Name: protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
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C-Brick標準の開発中の技術支援については、Shanghai Tolo Biotechに感謝します。この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム（助成金XDB19040200）の助成金によって支えられました。

1.crRNAの調製<ol><li> crRNAテンプレートの調製 <ol><li> RNアーゼフリー水中の個々のオリゴヌクレオチド（ 表1 ）を10μMの濃度に再懸濁する。 </li><li> 22.5μLのトップストランドオリゴヌクレオチド（ 表1の T7-F）、22.5μLのボトムストランドオリゴヌクレオチド（ 表1 ）、および5μLの10×アニーリングバッファーを0.2mLのPCRチューブに加える。総容量が50μLであることを確認する。 注：6つの異なるボトムストランドオリゴヌクレオチドが表1に示されており、その各々は、トップストランドT7-Fと個々に対合されるべきである。 表1の小文字は、crRNAのガイド配列に転写される配列を表す。 10x Taq PCRバッファーを10xアニーリングバッファの代わりに使用することができます。 </li><li> PCRチューブをサーモサイクラーに入れる。 </li><li>アニーリングプログラムを実行する：95℃での最初の変性5分間、次いで95-20℃の冷却時間（サーマルサイクラーで1分当たり1℃の減少）であった。 注：すぐにステップ1.2.1のサンプルを使用してください。 </li></ol></li><li> crRNAの転写および精製 <ol><li> RNaseフリー水38μL、ステップ1.1.4の鋳型8μL、5×T7転写バッファー20μL、NTP混合物（10μM）20μL、組換えRNase阻害剤（RRI）4μL、および10 μLのT7 RNAポリメラーゼを1.5mLのマイクロ遠心チューブに添加した。総容量が100μLであることを確認してください。 </li><li>マイクロ遠心チューブを37℃の水浴に一晩（約16時間）置く。 </li><li>転写されたRNAを精製するには、RNAクリーンアップキットと濃縮キットを使用してください。製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li> UV-Vis分光光度計でRNAを定量し、RNAを10μMの濃度に希釈する。すぐにサンプルを使用するか、-80°Cで保存してください。 注：crRNA配列表2にリストされています。 </li></ol></li></ol> 2.C-ブリック部品の構成（ すなわち、 C-ブリック標準ベクトルへの生物学的部品の挿入） 注：この手順には3つのサブステップがあります。短い生物学的部分（ 例えば、プロモーターおよびターミネーター）については、ダイレクトPCR法を使用して、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに挿入することが最善である4 。補足データにはベクター全体の配列が示されており、接頭辞と接尾辞の配列は図1に示されています （下のステップ2.1）。 PCR（ 例えば、ゲノムDNA、プラスミド、または新しく合成されたDNA配列の鋳型を用いて）を介して容易に得ることができる生物学的部分に関しては、C-Brick標準ベクターに生物学的部分を挿入するために継ぎ目のないアセンブリ方法を使用することが最もよい（ステップ2.2、以下）。 BioBrickおよびBglBrick標準から得られた部分については、制限酵素媒介消化およびT4 DNAリガーゼ媒介ライゲーションを用いて、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに挿入することができる（以下の工程2.3）。 <ol><li> 直接PCR増幅による構築 <ol><li> PCR増幅のためのオリゴヌクレオチドの設計および注文。 注：オリゴヌクレオチドの5 &#39;末端はDNA部分の配列を含み、オリゴヌクレオチドの3&#39;末端はベクター配列（ すなわち、フォワード鎖の3 &#39;末端に「GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG」を含み、そしてフォワード鎖の「GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG」逆鎖の場合）。オリゴヌクレオチドの5 &#39;末端にオーバーハングがないか、約20bpのオーバーハングを設計することができる。特定の例は、以前の研究4に見出すことができる。 </li><li>超純水中の個々のオリゴヌクレオチドを10μMの濃度に再懸濁する。 </li><li>氷上で0.2 mLのPCRチューブでPCR反応をセットアップする：18μLの超純水、25μLの2×PCR緩衝液、1μLのdNTP（10μM）、ステップ2.1.2からのフォワード及びリバースプライマー（10μM）各2.5μL、鋳型としてのC-ブリック標準ベクター（50ng）0.5μL、高忠実度のDNAポリメラーゼの使用。総容量が50μLであることを確認する。 </li><li>チューブをサーモサイクラーに直接入れ、サーモサイクラープログラムを開始します。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li><li>サーモサイクラープログラム：98℃で3分間1サイクル; 98℃で10秒、55℃で20秒、および72℃で2分のサイクルを30サイクル; 72℃で10分間1サイクル。サンプルを16℃に保つ。 </li><li>ステップ2.1.4からの混合物9μLを1.5mL微量遠心管に加える。 </li><li> 1μLのDpnIを添加し、37℃の水浴中で1時間インキュベートする。 注：プライマーに重複配列がない場合は、0.5μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）と0.5μLのT4 DNAリガーゼを添加し、1時間22℃の水浴。そうでなければ、プライマーが約20nt重複配列を含む場合、DpnI処理産物を大腸菌 （DH10B）コンピテント細胞に直接形質転換する（工程2.4）。線状化されたPCR産物は、宿主内の組換え系によって環化される。 </li><li>すぐにサンプルを使用するか、-20℃で保存してください。 </li></ol></li><li> シームレスな組み立てによる構造 <ol><li> PCR増幅のためのオリゴヌクレオチドの設計および注文。 注：オリゴヌクレオチドの3 &#39;末端はDNA部分の末端配列を含み、オリゴヌクレオチドの5&#39;末端は線状化されたC-ブリック標準ベクター配列の末端を含む（ すなわち、 5 &#39;末端には 「CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC」、フォワードストランドの5 &#39;末端のための「CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC」）。特定の例は、以前の研究4に見出すことができる。 </li><li>個体を再停止する超純水中の10μMのオリゴヌクレオチドを10μMの濃度に希釈した。 </li><li>超純水18μL、2×PCRバッファー25μL、dNTPs（10μM）1μL、フォワードおよびリバースプライマー（10μM）の各2.5μLを加えます。 ）、0.5μLの鋳型（20〜500ng）、および0.5μLの高忠実度DNAポリメラーゼを添加した。総容量が50μLであることを確認する。 </li><li>チューブをサーモサイクラーに直接置き、サーモサイクラープログラムを実行してください。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 注：サーモサイクラープログラムを次のように設定します：98℃で3分間1サイクル; 98℃で10秒間、プライマーのアニーリング温度に応じて55℃で20秒間、および72℃で1分間（生物学的部位の長さに応じて）30サイクル; 72℃で10分間1サイクル。サンプルを16℃に保つ。 </li><li> PCR精製システムを使用してPCR産物を精製する。テンキット;製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li> C-ブリック標準ベクターをBamHIで消化します：34μLの超純水、10μLのプラスミド（1μg）、5μLの10倍緩衝液、および1μLのBamHIをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃で2時間、水浴中でインキュベートする。 </li><li>ゲルクリーンアップシステムキットを使用して上記の生成物を精製する。製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li>ステップ2.2.7からの線状化ベクター（50ng）2μL、ステップ2.2.4からのフラグメント（200ng）の5μL、シームレス組立キットからの5x継ぎ目のないアセンブリ緩衝液2μLおよびシームレス組立酵素1μLを加える。 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに加えます。総容量は10μLです。 </li><li>これを37℃の水浴に30分間置く。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li></ol></li><li> 制限酵素媒介消化およびT4 DNAリガーゼ媒介性連結による構築。 注意：BioBrick（ステップ2.3.4-2.3.7）およびBglBrick（ステップ2.3.1-2.3.3）標準から得られた部分については、制限酵素媒介消化およびT4DNAリガーゼ媒介ライゲーションを使用して、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに組み込む。 <ol><li> BglHIおよびBglIIでBglBrick標準品を消化する：超純水34μL、プラスミド10μL（2μg）、10倍バッファー5μL、BamHI0.5μLおよびBglII0.5μLをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 </li><li> 1％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてフラグメントを精製する。 </li><li>フラグメントとC-Brick標準ベクターをライゲーションする：ステップ2.1.12の線状化ベクター（50ng）2μLとステップ2.3.3のフラグメント（200ng）6μLを1.5mLマイクロ遠心チューブに加える。 10μLの10×T4 DNAリガーゼバッファーと1μLのT4 DNAリガーゼを加えます。 22℃で2時間インキュベートする。すぐにサンプルを使用するかフリーズする-20℃で保存してください。 </li><li> XbaIおよびSpeIでBioBrick標準品を消化する：超純水34μL、プラスミド10μL（2μg）、10倍バッファー5μL、XbaI0.5μLおよびSpeI0.5μLをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 </li><li> C-ブリック標準ベクターをXbaIとSpeIで消化します：34μLの超純水、10μLのプラスミド（1μg）、5μLの10倍緩衝液、0.5μLのXbaI、および0.5μLのSpeIをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 </li><li> 1％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲル精製システムキットを用いて、ステップ2.3.4のフラグメントおよびステップ2.3.5の直線化ベクターを精製する。製造業者のプロトコールに従って調製した。 </li><li>フラグメントとC-Brickベクターをライゲーションする：ステップ2.3.5の線状化ベクター（50ng）2μLとステップ2.3.4のフラグメント（200ng）6μLを1.5mL微量遠心チューブに加える。広告d1μLの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液および1μLのT4 DNAリガーゼ。 22℃で2時間インキュベートする。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li></ol></li><li> 大腸菌 （DH10B）のコンピテント細胞への化学的形質転換のために、ステップ2.1.8,22.9,2.3.3または2.3.7からの生成物10μLを添加する。 </li><li>いくつかのクローンを5 mL液体Luria-Bertani（LB）チューブに取り、37℃でシェーカー（220 rpm）で一晩インキュベートする。 </li><li>プラスミド調製キットを用いてプラスミドを抽出する。製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li>サンガー配列決定による正しいクローンの同定11 。 </li></ol> 3. C-ブリックアセンブリ（ 図2 ） <ol><li> C-BrickベクターのCpf1による消化 <ol><li> RNaseフリー水22.5μL、10x Cpf1緩衝液4μL、ステップ2.6のプラスミド（1μg）10μL、RRI0.5μL、および1＆＃181; LのCpf1（5μM）を1.5mLのマイクロ遠心チューブに添加する。 注：Cpf1は、市販のものを購入することも、前の研究4のプロトコルに従って精製することもできます4 。 </li><li> T1およびT2部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T2（10μM）を添加し、37℃の水浴中で30分間インキュベートします。さらに30分間、1μLのcrRNA-T1（10μM）およびCpf1（5μM）を添加する。 注：T3およびT4部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T3（10μM）を添加し、37℃の水浴中で30分間インキュベートします。 1μLのcrRNA-T4（10μM）をさらに30分間添加する。 </li><li> 1μLの感熱アルカリ性ホスファターゼを添加し、チューブを37℃の水浴中でさらに1時間インキュベートする。 </li><li>アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてベクターを精製する。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li></ol></&gt; <li> Cpf1によるDNA断片の消化 <ol><li> RNaseフリー水21.5μL、10x Cpf1バッファー4μL、ステップ2.6（2μg）のプラスミド10μL、RRI0.5μL、およびCpf1（5μM）2μLを1.5mL微量遠心管に加えます。 </li><li> T1およびT2部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T1（10μM）と1μLのcrRNA-T3（10μM）を添加し、37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 注：あるいは、1μLのcrRNA-T2（10μM）と1μLのcrRNA-T4（10μM）を添加し、37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 </li><li>アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてフラグメントを精製する。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li></ol></li><li> C-ブリックアセンブリとさらなる検証 <ol><li>外来DNA断片とC-Brickベクターをライゲーションします：2μLの線状化ベクター（50ng）およびステップ3.2.3のDNAフラグメント（200ng）6μLを1.5mL微量遠心チューブに添加する。 1×10 4個のT4 DNAリガーゼバッファーと1μLのT4 DNAリガーゼを加えます。 22℃で2時間インキュベートする。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li><li> 大腸菌 （DH10B） - コンピテント細胞への化学的形質転換のために10μLのライゲーション産物（段階3.3.1）を添加する。 </li><li>いくつかのクローンを5mL液体LBチューブに加え、シェーカー上で220 rpm、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>プラスミド調製キットを用いてプラスミドを抽出する。製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li>サンガー配列決定による正しいクローンの同定11 。 </li></ol></li><li> C-Brickアセンブリの新しいラウンドを実行します。手順3.3.4の正しいクローンは、手順3.1-3.3と同じプロトコルに従い、さらなる反復C-ブリックアセンブリのための新しいC-ブリックベクターまたはDNA部分として使用することができる。 注：T2 &#39;とT3のitesはT2サイトとT3サイトのバックアップとして設計されています（ 図1a ）。ステップ2.3.7から得られたプラスミドについては、C-Brick標準アセンブリのためにT2 &#39;およびT3&#39;のみを使用することができる。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

このプロトコールは、DNAアセンブリ標準C-ブリックの手順を記載する。このプロトコルの最も重要なステップは、C-Brick標準ベクトルの線形化です。ベクターの不完全な切断は、成功率に重大な影響を及ぼす可能性がある。さらに、Cpf1は、主に「18-23」切断パターンの標的DNA配列を切断するが、2つの塩基の近くの不正確な切断もまた検出され、DNAアセンブリ後に少数の突然変異を引き起こす可能性がある。したがって、組み立てられた構築物を検証するためには、サンガー配列決定が必要である。 C-ブリックアセンブリの効率は、従来の研究4に記載されている従来の制限酵素およびライゲーション法よりも低い。アセンブリ効率に影響を与える主な理由は、Cpf1の不正確な切断特性であり得る。将来的には、切断精度の改善は、標準的な現在調査中です。 C-Brickはまた、BglBrickおよびBioBrick標準と部分的に互換性があります。例えば、BglIIおよびBamHIで切断した後、C-ブリック標準ベクターのBamHI部位に挿入して、C-ブリック部分を生成することができる。しかし、BglBrick部分の挿入方向を確認し、組み立て後に「GGATCT」傷跡があるはずです。 BioBrick部分（ すなわち、 XbaIおよびSpeI消化）からC-ブリックDNA部分が得られると、T2およびT3部位の両方が破壊され、2つのバックアップCpf1標的配列（T2 &#39;およびT3&#39;）を使用することができる。 Cpf1切断にはRNaseに非常に敏感なsgRNAが必要であるため、すべての材料はRNaseフリーでなければなりません。現在、すべてのC-Brick標準ベクター、RNaseフリーCpf1ヌクレアーゼ、およびcrRNAは、商業的に注文することができます12 。したがって、C-Brickの手順は実際にはBioの手順と同じくらい簡単ですブリック規格。 ここ数年、ゴールデンゲートアセンブリ13 、ギブソンアセンブリ14 、その他15など、いくつかの有用なDNAアセンブリ方法が開発され広く使用されている。しかし、DNAアセンブリ標準は、費用効果が高く、信頼性が高く、高スループットの自動アセンブリ反応5を提供する可能性があるため、新しく設計された遺伝子や遺伝的回路、 16,17 、特に合成生物学の分野において、現在公開されているDNAアセンブリ標準の中でも、C-Brick標準には明白な長所と短所の両方があります（ライゲーション効率）。ライゲーション効率が向上すれば、将来この規格を広く採用することができます。

DNA生物学的部分の標準化は、合成生物学の発展にとって重要である1 。 DNAアセンブリ手順の開発は、 臨機応変な実験設計に取って代わることができ、遺伝的構成要素をより大きなシステムに組み立てる際に生じる予想外の結果の多くを除去することができる。 BioBrick標準（BBF RFC 10）は、最も初期に提案されたDNAアセンブリ標準の1つでした。これは接頭配列（EcoRIおよびXbaI切断部位を含む）および接尾配列（SpeIおよびPstI切断部位を含む） 2,3を使用する 。 XbaIとSpeIは相補的な凝集末端を有するため、XbaIとSpeIで切断されたBioBrick DNA部分を結合して、さらなる反復アセンブリのための新しいBioBrickを生成することができる。 BioBrick標準を使用していくつかの欠陥が確認されています4 。例えば、8-bpの傷跡を生じる融合タンパク質の構築を可能にしないDNA部分の間に存在する。さらに、上記の4種類の6bpの制限部位をDNA部分から除去しなければならず、これは非常に不便である。最初の問題を解決するためにBglBrick標準が確立されました5 。これは、6-bpの「GGATCT」傷跡を作り、Gly-Serを産生し、複数のタンパク質またはタンパク質ドメインの融合を可能にする。 iBrickは第2の問題に対処するために開発されました6 。長いDNA配列を認識するホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）を使用します。 HE認識部位は天然のDNA配列にほとんど存在しないので、iBrick標準は、DNA配列を改変することなくiBrick部位の直接構築に使用することができる。しかし、iBrickスタンダードはDNA部分の間に21 bpの傷跡を残します。これは、その不評の理由です。 近年、クラスタリングされた規則的に間隔を置いた短い回文繰り返し（CRISPR）システムが急速に発展した。 CRISPR関連（Cas）タンパク質の中で、 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9エンドヌクレアーゼが現在広く使用されている。大部分は、平滑末端を有する二本鎖DNA切断（DSB）を導入する9 。 2015年に、Zhangと共同研究者は、Cpf1（ PrevotellaとFrancisellaの CRISPR）を初めて特徴付けました 。それはクラス2型V CRISPR-Cas系に属し、CRISRP RNA（crRNA）誘導エンドヌクレアーゼ10である。 Cas9とは異なり、Cpf1は、4または5ntの5 &#39;オーバーハング10を有するDSBを導入する。この特性に基づいて、Cpf1を用いてDNAアセンブリ標準C-Brick 4を開発した。 C-ブリック標準ベクターでは、接頭語T1 / T2および接尾辞付きT3 / T4の4つのCpf1標的部位が生物学的部分に隣接する。これはBioBrick標準に似ています。 T2およびT3部位の切断として、p相補的な粘着末端を生じるので、DNA部分の反復アセンブリを実施することが可能であり、一方パーツ間に「GGATCC」傷を生成することが可能である。特に、C-Brick標準には2つの主な利点があります。長いターゲットシーケンスを認識し、短い傷跡を残します。 C-ブリックによって生成された6bpの「GGATCC」傷は、融合タンパク質の構築を可能にするGly-Serをコードする。さらに、C-Brick標準もBglBrickおよびBioBrick標準と部分的に互換性があります。

<table><tbody><tr><td>Comercial Oligonucleotide</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA Transcription Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>NTP mixture</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (Recombinant RNase Inhibitor)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max Buffer</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR buffer</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax for One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>seamless assembly kit</td></tr><tr><td>5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV Gel and PCR clean-up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>plasmid preparation kit</td></tr><tr><td>thermosensitive alkaline phosphatase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 buffer</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick standard vector</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (tryptone)</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (yeast extract)</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani media (NaCl)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

CRISPR関連タンパク質Cpf1は、CRISPR RNA（crRNA）の誘導下で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特徴のために、Cpf1は、長い認識部位および短い傷跡の利点を有するC-ブリックと呼ばれるDNAアセンブリ標準の確立に用いられてきた。標準的なC-Brickベクターには、接頭部（T1およびT2部位）および接尾部（T3およびT4部位） - 隣接する生物学的DNA部分の4つのCpf1認識部位がある。 T2およびT3部位の切断は相補的な粘着末端を生成し、T2およびT3部位を有するDNA部分のアセンブリを可能にする。一方、組立後に部品間に短い「GGATCC」傷が発生する。新たに形成されたプラスミドが再び4つのCpf1切断部位を含むので、この方法は、BioBrickおよびBglBrick標準のものと同様のDNA部分の反復的組み立てを可能にする。 DNA部品を組み立てるためのC-Brick標準の使用法の概要ここで説明します。 C-Brick標準は、科学者、大学院生、学部生、さらにはアマチュアでも広く使用できます。

<html>このプロトコールは、3つの色素タンパク質カセット（cjBlue（BBa_K592011）、eforRed（BBa_K592012）、およびamilGFP（BBa_K592010））のアセンブリを実証した。最初に、上記の3つの遺伝子およびターミネーターのコード配列をC-ブリック標準ベクターに個々にクローニングした。短いDNA部分、プロモーターおよびターミネーターを、5 &#39;末端に短いDNA部分を含むプライマーを用いたPCR増幅によってC-ブリックベクターに導入した。これに続いて、自己結紮法が行われた。 3つの色素タンパク質をコードする配列をまずde novoで合成し、シームレスなアセンブリによりC-Brick標準ベクターにクローニングした。プライマーは、以前の研究4に記載されている。 その後、cjBlue、eforRed、およびamiGFP配列を、ターミネーターおよびプロモーター配列と同じ手順で連結した&quot;xfig&quot;&gt;図2。正確な構築物を大腸菌に形質転換し 、美しい色を示した（ 図3a ）。続いて、2つの色発現カセットをC-ブリック標準でさらに組み立てて、より多くの色（ すなわち、 amilGFP + eforRedからの赤色、amilGFPからの緑色+ cjBlue、およびeforRed + cjBlueからの薄紫色; 3b ）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55775/55775fig1.jpg" /> 図1：C-ブリック標準インターフェースDNA配列およびC-ブリック標準ベクター。 （ a ）C-ブリック標準インターフェース-T1、T2、T3、T4、T2 &#39;、T3&#39;-の配列は、対応するcrRNAによって認識され、次いでCpf1を用いて5&#39;オーバーハングに導入され得る。 T2およびT3（またはT2 &#39;およびT3&#39;）部位の切断は、ハングアップします。 8つの制限サイトが設計されているため、C-Brick標準はBioBrickおよびBglBrickと部分的に互換性があります。 （ b ）制限消化部位を有するC-ブリック標準ベクターのプラスミドマップ。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55775/55775fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55775/55775fig2.jpg" /> 図2：C-ブリック規格のDNAアセンブリのワークフロー Cpf1消化T2およびT3標的部位は、それぞれ短い「GGATCC」傷跡を生成するために連結され得る「GGATC」および「GATCC」の相補的な粘着末端を産生する。詳細な手順は、手順3のテキスト（「C-Brickアセンブリ」）にあります。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55775/55775fig2large.jpg" target="_blank">ここをクリックしてください</a><html>この図のより大きなバージョンを見る。 <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55775/55775fig3.jpg" /> 図3：C-ブリック標準で組み立てられた大腸菌ハーボーティングコンストラクトによって産生されたカラフルなバクテリア顔料。 （ a ）3つの色素タンパク質をプレート上で増殖させた大腸菌で発現させた。色素タンパク質を有さない細菌（ネガティブコントロール）が第4プレートに示されている。 （ b ）3つの色素タンパク質および3つの組み立てられた二重色素タンパク質を、液体LB培地で増殖させた大腸菌で発現させた。 1から6までは、eforRed（1）、amilGFP（2）、cjBlue（3）、amilGFP plus eforRed（4）、amilGFP plus cjBlue（5）、およびeforRed plus cjBlue（6）を表しました。単一のプレートまたは単一のマイクロ遠心チューブ中のカラフルな細菌を、単一の配列で確認されたクローンから培養した。 les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 名 </td><td colspan="3"> シーケンス </td></tr><tr><td> T7-F </td><td colspan="3"> GAAATTAATACGACTCACTATAGGG </td></tr><tr><td> T7-T1-R </td><td colspan="3"> gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC </td></tr><tr><td> T7-T2&#39;-R </td><td colspan="3"> ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC </td></tr><tr><td> T7-T2-R </td><td colspan="3"> ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC </td></tr><tr><td> T7-T3-R </td><td colspan="3"> ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC </td></tr><tr><td> T7-T3&#39;-R </td><td colspan="3"> ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC </td></tr><tr><td> T7-T4-R </td><td colspan="3"> ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC </td></tr></tbody></table> 表1：この研究で使用されるcrRNA転写テンプレートの調製のためのオリゴ。 T7-Fはトップストランドオリゴヌクレオチドであり、他はボトムストランドオリゴヌクレオチドであった。配列中の小文字の塩基は、crRNAのガイド配列に転写される。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 名前 </td><td colspan="3"> RNA配列（5&#39;-3 &#39;） </td></tr><tr><td> crRNA-T1 </td><td colspan="3"> GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC </td></tr><tr><td> crRNA-T2 </td><td colspan="3"> GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC </td></tr><tr><td> crRNA-T3 </td><td colspan="3"> GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC </td></tr><tr><td> crRNA-T4 </td><td colspan="3"> GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA </td></tr><tr><td> crRNA-T2 &#39; </td><td colspan="3"> GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG </td></tr><tr><td> crRNA-T3 &#39; </td><td colspan="3"> GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG </td></tr></tbody></table> 表2：本研究で用いたcrRNA配列。 crRNAは、本文中のステップ1のインビトロ転写（「crRNAの調製」） において産生された。

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR関連タンパク質Cpf1は、特別に設計されたCRISPR RNA（crRNA）によって導かれ、所望の部位で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特性に基づいて、DNAアセンブリ標準（C-Brick）が確立され、その使用方法を詳述したプロトコルがここに記載されている。

Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

protocols-for-c-brick-dna-standard-assembly-using-cpf1

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K ビュー.  Chinese Academy of Sciences.  CRISPR関連タンパク質Cpf1は、特別に設計されたCRISPR RNA（crRNA）によって導かれ、所望の部位で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特性に基づいて、DNAアセンブリ標準（C-Brick）が確立され、その使用方法を詳述したプロトコルがここに記載されている。 

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A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

水性環境で炭化水素の変換を有効にするツールキット

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

生物工学

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic engineering became applicable to a large range of systems. Moreover, many transcriptional and epigenomic engineering approaches are now generally feasible for the first time. One reason for the broad applicability of CRISPR lies in its bipartite nature. Small gRNAs determine the genomic targets of the complex, variants of the protein Cas9, and the local molecular consequences. However, many CRISPR approaches depend on the simultaneous delivery of multiple gRNAs into individual cells. Here, we present a customizable protocol for string assembly gRNA cloning (STAgR), a method that allows the simple, fast and efficient generation of multiplexed gRNA expression vectors in a single cloning step. STAgR is cost-effective, since (in this protocol) the individual targeting sequences are introduced by short overhang primers while the long DNA templates of the gRNA expression cassettes can be re-used multiple times. Moreover, STAgR allows single step incorporation of a large number of gRNAs, as well as combinations of different gRNA variants, vectors and promoters.

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Here, we present string assembly gRNA cloning (STAgR), a method to easily multiplex gRNA vectors for CRISPR/Cas9 approaches. STAgR makes gRNA multiplexing simple, efficient and customizable.

文字列アセンブリ gRNA のカスタマイズ可能なプロトコル (STAgR) のクローニング

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

遺伝学

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

化学

学部研究および教育のための染色体コンフォメーションキャプチャー(3C)

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

著者スポットライト:3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

生物学

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure. Each chromosome occupies a specific territory, that may change according to stage of development or cell cycle. Gene expression can occur in specialized transcriptional factories where chromatin segments may loop out from various chromosome territories, leading to co-localization of DNA segments which may exist on different chromosomes or far apart on the same chromosome. The Associated Chromosome Trap (ACT) assay provides an effective methodology to identify these long-range DNA associations in an unbiased fashion by extending and modifying the chromosome conformation capture technique. The ACT assay makes it possible for us to investigate mechanisms of transcriptional regulation in trans, and can help explain the relationship of nuclear architecture to gene expression in normal physiology and during disease states.

The associated chromosome trap (ACT) assay is a novel unbiased method for identifying long-range DNA interactions. The characterization of long range DNA interactions will allow us to determine the relationship of nuclear architecture to gene expression in both normal physiology and in diseased states.

ロングレンジDNAの相互作用を識別するための関連する染色体のトラップ

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

要約

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この動画の章

水性環境で炭化水素の変換を有効にするツールキット

文字列アセンブリ gRNA のカスタマイズ可能なプロトコル (STAgR) のクローニング

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

ロングレンジDNAの相互作用を識別するための関連する染色体のトラップ

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3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

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