昆虫の精母細胞の染色体の顕微操作

この方法は、スピンドルチェックポイントを満たす際の緊張の重要性、およびミオシスにおける染色体挙動における紡錘付着の役割など、細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実験者が生きている細胞内の染色体に緊張を加えたり、再配置することを可能にする非致死的な技術である。開始するには、直径20ミリメートルの円形の穴が中央から切り取られた75 x 25ミリメートルのスライドを準備します。

その後、25%25ミリメートル番号1.5カバースリットをブンゼンバーナー炎を2秒間実行します。ガラススライドの穴の端に真空グリースを塗布します。次に、カバースリップを穴の上に置き、それを押して密閉します。

スライドを裏返し、新しく作成した解剖をハロカーボンオイルでよく満たします。いくつかの大人の雄のコオロギを取得した後、切除ハサミを使用して、翼の芽の真後ろにある腹部の長い軸に平行な後ろ面を切断します。その後、腹部を静かに絞り、外骨格の切り傷を通して精巣を押し出します。

鉗子を使用して、分離精巣を解剖によく入れる。解剖顕微鏡の下で、精巣を小さく分割し、脂肪を取り除くために細かいポインティング鉗子を使用してください。次いで、精巣の内容物を蓋スリットの表面に油の下に広げる。

広がった部分が肉眼で見えるまで精巣の内容を広げ続けます。必要に応じて、追加の油性解剖井戸を使用することができます。まず、ガラス管の端をブンゼンバーナーの炎の中に入れます。

チューブの端部を保持して、150 度の角度と狭いガラスチューブの拡張領域を作成します。薄い領域でチューブを分割して、以前に作成した角度から延長する薄い領域の長さが約 10 mm になるようにします。マイクロフォージを用いて、ガラス針の先端を溶融し、マイクロフォージの針と白金線との間に45度の角度を形成する。

次に、ガラスをワイヤーから引き離し、同時に熱を消します。前に準備したスライドを反転相コントラスト顕微鏡のステージに置きます。次に、分割セルを見つけ、可能な限り低い倍率を使用して視野の中央に配置します。

マイクロニードルをマイクロマニピュレーターの針ホルダーに入れる。次に、マイクロニードルを顕微鏡の光路に手動で配置する。細胞を含む平面の上に顕微鏡に焦点を合わせます。

次に、ジョイスティックコントローラを使用してマイクロニードルを数回再配置し、x軸とy軸の針の影を見つけます。先端の位置が見えるまで針の位置を再調整し、次に、先端が焦点になるまでz軸に沿って針の位置を調整する。次に、細胞に再び焦点を合わせ、顕微鏡を細胞面のすぐ上に焦点を合わせます。

次に、この焦点面で先端が焦点になるように針の位置を再配置する。高倍率と高感度設定を使用して、このプロセスを繰り返します。セルに再び焦点を合わせ、その位置を調整して、視野の中央に残ります。

ジョイスティックを使用して、細胞内の染色体を押し回すマイクロニードルを制御します。針先がセルの上の平面に残っていることを確認します。染色体を動かすには、細胞の上部付近の染色体に焦点を合わせます。

次に、ジョイスティックの z 軸を調整して針先に焦点を合わせ、x と y のジョイスティックで針を動かします。目的の染色体に直接針の先端を置き、目的の方向に押します。染色体とスピンドルを分離するのに十分なテンションを適用します。

最後に、染色体を細胞内の任意の場所に置きます。このプロトコルを使用すると、マイクロマニピュレーションを使用して、スピンドルから染色体を再配置、テンションを適用、および完全に切り離すことができる。この例では、2つの操作された染色体は、マイクロマニピュレーション針で絶えずナッジされることによって、スピンドルに再び付着しないようにした。

マスター化後、サンプルを操作用に準備し、マイクロマニピュレーターを15~20分で配置できます。マイクロマニピュレーションの実験は、数秒から数時間かかる場合があります。この手順を試みる間、カバースリップから最も遠い細胞の側面にある染色体を操作することを忘れないでください。

その開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者がバッタと祈るカマキリのスピンドルチェックポイントを探索する道を開きました。