この作品は、自然科学および工学研究審議会のカナダ [朝発見グラント 5026]、次世代がん研究会 [朝 21531] から科学者奨学金のサポートされていました。ジャン ・ フランソワ ・ Lucier にありがとう統計分析にフィジー Python スクリプトやアドバイスの優秀な品質管理を提供します。もし固定ソリューション レシピありがとう博士ステファニー A. Yazinski。レーザー パワー測定のヘルプありがとうポール リュドヴィク化のパターン。

1. 細胞の前感作性
<ol><li>マイクロ照射実験前に 24 h 種 FB 8 も培養の 405 nm レーザ光と優れたイメージングの最大透過率を確保するため 170 μ m 厚 coverslip のようなガラス/樹脂底付きスライド 1 x DMEM 含む 10% の井戸あたり U2OS セルが 40,000 セルレーザー走査共焦点顕微鏡を反転します。8 も microslide を使用している場合、すべての後の治療とプロトコルの洗浄手順ウェルあたり 500 μ L のメディアまたはソリューションを使用します。 注: 自分のフラットの形態のための密着が良好と大きな核の U2OS 細胞の発見を容易タンパク質マイクロ照射のサイトで募集が、必要に応じて、その他の付着性のセル型を使用できます。細胞が 80% を理想的にする約必要がありますの数を増やすにマイクロ照射時の confluency 照射実験ごとのセル。非常に高い合流9細胞周期の S および G2 段階で行われる相同組換えなど、特定の修復経路を混乱させることができる細胞周期変化可能性があります。</li>
	<li>5% CO2、37 ° C で一晩細胞をインキュベートし、(手順 1.3) でセルをあらかじめ感光性 BrdU (手順 1.4) または BBET (ヘキスト 33342)。 注: (ポイ) DNA 病変へのタンパク質のライブ募集を観察するには、transfect または細胞播種後蛍光タンパク質とポイ 24 h の融合を運ぶプラスミッド DNA を変換します。24 h 後-transfection/伝達、事前に敏感し、リアルタイムで DNA 損傷部位でポイの募集を監視する細胞をマイクロ照射します。</li>
	<li>405 nm レーザーに博覧会によって生成される Dsb の数を増やす、BrdU の 10 μ M をマイクロ照射前に 24 h のメディアに追加します。マイクロ-照射、マイクロ ピペットを使用して前に 405 nm レーザーにセルの最大の露出を確保するためフェノールレッドなし中で 2 回細胞をすすいでください。</li>
	<li>また、10 μ g/ml 37 ° C で細胞培養のインキュベーターで適切な培地で BBET と 15 分のためのセルを扱う治療後、フェノールレッド マイクロ照射前にせず中で 2 回すすいでください。</li>
</ol>2. 細胞マイクロ照射
<ol><li>適切なレーザー スキャンの顕微鏡を選択します。 注: ここに示した実験は 50 mW 405 nm レーザー線、63 X 1.4 開口石油目的を備えた顕微鏡システムで行った。Dsb を生成する細胞がマイクロ照射 1 × 1,024 x 1,024 ピクセル/フィールド (63 倍の倍率で 0.21 μ m/ピクセル) でスキャン ズームと単方向モードでは 8 μ s/ピクセルで。使用されるレーザーの電力は 25%、BBET と BrdU-前-増感細胞の 80% であった。ユーザーが彼らのシステムを構成するには、提案システムのレーザー パワー後目的は、製造元の指示に従って電源メーターを用いて測定しました。測定値が 2.6 に対応して mW と 7.0 mW の BBET と BrdU-前-増感細胞、それぞれ。</li>
	<li>
顕微鏡と環境制御チャンバーを入れます。
	<ol>
<li>サンプルはステージ上での定温器細胞に不必要なストレスを避けるために、実験全体で均質な DDR の速度を確保するために置かれる前に、商工会議所を 5% CO2と 37 ° C に設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
よく分散セルとフィールドを選択、フォーカスを調整し、場合プロトコル後イメージの獲得を促進する彼らの位置を登録します。タンパク質募集マイクロ照射後の反応を監視するため前損傷参照ポイントとして機能する少なくとも 1 つのイメージを取得します。 注: グリッド培養容器は、後続の手順でマイクロ照射細胞のローカリゼーションを促進するまた使用可能性があります。<ol>
<li>BBET 標識細胞を用いた場合の実験、不当な DNA 損傷を避けるため、細胞を可視化するための十分な最低レーザーの消費電力 405 nm レーザーを用いた細胞焦点を調整します。<ol>
<li>ランプから放射される紫外線は照らされたサイトで DNA 損傷を誘発する、BBET 染色性細胞にフォーカスを調整する広視野蛍光を使用しないでください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>BrdU 標識細胞を使用している場合は、サブ核小体などを見ることによって差動干渉の対照 (DIC) または位相コントラスト イメージングを使用してフォーカスを調整します。</li>
		<li>蛍光標識したランドマークを発現する細胞を使用している場合は、代表的な蛍光強度とフォーカル プレーンを選択します。 注: は、人工ローカライズ可能性があります強力な過剰発現、POI の非常に高いレベルを発現する細胞を避けてください。さらに、匹敵するレベル (安定したクローンの選択ポイ式および採用レベルの変動を最小限に抑える推奨) でポイを表現するセルを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>システムの退色 (FRAP) _module 後蛍光回復を使用してマイクロ照射ステップの顕微鏡を構成します。 注: セットアップ顕微鏡システムのマイクロ照射実験を検討する最も重要なパラメーター: 405 nm のレーザーは、回数 (すなわちレーザーは同じ座標に行く回の数) の出力電力ピクセル/フィールドの数 (倍率と 1 ピクセル解像度 1,024 × 1,024 X 63 = 0.21 μ m)、およびピクセルあたりの滞在時間。これらすべての要因は細胞が発生するエネルギーの量に影響を与える、従って量と DNA の種類損傷生成された (見なさい議論線量最適化の詳細)。</li>
	<li>細胞をマイクロ-照射顕微鏡システムの FRAP モジュールを使用する。 注: ほとんどのシステムで複数のセルのマイクロ照射実行できます単一のフィールドに斑点や線/長方形 (通常 1-2 μ m 幅) として。蛍光標識したタンパク質のライブ イメージングを実行するときは、すぐに損傷後、各セルのマイクロ照射にかかる時間を DDR の遅延誘導になりますのでマイクロ照射フィールドごとにセルの数が少ないを制限します。これは、DNA 損傷に非常に急速に補充される蛋白質を監視するときに特に重要です。</li>
	<li>
マイクロ照射、ウェル スライドやプレートに戻す 5% CO2と 37 ° c の定温器の場合のサンプルを処理する前に必要な期間 (セクション 5) 後すぐにライブ イメージングを続行または (セクション 3)。
	<ol>
<li>最初のステップとして、数分以内、場合プロトコルのいくつかの時間後照射までセルを修正します。ポイは、に応じて募集速度が異なる場合があります。通常、Dsb と SSBs でクロマチン関連蛋白質は病変に非常に急速にローカライズされます、5 分以内は時々 削除します。SsDNA で組み立てるものなどいくつかの要因は切除機械エンゲージに後時点で募集して時間 (参照してください図 1および参照4) そこに残る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ライブ イメージング蛍光標識したタンパク質
<ol><li>マイクロ照射細胞タイムラプス イメージングを実行します。病変に非常に急速に補充される、フレームあたり数秒が理想的ですが、獲得後 (例えば、切除要因)、破損している領域にローカライズする蛋白質のため可能性があります蛋白質は、高原が達成されるまで 1-2 分ごとを実行。 注: 漂白可能な限り避けるために、タンパク質損傷のサイトで募集が信号の定量化を妨げることは彩度を到達しないようにイメージ獲得のためのレーザー出力を最小化し、その後分析 (データの分析を参照してください。セクション 4)。63 X 提示システムで行われていたイメージング/1.4 油客観的 8 μ s/ピクセル滞留時間、解像度 1,024 × 1,024、1 X ズームを使用して、2 の平均します。これらのパラメーターが他のシステムや異なる実験用に最適化する必要があることに注意してください。</li>
	<li>マイクロ照射 15 30 セルのカイネティクス測定まで追加のフィールド内のセルを取得します。精度と募集動態の再現性を確保するため生物的複製の少なくとも 3 回実験を繰り返します。 注: 特定の共焦点システムにこのプロトコルを適用するときことができます知られている蛍光標識したゲノム維持因子の募集速度を監視することによって開始する (例えば、53BP1 GFP RPA32 GFP 等)。マイクロ照射条件を最適化するライブ イメージングを使用すると、急速に複数のパラメーターをテストするユーザーができます。</li>
</ol>4. 募集動態解析
<ol><li>フィジー画像解析ソフトウェア11Microirradiation 解析プラグイン10をインストールします。</li>
	<li>
フィジーで取得した画像を開きます。Microirradiation 解析スイートのプルダウンのプラグイン メニューから「損傷アナライザー」を選択します。各マイクロ照射セルの利子 (ROI) (通常 3 x 3 μ m)、および非照射と照射・ ロワの背景領域を定義する画面の指示に従ってください。
	<ol>
<li>潜在的なバイアスを最小限に抑えるために同じサイズの使用・ ロワは、信号強度を意味します。取得した画像は、ベースラインとしてマイクロ照射のサイトで募集を監視するために使用が、少なくとも 1 つの予備照射フレームを含めるも。</li>
		<li>投資収益率のすべてのデータが完全にコマ撮りシリーズ以上収集されると、csv (コンマ区切りファイル) または txt (タブ区切りファイル) として結果を含むプラグインによって作成されるファイルを保存します。このファイルには、各時点の各 ROI (意味強度の背景、意味強度非照射および強度の照射の意味) 平均強度の測定が含まれています。 注: プラグインは自動的にバック グラウンド強度を減算 (私b) 照射された陰影の強度から (私s) と非照射・ ロワ (私n)。また、退色 (照射/非照射) を補正するため両方の値 (下記参照) の比率を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57410/57410eq1v2.jpg"> プラグインはまた最初の時点 (値 1 に設定) とすべての正規化を計算各核 (最初の時点を基準にして比) 他の時間ポイント。プラグインのウェブサイト10で追加情報を見つけることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
すべてマイクロ照射細胞 (少なくとも 15-30 セル) のプラグインを使用して分析を実行し、時間をかけてマイクロ照射領域の相対的な強化の平均をグラフ化します。各データの平均値の標準誤差をポイントし、プロットを計算します。
	<ol>
<li>学生のtを実行することによって 2 つの実験条件の募集動態の違いを確認-各データ ポイントのテスト。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 場合プロトコル
<ol><li>
場合ソリューションを準備します。ソリューション extraction 事前準備 (0.25% を含む冷たい 1 × PBS トリトン X-100)、ソリューションの洗浄 (0.05% を含む 1x PBS トゥイーン 20)、ソリューションをブロック (3 %bsa および 0.05% を含む 1x PBS トゥイーン 20) と (3% + ショ糖 2% パラホルムアルデヒドの固定の解決PBS 1 で x) ポリプロピレンの円錐管に。 メモ: 単一 8 ウェル microslide 前/後 extraction 溶液 50 mL 洗濯ソリューション、ブロッキング溶液 10 mL、5 mL の固定の解決の 10 mL が必要です。<ol>
<li>固定の解決を準備します。<ol>
<li>化学のフードの下でパラホルムアルデヒドの 15 g と 30 μ L を 1 L の三角フラスコに 10 N NaOH の二重蒸留水 (ddH2O) の 400 mL を混ぜます。</li>
			<li>完全に、パラホルムアルデヒドの可溶化攪拌しながらコンテナーと磁性攪拌器ホット プレート上 65 ° C で熱を閉じます。</li>
			<li>25 mL のピペットを使用して、PBS、攪拌、および 0.45 μ m のフィルターを使用してフィルター X 10 の 50 mL を追加します。</li>
			<li>ショ糖の 10 g を追加し、ddH2o. と 500 mL に完了</li>
			<li>15 mL コニカル管; のソリューションの約数使用するまで-20 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>染色液 1 mg/mL の 1x PBS で 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 縮尺の原液を希釈して核を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロ ピペットを使用して、マルチも顕微鏡のスライドやプレートの井戸からメディアを慎重に取り外し、すぐに 2 回待つことがなくソリューションを変更する場合は洗浄液の 500 μ L で洗ってください。 注: ここで示した場合データは洗浄され、すべてのソリューションを 500 μ l 添加培養 8 ウェルの顕微鏡スライドで育った細胞を使用して得られました。ボリュームは、実験者によって使用される細胞培養容器によって調整する必要があります。さらに、細胞がガラス/樹脂底からデタッチできます簡単に、細心の注意でもしプロトコルを実行します。セル損失を最小限に抑えるためにすべてのソリューションの変更のピペットを使用します。</li>
	<li>氷上インキュベート ソリューション extraction 前と 15-30 s 前の抽出を実行するための手によって優しく旋回ステップする場合冷たい 500 μ L で 5 分最も細胞質および核質の蛋白質を削除し、クロマチンから信号を最大化/DNA 関連の要因。</li>
	<li>500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。</li>
	<li>場合の固定の解決の 500 μ L に室温で 15 分間インキュベートします。また、固定ステップの既製パラホルムアルデヒド溶液 (3-4%) を使用します。</li>
	<li>500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。</li>
	<li>冷たい場合はプリ/ポスト extraction ソリューションの 500 μ L で 5 分間氷の上を孵化し、透過ステップを実行する手で優しくスライドを渦します。</li>
	<li>500 μ L の場合は洗浄液で 2 回洗浄します。</li>
	<li>ブロッキング液の場合の少なくとも 30 分間 500 μ L で室温で孵化させなさい。</li>
	<li>マイクロ ピペットを使用してブロッキング液を削除し、ソリューションをブロックで希釈した 250 μ L 一次抗体と 4 ° C で加湿チャンバーで一晩インキュベートします。 注: の共局在の潜在的な人工物を避けるために順番に一次抗体の孵化を実行ことをお勧めです。適切なコントロールを実行すると、同時に、プロセスをスピードアップする一次抗体をインキュベートします。</li>
	<li>4 回穏やかな攪拌 (上 60 rpm) の場合は洗浄液の 500 μ L で 5 分間洗ってください。</li>
	<li>加湿チャンバーでブロッキング液で希釈した二次抗体の 250 μ L で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。 注: は、蛍光標識した二次抗体の添加によって光からサンプルを保護します。</li>
	<li>穏やかな攪拌の場合洗浄液 500 μ L にそれぞれ 5 分間で 4 回を洗浄します。</li>
	<li>1x PBS 1 μ G/ml の核を染色 DAPI を含む 500 μ L で 5 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>500 μ L の 1x PBS で 2 回洗浄し、細胞イメージングのための PBS ソリューション x 1 の 500 μ L のまま。</li>
	<li>グリッドのスライドまたは登録ステージ位置を使用して、検索よ特徴付けられた DNA 損傷マーカーを用いたマイクロ照射細胞 (例えばγ-H2A.X、RPA32、等)。</li>
	<li>ウェル文化スライドまたはレーザー走査型共焦点顕微鏡の適切な設定を使用してすべての関連するチャンネルのプレートをイメージします。 注: 示されたシステムのイメージングは 63 X で行われました/1.4 油客観的 8 μ s/ピクセル滞留時間、解像度 1,024 × 1,024、1 X ズームを使用して、2 の平均します。これらのパラメーターが他のシステムや異なる実験用に最適化する必要があることに注意してください。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).</li><li>Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Introducing+Double-Strand+Breaks+into+Cellular+DNA.">A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA.</a> Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).</li><li>Polo, S. E., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+damage+response+proteins+at+DNA+breaks:+a+focus+on+protein+modifications.">Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications.</a> Genes &amp; development. 25 (5), 409-433 (2011).</li><li>Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+spatiotemporal+dynamics+of+mammalian+checkpoint+regulators+induced+by+DNA+damage.">Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage.</a> Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/">https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/</a> (2017)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Izhar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Analysis+of+Factors+Localized+to+Damaged+Chromatin+Reveals+PARP-Dependent+Recruitment+of+Transcription+Factors.">A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors.</a> Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).</li><li>Mar&#233;chal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRP19+Transforms+into+a+Sensor+of+RPA-ssDNA+after+DNA+Damage+and+Drives+ATR+Activation+via+a+Ubiquitin-Mediated+Circuitry.">PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry.</a> Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).</li><li>Dubois, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphorylation-and-ubiquitylation+circuitry+driving+ATR+activation+and+homologous+recombination.">A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).</li><li>Wan, L., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PSO4+Complex+Associates+with+RPA+and+Modulates+the+Activation+of+ATR.">The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).</li><li>Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+human+Psoralen+4+(hPso4)+complex+in+replication+stress+and+homologous+recombination.">The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).</li><li>Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+resection+at+DNA+double-strand+breaks+leads+to+de+novo+telomere+formation+and+enhances+gene+targeting.">Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting.</a> PLoS Genetics. 6 (5), (2010).</li><li>Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+double-strand+DNA+break+repair+by+homologous+recombination.">Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Scientific Reports. 5 (9592), (2015).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Dinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+multiple+DNA+repair+pathways+by+sub-nuclear+damage+induction+methods.">Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods.</a> Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells.">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).</li><li>Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Laser+Micro-irradiation+for+Examination+of+Single+and+Double+Strand+Break+Repair+in+Mammalian+Cells.">Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>Mortusewicz, O., Am&#233;, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-regulated+poly(ADP-ribosyl)ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells.">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li><li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+a+&#947;H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response.">Chemical proteomics reveals a &#947;H2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li><li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy.">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

上記の方法を使用すると、照射済み BBET または BrdU で感作細胞 - 405 nm レーザー マイクロは付着性細胞の核内で DNA 性病 Dsb のローカライズされた世代をことができます。これらの Dsb で DDR の速度は、真核細胞9,18,19の他のメソッドで生成されたものに似ています。マイクロ照射サイトで DSB 切除は ssDNA 世代 RPA32 を対象とし...

細胞は、DNA 損傷のゲノムの完全性を脅す内因性と外因性の源に常に公開されます。DDR は、シグナル伝達経路を検出、信号、およびゲノムの安定性を維持するために DNA の損傷を修復のアンサンブルです。DNA 二本鎖切断 (Dsb)、DDR が 2 つの相補的なプラットフォームを中心に発生: γ H2A.X ラベル クロマチンと ssDNA 結合複合体 RPA1,2でコーティングされた通常切除一本鎖 DNA 領域。
UV レーザー マイクロ - チミジン アナログ 5-ブロモ-2' デオキシウリジン (BrdU) または bisbenzimide エトキシド trihydrochloride (BBET、ヘキスト 33342) DNA 染料前感作細胞照射単鎖切断 (を含む DNA 損傷の混合物を作成しますSSBs) と Dsb をクロマチンと一本鎖 Dna の両方のプラットフォーム3,4ローカライズされた DDR を引き出します。前の仕事を示した場合2、5と組み合わせて高エネルギー紫外線 A レーザー (335 365 nm) を使用して、DSB でこれらの 2 つの異なるプラットフォームにゲノム維持要因の採用を差別することができます。装備されてこのようなレーザー顕微鏡は、高エネルギー レーザー、405 nm レーザを用いたレーザ走査共焦点顕微鏡よりも学術と製薬の設定でずっとより少なく流行し専用の UV A 送信目的必要と高価ですライン。蛋白質の募集とマイクロ照射サイトで交換の研究はゲノム維持要因の動的挙動を記述するために必要な骨の折れる手動画像解析による排除も。
ここでは、BrdU または BBET の核酸染色と細胞の前感作性マイクロ照射による DNA 損傷でゲノム維持因子の動態のモニタリングを可能に一般的な共焦点顕微鏡の 405 nm レーザー後に続くことを示します。改良された解像度にフィールドとデコンボリューションの大きい深さ z 積み重ねとともにプラットフォーム マーカーとして γ H2A.X または RPA 複雑な亜単位を使用できますローカルに広がるそれらから Dsb に補充される要因を区別する実験者初期病変を囲む大規模なクロマチン ドメイン。核内の異なるコンパートメントによるとこのサブ分類マイクロ照射サイトに募集される未同定蛋白質の潜在的な役割を絞り込むことができます。また、便利なプロトコルを提供し、オープン ソース ・ ソフトウェア (ImageJ 分布) フィジー6,7、8を使用してゲノム維持要因のダイナミクスをすばやく解析するパイプラインを最適化します。現在マイクロ照射方法にこれらの改良は、事実上すべての研究室の設定可能な DDR の研究をレンダリングします。

<table><tbody><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV3000 software (version 2.1)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>Radiation source</td></tr><tr><td>Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1</td><td>Okolab</td><td>OKO-UNO-1</td><td></td></tr><tr><td>60X /1.4 Objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>Oil immersion objective</td></tr><tr><td>8-well culture slides on coverglass (X-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr><tr><td>U2OS osteosarcoma human cell line</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Stable cell lines&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Caution toxic</td></tr><tr><td>5-bromo-2&amp;prime;-deoxyuridine&amp;nbsp;(BrdU)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59-14-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Caution toxic</td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.1%&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>TRX777.100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME transfection reagent&amp;nbsp;</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, + phenol red</td><td>Wisent&amp;nbsp;</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, - phenol red</td><td>Wisent</td><td>319-051-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Wisent&amp;nbsp;</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-RPA32 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2175</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;gamma;-H2A.X antibody</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>9718S</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-53BP1 antibody</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4937S</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-PRP19 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab27692</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4414S</td><td>1:250 for IF</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse&amp;nbsp; IgG Alexa Fluor 488&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4408S</td><td>1:250 for IF</td></tr><tr><td>Fiji image analysis open-source software&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>1918-K Power meter&amp;nbsp; with a 918D-SL-0D3 sensor</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigation of protein recruitment to dna lesions using 405 nm laser micro-irradiation

DNA 損傷応答 (DDR) は、検出、信号、および DNA 損傷を修復するタンパク質の茄多を使用します。この応答の輪郭を描くがゲノム維持機構の解明を理解する重要です。募集と病変における蛋白質の交換は非常にダイナミックなので、彼らの研究には迅速かつ空間的区切りに DNA 損傷を生成する機能が必要です。ここでは、我々 はローカル 405 nm レーザー ライン装備一般的なレーザ走査共焦点顕微鏡を用いたひと細胞における DNA 損傷を誘導するための手順を説明します。ゲノム維持要因レーザ ストライプは、蛍光抗体法 (IF) またはリアルタイムで評価できますの蓄積は、蛍光レポーターが付いたタンパク質を利用しました。リン酸化ヒストン H2A を使用しています。(Γ-H2A.X) x マーカーとしての複製蛋白質 A (RPA), メソッドは、隣接するクロマチンの普及からローカル募集の要因を識別するための十分な解像度を提供しています。さらにサイト被害を効率的にタンパク質染色体 DNA での動態を監視する ImageJ ベースのスクリプトを提供します。これらの改良は、DDR のダイナミクスの研究を簡単になります。

次のマイクロ照射細胞はゲノム維持蛋白質1,12の性質によっては時間の特定の期間の回復が許可されます。Dsb は RPA と他のゲノム維持要因9によってコーティングされて急速に ssDNA の限られた領域を作成する、細胞周期の S および G2 段階の最も広く、核酸分解酵素によって処理されます。この ssDNA 領域は募...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation at JoVE.com

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ ミックスを定量化するための自動化された手順を提供する手法を提案します。

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

investigation-protein-recruitment-to-dna-lesions-using-405-nm-laser

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K ビュー.  Université de Sherbrooke. DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ ミックスを定量化するための自動化された手順を提供する手法を提案します。

ビデオ: Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

遺伝学

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

がん研究

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

生化学

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

生物学

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

要約

さらに動画を探す

この動画の章

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

要約

さらに動画を探す

この動画の章

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション