweise wichtiger Regulator der Gametocyte Umwandlung, und somit dazu beitragen, die Regelung der Übertragung Stufe7.
Nicht nur tun EVs regulieren die Parasiten, sie vermitteln auch Parasit-Wirt-Interaktionen. Wir haben kürzlich entdeckt, dass EVs aus iRBCs Host-abgeleitete Micro-RNAs (MiRNAs; kleine RNA-Spezies im Bereich von 21-25 Nukleotide9) enthalten, die von menschlichen Endothelzellen aufgegriffen wurden. Die MiRNAs in der EVs bilden eine stabile komplexe mit Ago2 (ein Mitglied des RNA-induced silencing complex), die einmal an den Empfängerzellen geliefert ist in der Lage, gezielt Genexpression zum Schweigen zu bringen und die Auswirkungen auf die Barriereeigenschaften der Zellen10. Standard-Protokolle wurden entwickelt, um die Funktion des EFD zu untersuchen. Hier beschreiben wir zunächst ein Protokoll, das fluoreszierende Kennzeichnung von EVs zu untersuchen, deren Aufnahme durch Empfängerzellen ermöglicht. Mithilfe einer confocal Mikroskop ist es darüber hinaus möglich, die EV Schicksal innerhalb der Zelle zu verfolgen. Einige Leuchtstofffärbungen können verwendet werden, um EVs zu verfolgen. Die Amin-Reaktivfarbstoffen, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFSE-) und Calcein-AM werden Leuchtstoffröhren einmal im Inneren der Bläschen. Wir bevorzugen die amphiphile Label, PKH, weil es ein heller und gleichmäßiger Signal gibt. Dieser Ansatz bietet wichtige Informationen, um die Wechselwirkungen zwischen EVs und Empfängerzellen verstehen. Während in einigen Fällen EVs an der Oberfläche der Zellen zu binden, werden einige Bläschen schnell aufgegriffen. Nach Aufnahme liefern EVs ihre Fracht an den Zellen, in denen sie ihre regulatorische Funktionen ausüben.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Barriere-Funktion der Endothelzellen in-vitro- messen durch die Übertragung von einem fluoreszierenden Dextran durch eine zelluläre Monolage zu quantifizieren. Empfindlicher Tracer können z. B. radioaktiven Marker verwendet werden. Sie erfordern jedoch besondere Sicherheitsvorkehrungen für den Einsatz. Andere Tests bestehen, um die in-vitro- Barriere-Funktion wie Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER), zu messen, die engen Kreuzung Integrität misst. Schließlich visualisieren ZO-1, eine tight Junction Proteins durch Immunfluoreszenz ermöglicht Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen enge Kreuzung als gut10. Da die EVs komplexen und heterogenen Entitäten enthält mehrere Ladungen mit möglichen regulatorischen charakteristisch sind, ist es sinnvoll, eine spezifische RNA um seine Wirkung auf die Empfängerzelle studieren overexpress. Deshalb definieren wir auch eine Protokoll, die darauf abzielt, stabilen Zelllinien mit dem Ausdruck der MiRNA Interesse10zu generieren.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&amp;ndash;Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insert with PET membrane transparent Falcon&amp;nbsp;for plate 24 wells</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth&amp;nbsp;Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>hsa-mir-451a&amp;nbsp;RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

Malaria ist eine lebensbedrohliche Krankheit, verursacht durch Plasmodium -Parasiten, mit p. Falciparum als auf dem afrikanischen Kontinent verbreitet und verantwortlich für die meisten Malaria-Todesfälle weltweit. Mehrere Faktoren einschließlich der Parasit Sequestrierung in Geweben, vaskuläre Dysfunktion und Entzündungsreaktionen beeinflussen die Entwicklung der Krankheit bei Menschen mit Malaria infiziert. P. Falciparum-infizierten roten Blutkörperchen (iRBCs) lösen kleine extrazelluläre Vesikel (EVs), enthält verschiedene Arten von Fracht-Moleküle, die Pathogenese und zelluläre Kommunikation zwischen Parasiten und Host zu vermitteln. EVs werden effizient durch Zellen aufgenommen in denen sie ihre Funktion modulieren. Hier besprechen wir Strategien, um die Rolle der EVs in Parasit-Wirt-Interaktionen. Zunächst beschreiben wir eine einfache Methode für die Kennzeichnung und Nachverfolgung EV Internalisierung von Endothelzellen, mit einem grünen Zelle Linker Farbstoff. Zum anderen berichten wir über eine einfache Methode zur Durchlässigkeit über eine Monolage Endothelzellen messen mithilfe von Eindringmittel beschrifteten Dextran. Schließlich zeigen wir, wie die Rolle der kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle in Endothelzellen Funktion zu untersuchen.

Hier beschreiben wir Protokolle untersuchen die Wechselwirkungen des EFD mit Wirtszellen. Die Aufnahme von Eindringmittel beschrifteten EVs wird durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1) überwacht. Endotheliale Zellen nehmen effizient EVs, aber die Inkubationszeit mit EVs optimiert werden kann, um die Aufnahme zu verfolgen. Färben Sie für eine bessere Lokalisierung der EVs in den Zellen Actin mit Phalloidin. Als Nächstes verwenden wir eine Filtermembran, auf dessen Spitze eine Monolage von Endothelzellen wächst. Rhodamin B erfolgt-Dextran ist auf die obere Kammer der Filtermembran angewendet und dann wird die Durchlässigkeit der endothelialen Monolage durch Überwachung des Transfers von fluoreszierenden Dextran in der unteren Kammer (Abbildung 2A) gemessen. In der Regel ist die Durchlässigkeit der endothelialen Zellen nach Inkubation mit zunehmender Menge des EFD (Abb. 2 b) betroffen. Es ist wichtig, wachsen die Zellen für mehrere Tage, um sicherzustellen, dass sie einen monomolekularen Film sonst der Farbstoff schnell verbreiten wird durch die Brunnen bilden werden. Es ist wichtig zu beachten, dass auch ohne Behandlung der Dextran langsam durch die Zelle Monolage verbreiten wird.
Micro-RNAs sind Schlüsselkomponenten des EFD und nach Übergabe an den Empfängerzellen, sie regulieren Genexpression. Um speziell die Rolle von MiRNAs zu untersuchen, ist es sehr nützlich, um sie in die Empfängerzelle Linie overexpress. Hier beschreiben wir, wie MiRNAs in endothelialen Zellen transduzieren. Der erste Schritt besteht aus die Konzentrationsbestimmung von Puromycin, die endotheliale Zellen tötet, um stabil ausgestrahlt (Abb. 4A) markieren. Schließlich kann das Niveau der Ausdruck der MiRNAs gesteuert und durch qPCR (Abbildung 4 b) validiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig1.jpg"> Abbildung 1: EVs werden von Endothelzellen aufgegriffen. Gereinigte EVs wurden in grün mit PKH67 und inkubierten für 4 h mit einer Monoschicht von Endothelzellen beschriftet. Unbehandelte endotheliale Zellen dienen als Negativkontrolle. Nach dem umfangreichen waschen um ungebundene EVs zu entfernen, wurden die Zellen mit Phalloidin, Aktin (rot) zu beflecken und Hoechst 33342 Nucleus (blau) Fleck gebeizt. Die Zellen wurden von konfokalen Mikroskopie beobachtet. Bilder wurden mit einem Laser confocal Mikroskop und 63 x 1.3 NA Öl Ziel. Hoechst 33342 freut sich bei 405 nm und mit Emissionen gesammelt bei 450-470 nm (blau); PKH67 freut sich auf 488 nm, Emissionen gesammelt bei 505-530 nm (grün); und Phalloidin-594 freut sich auf 543 nm, Emissionen gesammelt bei 620 nm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57067/57067fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig2.jpg"> Abbildung 2: Auswirkungen der EV-Aufnahme auf endotheliale Barriere. (A) schematische Darstellung der Diffusion von Rhodamin beschriftet Dextran: Endothelzellen sind gewachsen bis Mündung an der Oberseite eine Filtermembran, fluoreszierende Dextran gilt für die obere Kammer und im Laufe der Zeit durch die Membran diffundiert. Die Wirkung des EFD auf Durchlässigkeit bemisst sich nach der Zugabe des EFD, die obere Kammer durch die Messung der Rate der Diffusion von Dextran in der unteren Kammer. (B) eine zunehmende Menge an EVs sind mit endothelial Zellen inkubiert. Für Messungen der Durchlässigkeit ermöglicht die Übertragung von Rhodamin beschriftet Dextran durch eine Trans-Brunnen-Membran im Laufe der Zeit. Durchlässigkeit auf die endotheliale Schicht wird nach 2 h Inkubation mit 50 und 100 µg/mL des EFD deutlich erhöht. Daten stellen bedeuten (± SEM) aus 3 versuchen. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57067/57067fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig3.jpg"> Abbildung 3: Titration von Puromycin. Puromycin (10 mg/mL)-Stammlösung wird in RPMI 1640 ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten (56 ° C, 30 min) fetalen Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin 1 mM Natrium Pyruvat verdünnt. Insgesamt 15 µL ist bis 10 mL des Mediums im Rohr A. hinzugefügt. Dann 7,5 mL der Lösung von Rohr A zu 2,5 mL RPMI Rohr B. gemischt Zu guter Letzt 100 µL der Verdünnung werden hinzugefügt, 100 µL der Zellen, eine Endkonzentration von 7,5 µL/mL, 5,62 µL/mL und so weiter zu geben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57067/57067fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig4.jpg"> Abbildung 4: Generierung von endothelial Zellen überexprimiert miR451a. (A) Ermittlung der Tötung Kurve von Puromycin auf Endothelzellen. Endotheliale Zellen wurden mit Puromycin bei steigenden Dosen inkubiert. Die Tragfähigkeit wurde nach 72 h von MTS-Assay gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert (± SEM) eines repräsentativen Experiments. (B) RNAs aus endothelial Zellen überexprimiert miR451a oder eine Negativkontrolle wurden geerntet und das miR451a-Protokoll wurde durch Real-Time PCR quantifiziert. qPCR Ergebnisse sind durch die 2-Ct-Methode mit U6 als Haushälterin gen normalisiert und ausgedrückt (± SEM) bedeuten (n = 3 Experimente). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57067/57067fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle, um die Rolle der extrazellulären Vesikel (EVs) veröffentlicht durch Plasmodium Falciparum infizierten Erythrozyten zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Wechselwirkungen von EVs mit Endothelzellen.

Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Aufrufe.  University of Fribourg. In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle, um die Rolle der extrazellulären Vesikel (EVs) veröffentlicht durch Plasmodium Falciparum infizierten Erythrozyten zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Wechselwirkungen von EVs mit Endothelzellen.

Serie: Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Medizin

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

Ein

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus

High Yield Reinigung von

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

Ein

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

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