カレン ・ m ・強は、ライス大学のジョージ ・ j ・あった研究賞の 2016年受け手だった。范蠡の周は、ライス大学から教育フェローシップの受信者です。ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター、ハーバード旅行施設のサービス ウィーン ショウジョウバエ リソース センター感謝し。

1. 幼虫の準備
<ol><li>実験目的の交差を設定、分析を開始する前に 2 つ以上の日と Wieschaus と Nusslein = フォルハルト13しかし 50 mL ポリプロピレンを使用してで定義されているレイアウト卵料理の組み合わせ (最小 20 女性と男性 10 例) を制御ビーカー、6.0 cm 使い捨てペトリ皿グレープ寒天を含むと酵母にまみれては、使用の直前に貼り付けます。必要になるまで室温で暗闇の中で卵置く料理にハエを保ちます。</li>
	<li>ぶどう寒天レシピ-結合冷凍 100 mL 100% グレープ ジュース濃縮物、350 mL deioinized 水、5 mL 氷酢酸と 13 gショージョーバエ ・寒天 1 L ガラス ビーカーに。電子レンジで 1-2 分バースト、バースト、すべては寒天が溶けるまでの間攪拌します。数分間ソリューションを冷却し、95% エタノール 10 mL Nipagen (メチル p ヒドロキシ安息香酸) の 10% (w/v) を追加します。ミックス、使い捨て 6.0 cm シャーレにプレートあたり 7 mL のピペットをゲル 4 3 4 店のため室温で乾燥し許可ビニール袋に 0 C。</li>
	<li>酵母ペーストのレシピ-7 g の乾燥酵母、10 mL の脱イオン水、均一な整合性までヘラで混ぜます。</li>
	<li>卵実験を生成し、幼虫を制御するコレクションをタイムアウトしました。、新しい酵母を塗った、ブドウのプレートを使用して、朝の時間の間に暗闇の中で 4 時間室温で卵を収集します。これらの 4 時間コレクション プレートを取り外して、新鮮なプレート。25 で一晩 4 h コレクション プレートを孵化幼虫のほとんどが孵化したとき、次の日の午後まで0C。これらの最初の幼虫を収集し、それらを使用して実験を設定します。</li>
</ol>2. アッセイ プレートを設定
<ol><li>アッセイ プレートの準備。アッセイの単一の実行、各 10 実験幼虫の 5 つのアッセイ プレートと 10 の制御の幼虫の 5 つのプレートを準備します。1.5 cm のコルクの穴あけ器を使用して、食品用の穴を作成する各板から寒天の中核を削除します。酵母ペースト (0.8 - 0.9 g) を入れ、穴と穴を充填マウンドを作るにヘラで優しくなでます。</li>
	<li>寒天培地プレート作製-2 L ガラス ビーカーで 16 gショージョーバエ ・寒天と 700 mL の脱イオン水を組み合わせて 5 分削除電子レンジからのマイクロ波し、溶液に不溶の寒天をもたらすガラス棒でかき混ぜます。10% (w/v) Nipagen 95% エタノール、ミックス、17.5 mL を追加し、30 s バーストのマイクロ波加熱後、すべて寒天が完全に溶解するまで攪拌を続行します。1 分または 2 つのクールな、ピペット 15 ml 10 cm プラスチック シャーレに。ゲル、蓋板をカバーし、数時間の常温乾燥または一晩させて寒天を許可します。18 ° C で密封されたポリ袋の店板 1 に注意してください:余分な dessiccation のための板の表面に Nipagen 結晶の形成を避けるためには、準備は数日プレートを使用します。必要に応じて、数マイクロリットルに 95% アルコールのドロップすることによって結晶を再溶解できます。 注 2:寒天培地のバッチが異なるゲル形成能を持つことができます。乾燥ゲル板は、タッチにしっかりと十分に弾力性のあるコルクの穴あけ器を使用して食品の穴 (上記参照) を作成する寒天のきれいで、そのまま円を削除できるようにする必要があります。</li>
	<li>アッセイ プレートで幼虫を設定します。機械的圧力を使用して、プラスチック microspatula の先端を曲線と幼虫を拾うための「接着剤」を提供する酵母ペーストで先端を浸し。幼虫を個別にピックアップし、食品マウンドに近い寒天プレート上に配置。少なくとも 5 つのレプリケート プレート 10 幼虫の実験と遺伝子型のコントロールを準備します。完了したら、キャップしラベルを各プレート、プレート (蓋側を) を常温で暗い空間で設定 (当研究室では、22 の ° C)。</li>
</ol>3. アッセイ プレート
<ol><li>解剖顕微鏡の下で毎日プレートを確認し、食品の上にまたは寒天表面に幼虫の個体数を記録します。任意の目に見える死んでいる或いは瀕死の幼虫に注意してください。幼虫が 3 令に移動すると見られている寒天の下地へのトンネルに注意してください。蛹を形成し、蛹の異常に注意してください開始日の日付に注意してください。すべての幼虫が死亡または背地性まで毎日観察を続けます。</li>
	<li>針とブドウのプレートに転送をからかい曲げて、プレートから慎重に蛹を削除します。必要な場合は、蛹大人としてどのように多くの eclose を判断するための監視を継続します。</li>
</ol>4 イメージング プレート試金の準備
<ol><li>慎重を削除し、各プレートの中央の井戸からすべての酵母食品を破棄します。</li>
	<li>軽く水道水、各プレートの洪水し、ソフト アーティストのペイント ブラシを使用して慎重に寒天表面に追跡されている破片をこする。数回水を交換し、各プレートが完全にきれいになるまで、穏やかなブラッシングを続けます。プレートの脱イオン水で最終すすぎを与える、それらをキャップ、室温で乾燥するために一晩を残してください。 注:寒天にトンネルは最も強い食品マウンドの周り (図 2 参照)。その結果、食品穴の縁は通常初期の 1.5 cm 直径を超えて拡張されます。さらに、この地域で働いていた寒天の脆弱性は、クリーニング中に穴の周囲から失われるトンネル寒天の小さな断片を引き起こす可能性があります。これらの問題を助けることができるゲルの寒天濃度を増加させるが、イメージ J 定量手順 (下記参照) で修正が可能。</li>
</ol>5. トンネルの定量
<ol><li>プレートをイメージします。各プレートを黒の背景に明るい白い線のように寒天でトンネルを表示するように撮影のイメージを準備します。 注:一般的にこのステップの DNA ゲルの画像に使用されるシステムを用いて (テーブルの材料および試薬を参照)。適当な画像を生成する画像処理システム、デジタル カメラや携帯電話のカメラなどの tiff ファイルを生成することができる代替を調節できます。</li>
	<li>パブリック ドメイン プログラム NIH イメージ J を使用して、幼虫トンネル量的に表わします。Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html からプログラムをダウンロードします。プログラムの詳細については http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html を参照してください。 注: その他のイメージング システムは、トンネルを量的にされる可能性があります。以下の手順は、NIH イメージ j. に適用します。</li>
	<li>トンネル プレートの tiff ファイル イメージを開いたら全体寒天表面を表しますが、プレートのプラスチック製のエッジをトリミングを定量化するための領域を定義するのに楕円形ツールを使用します。</li>
	<li>黒い線として表示されているトンネルで、板の逆のイメージを生成する自動しきい値を適用します。トンネルではなく、寒天に損傷を表す黒の領域をカラー ピッカーと白にペイント ブラシ ツールを使用します。</li>
	<li>[分析] プルダウン メニューの [セット スケール選択 |スケールの除去をクリックしてし、(分析) の下でまた測定の設定ウィンドウでは、エリア、制限のしきい値を確認します。</li>
	<li>Cntrl キー + M ピクセルの黒の領域 (トンネル) を表示するキーを押します。</li>
	<li>コピーと貼り付け各プレートのピクセル値は、定量分析を可能にする (Excel) などの表計算プログラムにです。</li>
	<li>中央の穴は、この地域で強烈なトンネルによる通常拡張されます。量的不足しているトンネルを「しきい値を制限する」を外してから、選択ツールを使用して中央の穴を定義します。Cntrl キー + M この領域のピクセル値を取得するキーを押します。この値から 1.5 cm の穴のピクセル値を減算し、5.6 のステップで取得したトンネルの値に違いを追加します。</li>
	<li>いくつかのプレートの中央の穴がuntunneled寒天培地の穴に隣接する地域を含むトンネル寒天片をされない場合があります。これらのプレートの使用のための中央の穴を量的に表わすときカラー ピッカーとペイント ブラシのトンネル領域を定義し、定量から非トンネル化領域を除外する欠損領域全体に黒いバーを追加するためのツール。 1 に注意してください:実験の幼虫は、任意のトンネリングを実行、この定量はトンネル プレートのセットとコントロールの統計的な比較の値と実験値の平均の計算を許可します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. 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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があるを宣言します。

我々 はここでキイロショウジョウバエ幼虫組織低酸素症を検出するために設計された簡易測定法を提案しました。診断は、幼虫の初期の人生と幼虫の人生の後半トンネリングの下地の不在で食品塚に減らされた穴を掘るに基づいています。食料源から早期の移行を引き起こすことができます幼虫密度、アッセイの 1 つの重要な側面は幼虫の数が少ないが大過剰の食品の存在下で試金されます。寒天プレートに殺菌剤メチル p ヒドロキシ安息香酸 (Nipagen) を含めることも分析中にカビの生育を防ぐために不可欠です。
我々 は、寒天がアッセイにおける変動性の源をすることができますを見つけます。通常、両親の異なるバッチまたは別の幼虫のコレクションからは、同じ遺伝子の幼虫はアッセイでの行動の比較的限られた変化を表示します。対照的に、寒天は別の日に作ったまたは寒天の別のバッチとトンネリングの違いをもたらすことができます。したがって、1 つの規定にはそのコントロールと実験の幼虫すべて試されるバッチと同じ準備から寒天を使用します。ゲル化力は、さまざまなメーカーから寒天培地または同じメーカーからも出荷によって異なります、ので最適なゲルを達成するためにここで使用される 2.2% から上向きに寒天濃度の調整をする必要があります。我々 は、野生型幼虫が 3% 寒天ゲルによって容易に穴を掘ることができますを発見しました。
この試金の値を示すために我々 は抑制機能を持つ幼虫における潜在的な組織の低酸素を調査するそれを使用しているuninflatable .気管内我々 の調査結果はこの遺伝子の気管の表現の損失が低酸素を作り出すことができること仮説の強いサポートを提供: btl-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫を示した食品と下地の間にトンネルの完全な欠如に穴を掘るに失敗3 齢。先行研究が他の遺伝子型の私たち、我々 は低酸素状態における損失食品穴を掘るの下地のトンネリングの損失およびbtlとして完全ではありません,-Gal4 > 同じように振舞った UASuifの RNAi の幼虫はここで学んだ。このアッセイの失敗したトンネル コンポーネントしたがって、低酸素症の最も強い表示を提供します。
ただし、 btl-Gal4 > uif RNAi 幼虫は示した行動特性をカット(ue) 低酸素血症の診断-Gal4 > UAS-uif RNAi これらの異常は見られませんでした。Btlとカット(ue) Gal4 ドライバーは、さまざまな段階で、幼虫の気管内の異なるパターンで表されます。Btl-Gal4 ドライバーは胚発生におけるその展開から始まって、幼虫の生活を通して継続気管システム全体で表されます。対照的に、カット(ue) から Gal4 式-Gal4 ドライバーのみ、気管の形態形成後萌芽期の生命の終わりに始まる、背側のトランクの主要な縦血管の極端な後部セクションに限られます気管システム。Gal4 行uifノックダウンは、したがってuif式を減らすことができないこの試金の測定動作をトリガーするために必要な低酸素症のいくつかのしきい値レベルを生成するのに十分十分に早く、あるいは広く。
事前調査は、3 齢幼虫 (10%) の酸素の低水準への露出が減らされた成長を示すことを発見し、pupariation 14の発症を遅延しました。Btl-Gal4 > ここで学んだ UAS -uif RNAi 幼虫が 3 齢に進んで、彼らの成長、蛹化率に及ぼす影響が顕著であったより: 彼らがかなり下のほとんどの脂肪組織を持つコントロールよりも小さい、表皮 (図 3) とマイナーな一部分 (~ 10%) だけは、pupariation を試みた。これらの違いは、 btlを提案する-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫は気管uifの打撃の全体の幼虫たちの生活を通して存在していたか、それはより生産ため低酸素症の大きい程度を経験しました。3 齢で重篤な酸素欠乏。気管でuif関数の損失可能性があります酸素輸送に与えるようには不明この時点で。Btlの気管-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫はキューティクル (図 3)、示すこと彼らは空気に含まれている、機能、流体のエントリに妥協点がない被害を受けたを通じて容易に表示されていた。したがって正式に可能です低酸素がむしろいくつか他の欠陥トンネルを阻害するuif機能の損失によって作成された気管損傷が発生しません。以前勉強した遺伝子型、トンネルに失敗は、後半 3 齢幼虫15LDH mRNA7のレベルが上昇、解糖作用、酸素の標準インジケーターに関連付けられていることを調べた。Btlのため低酸素症のため、最終確認-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫 (と幼虫が将来的に検討のこの試金の使用) の LDH mRNA のレベルまたは測定する市販インジケーターの使用を評価するために RT-PCR 法を伴うだろう細胞内の酸素のレベル (たとえばを参照してください16)。

キイロショウジョウバエで利用できる分子遺伝学的ツールの高度な配列では、進化上保存された生物学的プロセスの研究のための貴重な生物です。酸素可用性レスポンスのキー分子進化を渡って節約される証明しているし、キイロショウジョウバエの先行研究は、シグナリング経路1,2、これらの普遍的なコンポーネントに洞察力を生成しています。 3,4,5,6。
キイロショウジョウバエ幼虫における感覚神経機能解剖を目指す研究の一環として、通常の酸素レベル7で組織の低酸素によって活性化することが判明した 2 つの行動応答を識別されます。これらの食品に穴を掘るに失敗した 1 つは非常に関連・ ウィン グローブと o ' farrell 8によって報告された低酸素のレベルに応答しています。2 番目の現象は、後半 3 齢段階を徘徊中に柔らかい下地にトンネルに失敗がまだ識別されていない低酸素症-関連。我々 は両方これらの行動が低酸素症に属します -、いずれかによる組織の損傷や低酸素の取入口のレベルを確立、低酸素のレベルに野生型放浪幼虫を公開することでトンネル7下地も阻害することを決定しました。ここ幼虫孵化後すぐに観察で始まるこれら 2 つの低酸素誘発行動を量的に培った試金を記述します。
初期の幼虫の段階で低酸素応答が以前調査されていない、我々 の分析の重要なコンポーネントは、したがって幼虫の人生を通して分析を実行します。-遅い開発、貧困層の成長と運動の低迷-低酸素症の明らかな症状のほとんどは、多くの突然変異によって生成される幼虫表現型と重複します。しかし、我々 は低酸素症の 3 齢幼虫が7をトンネルする完全な失敗を示すことを発見しました。したがって、我々 は特定も幼虫がより成長と運動の面で当社の低酸素の幼虫よりも危険にさらさ、いくつかのトンネルを実行まだ低酸素幼虫決してトンネル7に対し。この試金の別の重要な要素は、低酸素血症が他のストレスや代謝の異常ではなく、多面の表現型の特定のセットのソースを確立する方法を提供することです。アッセイの例としてここで説明の気管の発現低下と幼虫の応答の特性での使用uninflatable、幼虫・ エアウェイズ9で機能する遺伝子。
この試金貧しい成長低迷の動作など幼虫形質の特性で従事している研究者に価値のあることを想定します。その結果、配布、使用、またはへの応答に影響を与える新しい遺伝子、体全体に酸素を識別できなかった。さらに、この試金の突然変異体のスクリーニング プロトコルを組み込む低酸素を作り出す突然変異の識別への直接ルートを提供します。この試金は、ここで説明されている低酸素状態における生得的な行動を引き出す回路の分析の貴重ななります。この型のニューラル ネットワーク解析は多くの現在の研究の焦点、キイロショウジョウバエ幼虫の単純な神経システムは自動化された動作を解剖するための貴重なシステム。幼虫酸素知覚に関与するニューロンが既に指定されて、低酸素による応答10,11の完全な回路を定義する第一歩を提供します。さらにニューラル ネットワークのコンポーネントを区切るための明確な道筋は、GAL4 UAS システム12を介して神経ししてとの組み合わせで我々 の分析を使用しています。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dehydrated yeast&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen grape juice concentrate</td><td>Welch&#039;s</td><td></td><td>&amp;nbsp;Available at most large supermarkets</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila agar</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-para-hydroxybenzoate</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20-658</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene beakers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6.0 cm disposable Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>10 cm disposable plastic Petri dishes</td><td>E+K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>Plastic microspatulas</td><td>Corning Incorporated</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>Bent teasing needle</td><td>Nasco</td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>Any microscope with 10-30X magnification</td></tr></tbody></table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

動物の酸素の剥奪は、大気酸素の低水準への露出または酸素の流通を妨げる内部組織の損傷に起因できます。酸素感知ニューロンの異常な行動は通常酸素の存在下で酸素のような動作を誘導することが可能です。キイロショウジョウバエ、低酸素のレベルで開発の幼虫の段階で成長と低迷の動作の抑制の結果します。しかし、酸素欠乏のこれらの確立された症状は、ストレス反応や運動の成長を調整する多くの突然変異の表現型を持つかなり重なります。結果として、現在ありませんアッセイ i) 細胞低酸素症誘発突然変異または ii) 低酸素症のような行動異常の神経行動によるときを識別するために利用できます。
我々 は最近低酸素の内部検出に応えて通常酸素のレベルで発生するキイロショウジョウバエ幼虫の 2 つの特徴的な動作を識別されます。まず、すべての段階でこのような幼虫は、食品、食料源から遠く迷う頻繁に穴を掘るを避けます。第二に、柔らかい下地へのトンネル、放浪 3 齢段階で通常発生するが完全に廃止される場合は幼虫が低酸素。ここで説明アッセイは検出し、これらの行動を量的に設計されていますおよびこうして低外部酸素よりもむしろ内部損傷による低酸素症を検出する方法を提供します。寒天下地と酵母ペーストの中央プラグ アッセイ プレートは、幼虫の生活を通して動物をサポートする使用されます。位置と幼虫の状態は、3 番目の最初の齢から進行を毎日追跡されます。放浪フェーズ中に寒天の下地にトンネルの程度は、NIH ImageJ を用いた蛹化後量的に表わされます。アッセイ時低酸素血症は突然変異体の表現型のコンポーネントを決定する値の問題の遺伝子の行動の可能なサイトへの洞察を提供します。

この試金の価値のデモンストレーションとして我々 は遺伝子の機能障害を伴う幼虫の潜在的な低酸素症を調査するそれを使用しているuninflatable (uif) 気管内。uif幼虫気管細胞の頂端表面上が強く表現されて大規模な膜貫通型タンパク質をエンコードします。Uifの変異体は、気管の機能不全9による組織低酸素症を示す可能性がある異常な現象が発生する以前注意されました。我々 は具体的には Gal4 UAS システムを使用して幼虫の気管にuif式を抑制しました。2 Gal4 線が用いられた: i)息(btl)-ii、萌芽期の開発の初めから気管で強く表現される Gal4)カット(ue)-Gal4 の小さい後方領域の式を開始します。胚発生の終わりに背側幹線気管幼生生命7を通してこの地域で強い表現を続けています。UA-uif RNAi ラインは、ウィーンのショウジョウバエ研究センター (VDRC ID #1050) から得られました。
上記のプロトコルに従って、5 は新たに孵化した初齢幼虫に対して設定された 4 つの十字の通りのプレートをレプリケートします。
実験 1 1) コントロール 1 -カット(ue)-Gal4 カントン-S (+) x 2) 実験 1 -カット(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
実験 2 3) 制御 2 - btl-Gal4 カントン-S (+) x 4) 実験 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
カット(ue) の動作-Gal4 > 実験 1 の UAS -uif RNAi 幼虫だったコントロールカット(ue) に匹敵する-Gal4 > + 穴を掘る、トンネリングと蛹化 (図 1 の生存の面で動物と図 2)。対照的に、気管システムから開発 (実験 2) の早い段階で全体にuif式のダウン規制は著しく異なる応答を作り出した。Btl-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫組織低酸素症-の両方の行動症状を表示されます食品穴を掘ると下地 (図 1 と図 2 のの幼虫の生命に後でトンネルの総不在を削減).実験の幼虫は著しく小さく、薄くよりコントロール (図 3) よりも低迷もあったし、アッセイのコースの間に高い死亡率を示した。前述したように、低成長、停滞、個体死で幼虫の低酸素症の症状が知られています。さらに、制御の幼虫は背地性後蛹化の試行に失敗し、残った実験の幼虫のほとんどは、長い幼虫として第三令しています。いくつかの幼虫は、最終的に pupating (図 1 a) なし死ぬ前に 15 日以上を生き残った。実験の幼虫のいくつかが蛹しようが、すべてのケースで異常な蛹が形成された実行可能な大人を生成しませんでした。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> 図 1。食品の穴居性と幼虫の開発の定量。 (A) 4 つの遺伝子型の食品古墳外ライブ幼虫の割合はここで学んだ。各遺伝子型の使用 5 アッセイ プレートの平均が表示されます。Btlの 〜 70% を孵化後 3 日目-Gal4 > 食品外や他の 3 つの遺伝子型の寒天培地の表面に幼虫が検出されないに対し、食品の外 UAS uif RNAi 幼虫にあった。Btl-Gal4 > UAS uif RNAi 幼虫死ぬ日 4-20 ~ 15% とそれらがまだ生きているの間ゆっくりと孵化後 15 日間。X 軸に沿って黒い矢印と (B) では、3 つの他の遺伝子のすべての幼虫は背地性で日を示します。 (B) 死んだ幼虫 4 つの遺伝子型のための食糧の外部で参照の割合です。各遺伝子型の 5 アッセイ プレートの平均が表示されます。死んだbtl-Gal4 > UAS uifの RNAi の幼虫は、ほとんど死にかけていると時間をかけて蓄積食品外。蛹化する他の遺伝子型すべてが生き残るため 4 つの遺伝子型の蛹化率 (C) 生存を検討しました。各遺伝子型の 5 アッセイ プレートの平均が表示されます。Btlの通常の蛹-Gal4 > UAS uif RNAi 遺伝子型が生産されませんでした。図中の誤差範囲を表す SEMs。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> 図 2。幼虫トンネリングの定量。 (A) すべての 4 つの遺伝子型のアッセイ プレートの例としては、定量をトンネリングの準備の後勉強しました。Btlのトンネリングの完全な欠如を注意してください-Gal4 > UAS uif RNAi 幼虫。アッセイ プレートが 10 cm ペトリ プレートです。 (B) 定量のトンネルは、4 つの遺伝子型画像 J から派生します。各遺伝子型の 5 アッセイ プレートのピクセルの平均値。トンネルにられなかったbtl-Gal4 > UAS uif RNAi 幼虫。誤差 = SEMs。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> 図 3。Btlの比較-Gal4 > UAS uif RNAi とbtl-Gal4 > + 幼虫 Btlのための同じような年齢 (孵化後 6 日目) の幼虫-Gal4 > UAS uif RNAi (A) およびbtl-Gal4 > + (B) 遺伝子型。赤い矢印は、背のトランク気管をポイントします。両方の幼虫は同じ倍率でイメージを作成します。スケール バー = 0.5 mm.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

プロトコルでは、通常の大気酸素濃度下での低酸素症が発生しているショウジョウバエ幼虫を識別する簡易測定法について説明します。このプロトコルでは、低迷や低成長などの重複する表現型を示す他の変異体と区別される低酸素の幼虫をことができます。

潜入/トンネル用キイロショウジョウバエ幼虫における低酸素の検出

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

7.7K ビュー.  Rice University. プロトコルでは、通常の大気酸素濃度下での低酸素症が発生しているショウジョウバエ幼虫を識別する簡易測定法について説明します。このプロトコルでは、低迷や低成長などの重複する表現型を示す他の変異体と区別される低酸素の幼虫をことができます。

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Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

神経科学

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

幼虫給電回路の機能解析ショウジョウバエ</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

行動学

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

パスの長さのプロトコルを採餌<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

ショウジョウバエの幼虫フォトタキスの分析のための光スポットベースアッセイ

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

生物学

Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: A Method to Assess Tissue Hypoxia in Fly Larvae

Source: Qiang, K. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57131/" target="_blank">A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video shows a method to test hypoxia in Drosophila larvae by assessing their burrowing and tunneling abilities. Using this technique researchers can distinguish larvae experiencing oxygen deprivation from those with developmental deficits. The example protocol demonstrates the setup for this assay.

ショウジョウバエ穴を掘るおよびトンネリングの試金術:ハエの幼虫のティッシュ低酸素率を評価する方法

Source: Qiang, K. M., et al. A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (2018).
This video shows ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）

幼虫

Fly Climbing Assay: A Method to Test General Locomotion in Drosophila melanogaster

Source: Gevedon, O., et al. <a href="https://www.jove.com/video/59720/in-vivo-forward-genetic-screen-to-identify-novel-neuroprotective">In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a simple method to quantify fly locomotion and shows the climbing assay performed.&#160; The fly climbing assay is a general test of motor function which relies on a negative geotaxis response.

フライクライミングアッセイ:Drosophila melanogasterの一般的な移動をテストする方法

Source: Gevedon, O., et al. In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
This ...

潜入/トンネル用キイロショウジョウバエ幼虫における低酸素の検出

要約

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アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

幼虫給電回路の機能解析ショウジョウバエ

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

パスの長さのプロトコルを採餌

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化

ショウジョウバエの幼虫フォトタキスの分析のための光スポットベースアッセイ

ショウジョウバエ穴を掘るおよびトンネリングの試金術:ハエの幼虫のティッシュ低酸素率を評価する方法

フライクライミングアッセイ:Drosophila melanogasterの一般的な移動をテストする方法