光スポットアッセイを使用して、幼虫の挙動を光領域に入る前、中、および後に追跡することができ、幼虫の動きの詳細を分析することができます。このアッセイは簡単で、実行しやすいです。光応答は1回だけテストされるため、光の適応の可能な効果を除外することができます。
寒天プレートを準備するには、ゆっくりと均等に熱い1%寒天の約4ミリメートルの厚さの層で15センチメートルペトリ皿の底をカバー。寒天が固まるまでプレートを室温で冷却します。視覚刺激システムをセットアップするには、準備した LED 光源を鉄フレームにクリップし、ライトがデスクトップに向かって投影するように注意します。
円柱平面と垂直面の間の角度が約 10 度になるまで、円柱を少し傾けます。470ナノメートルの青色LEDライトを、ハイパワーLEDドライバのLED 1プラグに接続し、ドライバの電源を入れます。ドライバーの右上隅にあるノブを回してチャンネル470ナノメートルを選択し、LEDをクリックします。
画面にチェックが表示されると、デスクトップに青色のライトスポットが表示されます。[OK]をクリックし、ノブを回してライトの強度を調整します。光源の位置を上下に移動して、ライト スポットの直径を 2 センチに調整します。
ノブを回転させて、実験要件に従って光強度を選択します。標準フォトダイオードパワーセンサー付きのコンパクトパワーメーターコンソールを使用して、その場で最大および最小限の光パワーを測定します。実際の実験では、光の電力を暗闇の中で測定する必要があります。
次に、光の電力を記録し、それを3回測定し、平均値を使用します。イメージシステムを設定するには、高解像度のウェブカメラをデスクトップのライトスポットの上に約10センチメートル上の鉄クリップでクランプし、カメラレンズのデスクトップ方向を調整します。USB インターフェイスを介して Windows 7 を実行しているコンピューターにカメラを接続し、カメラのすぐ下のデスクトップに寒天プレートを配置します。
AMCap 9.22 ソフトウェアを開くと、ライト スポットが AMCap ウィンドウに自動的に表示されます。カメラを少し左右に動かして、ライト スポットが窓の中心付近に位置するようにします。クリップを使用して、カメラのすぐ下5〜7ミリメートルの850プラスマイナス3ナノメートルのバンドパスフィルタを固定します。
プレートの端から約5cm離れた寒天プレートの周りに、プレートに向かって70度の角度でLEDレンズを使用して、中心波長850ナノメートルの3つの赤外線光を生成するLEDを配置します。次に、ACとDCコンバータを介してLEDを電源に接続します。AMCap ソフトウェアのメニューで、オプション、ビデオ デバイス、キャプチャ形式を選択し、キャプチャしたビデオのピクセル サイズを 800 x 600、フレーム レートを毎秒 60 フレームに設定します。
フィルタを外し、カメラの下にルーラーを配置します。スケールラインがビデオフィールドの幅に対して明確かつ平行になるまでカメラのフォーカスを調整し、[キャプチャ]、[設定]、[ビデオ キャプチャ]をクリックしてセーブ パスを選択します。次に、[記録開始]をクリックして600ピクセルに対応する実際の距離を記録し、各ピクセルと実際の距離の比率を計算します。
幼虫をイメージング設定に導入する前に、光位置の短いビデオを取得し、フィルタリングされていないコントロール背景ビデオライト領域1に名前を付けます。カメラレンズにフィルターを戻し、実験装置から遠く離れた光をできるだけ低い設定で点灯し、幼虫をはっきりと観察できるようにします。スプーンを使って培養培地から幼虫を取り除き、3番目のインスター幼虫をそっと選びます。
幼虫を蒸留水で洗い、幼虫を寒天プレートの中央に置きます。幼虫から余分な水をそっと取り除き、部屋の明かりを消します。幼虫が暗い環境で2分間順応してから、赤外線LEDライトを点灯させます。
以下の光回避行動実験は、暗闇の中で行う必要があります。デモンストレーションの便宜のために、我々は明るい光の中で撮影しました。幼虫をプレートの中央にそっと磨きます。
幼虫がまっすぐ這い始めると、プレートを回転させて幼虫の頭を光のスポットに向かわせてください。[キャプチャ]、[セットアップ]、および [ビデオ キャプチャ] をクリックして保存パスを選択し、[記録を開始] をクリックして録画します。幼虫が光の場所に向かってクロールできるようにし、光の場所を離れて、ほぼ視野に入るまで、[記録を停止]をクリックします。
フィルターをカメラから離して移動し、ライト スポットの位置の短いビデオを取得します。次に、ポストアッセイのフィルタリングされていないビデオライトエリア2に名前を付け、このビデオをライトエリア1ビデオと比較して、ライトスポットの位置が変更されないようにします。ここで、尾速の時間曲線、代表的な幼虫の体の曲げ角度および角速度が観察できる。
幼虫の頭部キャストの大きさは、したがって、Tdc2-Gal4ニューロンが正常な幼虫光応答に必要であることを示すペアレンタルコントロールと比較して、破傷風毒性発現によって阻害されるタコミン作動性ニューロンを有する第3のインスター幼虫において最大体曲げ角度が有意に減少する。画像処理を成功させるには、カメラがライトをブロックせず、ライト スポットが丸く、ウィンドウの中心付近に位置していることを確認します。この手順に従って、光遺伝学は、特定のニューロンが活性化されたときに幼虫がどのように反応するかを観察するために行うことができる。
このアッセイを用いて、幼虫運動の詳細を分析し、環境および内部要因が幼虫光回避行動に及ぼす影響を研究することができます。
