ゼブラフィッシュは、相同染色体ペア、シナプス、組み換えを含むmeiosの染色体事象を研究するための優れた脊椎動物モデルとして浮上しています。この核表面拡散プロトコルは、超解像顕微鏡を用いて、大染色体アーキテクチャの主要な特徴を可視化することを可能にしました。研究者は、他のゼブラフィッシュスプレッドプロトコルよりも少ない破片でスライドあたり何百もの十分に広がる核を期待することができます。
この手順の最も技術的に困難な部分は、皮膚に近接し、他の器官にも付着しているので、ゼブラフィッシュ精巣の解剖です。解剖手順を視覚化することで、研究者は動物の組織に埋め込まれた生殖腺を見たときに何を期待するかを知ることができます。オスのゼブラフィッシュを安楽死させた後、小さなはさみで一度に1匹の魚を切断し、マイクロハサミを使って腹側の正中線に沿って切断して体腔を露出させます。
シリコーンコーティングされたペトリ皿に魚を入れ、1X PBSの浅いプールで覆います。1.65倍の倍率で顕微鏡の下で、鉗子を使用して精巣を解剖する。精巣からできるだけ多くの脂肪と周囲の組織を取り除きます。
周りの脂肪は少し暗い外観を持っている可能性がありますが、腺は解剖スコープの光の下に半透明に表示されます。脂肪のいくつかの量は、手順を妨げることなく、生殖腺に残される可能性があります。解剖された精巣を2ミリリットルのDMEMを用いた5ミリリットルチューブに直接加え、氷の上に置いてください。
精巣細胞を解約するには、精巣で5ミリリットルチューブに200マイクロリットルのコラゲターゼ溶液を加える。溶液を数回反転して混ぜます。32°Cで100 RPMでインキュベーターシェーカーで精巣をそっと振ります。
10分ごとにチューブを迅速に反転し、解離を容易にします。1 時間後、DMEM は曇りになり、精巣は小さな塊になります。精巣はコラゲラーゼでインキュベートされている間、摂氏37度に0.1モルスクロース溶液の100マイクロリットルを前温。
コラゲターゼを洗い流すために、DMEMを5ミリリットルの最終体積に加え、チューブを数回反転します。ペレットは、室温で3分間200gで精巣を出す。上清の3ミリリットルを取り除き、2ミリリットルしか残らないようにします。
DMEMを2回繰り返します。最後のDMEM洗浄後、上清を4ミリリットル除去し、DMEMを1ミリリットル、トリプシン溶液200マイクロリットル、DNase I溶液20マイクロリットルを添加します。チューブを数回反転して溶液を混合します。
100 RPMで32°Cで管を水平に振ります。解離を容易にするために、5分ごとにチューブを迅速に反転させます。5 分から 15 分経過すると、DMEM ソリューションには束がほんのわずかしか含み欠かねます。
トリプシン阻害剤溶液500マイクロリットルとDNase I溶液50マイクロリットルを加えます。チューブを数回反転して混合し、室温で3分間200gで短時間スピンダウンし、チューブキャップまたはチューブの側面に付着する可能性のある液体または塊を取り除きます。チューブを氷の上に置き、残りの塊の解離を容易にするために、プラスチックトランスファーピペットで繰り返しピペットを上下に2分間繰り返して細胞懸濁液を再中断します。
セル懸濁液が移管ピペットの球根に入らないようにします。その後、DMEMで100ミクロンのセルストレーナーを事前に湿らし、氷の上の50ミリリットルチューブの上に置きます。プラスチック転写ピペットを使用して、ストレーナーを1滴ずつセルサスペンションに移します。
プラスチック転写ピペットを使用して、新しい5ミリリットルチューブに濾液を移します。フィルタの下側に接続されているプールされたセルを収集してください。DMEMをチューブに加え、最終体積5ミリリットルにします。
細胞を室温で5分間200gでペレット化する。ペレットを邪魔することなくできるだけ多くの上清を取り除き、5マイクロリットルのDNase I溶液をペレットに直接加えます。その後、空のマイクロ遠心チューブラックに沿ってチューブの外側の底部を4〜5回静かに削ることによって、ペレットをDNase I溶液と混ぜます。
5ミリリットルの最終体積にDMEMを加え、チューブを数回反転させることによって溶液を混ぜます。細胞懸濁液を200gで2分間室温でペレット化する。DMEMを添加しても再懸濁されたペレットが凝集しなくなるまで、DNase処理をさらに1~3回繰り返します。
最後のスピンの後、ペレットを邪魔することなく、できるだけ上清を取り除く。次に、1X PBSの1ミリリットルを加え、空のチューブラックに沿ってチューブの外側の底部を静かに削り取ってペレットを再中断します。細胞懸濁液を200gで5分間ペレットし、ペレットを邪魔することなくできるだけ多くの上清を除去する。
200マイクロリットルのピペットチップの端から3ミリメートルをカットし、開口部を広げます。カットピペットチップで、ペレットを0.1モルショ糖溶液の80マイクロリットルで上下にピペット処理して再懸濁します。細胞懸濁液を室温で3分間座らせます。
次に、ピペットチップで、100マイクロリットルの1%ホルムアルデヒドを0.15%トリトンX-100でコーティングします。次に、スクロース細胞懸濁液の18マイクロリットルを、長いエッジに垂直な直線でスライドの中央に加えます。スライドを前後に傾けると、セルのサスペンションが全角に広がります。
わずかに割れたオープン湿度室にスライドを平らに置き、ホルムアルデヒド溶液が乾燥するのを防ぎます。湿度室を一晩暗い引き出しに入れます。午前中は、湿度室から蓋を取り外し、スライドを完全に乾燥させます。
コプリン瓶にスライドを置き、蒸留水でコプリン瓶を満たします。室温で穏やかな揺れで5分間インキュベートします。水を注ぎ、1〜250湿潤剤で瓶を満たします。
室温で穏やかに揺れながら、それぞれ5分間2回洗います。スライドが完全に乾燥し、染色されるまでマイナス20度で保存します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ精子細胞の広がりを調製し、視覚化する方法を概説し、重なり合う核を十分に広げる。
左のパネルは、重症の3つの段階、レプトテン、初期のジゴテン、パキテーンを示しています。テロメアは各段階に対して染色されたマゼンタであった。DNase Iの治療不足による品質の悪いスプレッドの例を以下に示します。
SYCP3に染色された滑心染色体は、細胞がスライド上に適切に広がるのを防ぐ粘性スクロース細胞懸濁液による重なり合う核を示す。出発物質の正しい量から始め、トリプシンで適当な時間ゼブラフィッシュの精巣を治療し、必要な数のDNase I治療を失敗として行うことは、非常に少数の核または塊状核につながる可能性があるため、非常に重要です。ホルムアルデヒドを使用する場合は、常に適切なPPEを着用する必要があります。
拡散手順に従って、染色体は、様々な染色体構造だけでなく、二本鎖の破断を可視化し、タイミング依存性と、meioticイベントの局在化を分析することができる。私たちの技術は、ゼブラフィッシュが染色体の特徴とテロメアブーケに基づいてマウスよりもヒトの精子形成のより良いモデルであるかもしれないことを示す道を開きました。
