この方法は、オープンソースソフトウェアに基づいており、記録されたビデオから成虫と幼虫のハエの追跡行動について局所的な運動活動を体系的に評価します。この方法は、行動を記録および分析するための低コストのデバイス統合を必要とするため、ハエの移動をスクリーニングするための手頃な価格で効果的なアプローチになります。この技術は、局所運動障害のあるヒト疾患のハエモデルにおける行動変容の同定に用いられているが、疾患、障害、困難の治療には適していない。
分析プロセス中に関連するビデオウィンドウ、つまり元のビデオウィンドウと処理中のビデオウィンドウをクリアすることが不可欠です。まず、製造元の指示に従って、シリカキットの試薬Aと試薬Bを1対10の比率で混合し、ショウジョウバエの移動追跡用のオープンフィールドアリーナを準備します。次に、HDカメラを三脚にセットし、カメラのレンズがシリカアリーナの表面に垂直になるように調整します。
次に、フィジーでビデオを開きます。進行状況バーを最初のフレームにドラッグし、暗黙のうちに承認します。フリーハンド選択ツールを使用してフライの全身を選択します。
画像、調整、明るさとコントラストをクリックして、選択した領域のグレー値が広い背景に近づくまでホワイトバランスを調整します。麻酔をかけたフライをオープンフィールドアリーナに移します。ハエが麻酔から回復したら、ハエと一緒にアリーナディッシュをカメラの下に置き、左右にすばやく振って、記録の開始時にハエが動いていることを確認します。
カメラアプリケーションの録画ボタンを押して、ビデオ録画を開始します。録画が完了したら、停止ボタンを押してビデオ録画を終了します。録画したビデオをMJ異教徒コーディングでAVI形式に変換して、フィジーを使用して開いて分析できるようにします。
また、ビデオのフレーム/秒を、成虫のハエの場合は15 fps、幼虫の場合は12 fpsに設定します。フィジーでビデオを開くには、ポップアップウィンドウで2つのオプションを選択し、仮想スタックを使用してグレースケールに変換します。動物トラッカープラグインのアクティブな画像の設定ツールを使用して処理ウィンドウを取得し、楕円形ツールを使用して元のビデオウィンドウのアリーナを一周する追跡領域を作成します。
処理ウィンドウの最初の空白フレームのフィルターと 2 つのフィルターのパラメーターを設定します。次に、元のビデオウィンドウの次のフレームを選択し、処理ウィンドウのフィルタリングされたサーフェスを選択します。フィルタリングされた処理ウィンドウを選択したら、[しきい値の設定]ツールを使用して、処理ウィンドウで覆われた赤いプロファイルでトラクトフライを回転させます。
次に、set blob 検出器を使用して、処理ウィンドウで覆われた赤いプロファイルでハエをコンピューターに認識させます。テキスト原稿に記載されているように、成虫のハエまたは幼虫の最後のフレームを設定します。BLOB の表示ツールを使用して、元のビデオ ウィンドウに追跡用の四角形を表示します。
追跡を開始し、監視が完了したら追跡ファイルをエクスポートします。動物トラッカーと追跡アナライザープラグインを使用して、追跡ファイルとゾーンファイルをロードします。ゾーン設定を使用して目的のインデックスを選択し、パラメーター設定を変更します。
フレームレートを使用してフレーム間隔の時間を計算します。トラッキングアナライザーで分析した後、スプレッドシートソフトウェアとグラフパッドプリズムを使用して定量分析チャートを作成します。トラックファイルを開きます。
すべての座標を Microsoft Office Excel にコピーし、スペース キーを使用してセルを分割します。フレーム間隔あたりの不動時間を計算するには、すべての計算結果を選択し、縦棒グラフを挿入して、縦棒グラフ全体の余白で不動時間を視覚的に表示します。方向角度の変化を示すには、すべての計算結果を選択し、散布図を挿入します。
ロテノンで処理された成虫のハエと3齢幼虫は、溶媒DMSOを与えられた対照のハエと比較して有意な自発運動障害を持っていました。成虫のロテノン処理の定量分析では、移動距離と平均速度の有意な減少が示されました。そして、不動時間の大幅な増加。
代表的なグラフは、対照のものと比較して、ロテノンを給餌したハエのフレーム間隔あたりの移動速度のピークが少ないことを示し、自発運動活動障害の重症度を示しています。フレームあたりの移動ピクセルの制度的不動列も、対照ハエと比較して、ロテノン給餌ハエの1分以内の動きが有意に少ないことを示しました。ロテノン給餌動物および対照動物における移動方向角変化を示す代表的なグラフも、ハエが選択した方向の変化を明らかにした。
同様の結果は、3齢幼虫についても観察されました。その結果、ロテノンを給餌した追跡幼虫の行動運動は、対照と比較して著しく損なわれていることが明らかになりました。分析プロセスの最も重要なステップは、ソフトウェアが効果的にチェックできるかどうかを証明するため、最初の空白フレームを形成することです。
この技術により、研究者は神経や筋肉の損傷などの複数の欠陥の根底にあるメカニズムをより深く掘り下げることができます。
