Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada [keşif grant 5026 A.M için] ve yeni nesil bilim adamları bursu Kanser Araştırma Derneği [A.M 21531] tarafından desteklenmiştir. Jean-François Lucier üzerinde istatistiksel analiz Fiji Python komut dosyaları ve tavsiye mükemmel kalite kontrolü sağlamak için teşekkür ederiz. Dr Stephanie A. Yazinski Eğer fiksasyon çözüm tarifi için teşekkür ederiz. Paul-Ludovic Karsenti lazer gücü ölçümleri ile yardım için teşekkür.

1. ön Sensitizasyonu hücre
<ol><li>mikro-ışınlama deneme önce 24 h tohum 1 x DMEM içeren 8-şey kültür FBS 405 nm lazer ışığı ve mükemmel görüntüleme maksimal geçirgenliği sağlamak için 170 µm kalınlığında coverslip benzeri cam/polimer dipleri ile slaytlar % 10 bir kuyu başına 40.000 U2OS hücre bir lazer tarama ile confocal mikroskop ters. Bir 8-şey microslide kullanarak medya veya çözümleri 500 µL iyi tüm sonraki tedaviler ve yıkama adımları protokolü için kullanın. Not: düz onların morfolojisi nedeniyle iyi yapışma ve büyük çekirdekler, U2OS hücreleri mikro ışınlanmış sitelerdeki protein alımı algılama kolaylaştırmak ancak diğer yapisan hücre tipleri gerektiğinde kullanılabilir. Hücreleri ideal yaklaşık % 80'i olması gerektiğini confluency sayısını artırmak için mikro-radyoterapi anda ışınlanmış hücre başına deney. Çok yüksek izdiham belirli onarım yolları hücre döngüsü9S ve G2 aşamaları sırasında gerçekleşir homolog rekombinasyon gibi huzursuz hücre döngüsü değişikliklere neden olabilir.</li>
	<li>Gecede 37 ° C'de % 5 CO2hücreleri kuluçkaya ve hücreleri (Adım 1.3) ile önceden duyarlı BrdU veya (Adım 1.4) BBET (Höchst 33342). Not: canlı işe bir protein DNA lezyonlar (POI) ilgi gözlemlemek için transfect veya hücre tohum sonra bir füzyon floresan bir protein ve POI 24 s arasında taşıyan plazmid DNA transduce. 24 saat sonrası-transfection/iletim, önceden duyarlı ve gerçek zamanlı olarak DNA hasarı sitelerdeki POI alımı izlemek için hücreleri mikro ışınlatayım.</li>
	<li>Fuar için 405 nm lazer tarafından oluşturulan DSBs sayısını artırmak için mikro-Işınlama önce 24 h için medya BrdU 10 µM ekleyin. Mikro-Işınlama önce bir micropipette kullanarak, fenol maksimal maruz 405 nm lazer hücre sağlamak için kırmızı olmadan orta iki kez hücrelerle durulayın.</li>
	<li>Alternatif olarak, hücre, hücre kültürü kuluçka 37 ° C'de uygun ortamda 10 µg/mL BBET ile 15 dakika tedavi İki kez fenol kırmızı mikro-Işınlama önce olmadan orta ile kullanımdan sonra durulayın.</li>
</ol>2. hücre mikro-ışınlama
<ol><li>Uygun lazer tarama confocal mikroskop seçin. Not: Burada sunulan deneyler bir 50 mW 405 nm lazer çizgi ve 63 X 1.4 sayısal diyafram petrol amacı ile donatılmış bir mikroskop sistem üzerinde gerçekleştirilmiştir. DSBs üretmek için hücreleri 1 X 1024 x 1024 piksel/Field (0,21 µm/63 X büyütme, piksel) tarama zum mikro radyasyona maruz ve tek yönlü modunda 8 µs/piksel. Kullanılan lazer güç sırasıyla % 25 ve % 80 BBET - ve BrdU-pre-duyarlı hücreler için yapıldı. Kullanıcıların kendi sistem yapılandırmasına yardımcı olmak için lazer güç sonrası amaç sunulan sistemde üreticinin yönergelerine uygun bir güç metre kullanılarak ölçülmüştür. Ölçümler 2,6 için karşılık gelen mW ve 7,0 mW için BBET - ve BrdU-pre-duyarlı hücreleri, anılan sıraya göre.</li>
	<li>
Mikroskop ve çevre odası açın.
	<ol>
<li>Örnekleri hücrelere gereksiz stres önlemek için ve homojen DDR Kinetik deney sağlamak için sahne alanı üzerinde kombine kuluçka makinesi içine yerleştirmeden önce odayı 37 ° C % 5 CO2 ayarla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İyi dağıtılmış hücrelerle alanları seçin, odağı ayarlamak ve konumlarını resim alma Eğer Protokolü sonra kolaylaştırmak için kayıt. Mikro-ışınlama sonra protein alımı Kinetik izlemek için bir ön hasar başvuru noktası olarak hizmet edecek en az bir resim elde etmek. Not: Gridded kültür damarları da mikro ışınlanmış hücre sonraki adımlar yerelleştirme kolaylaştırmak için kullanılabilir.<ol>
<li>BBET etiketli hücreleri kullanarak Eğer deneyler için yersiz DNA hasarı önlemek için en düşük lazer güç hücreleri görselleştirmek için yeterli 405 nm lazer kullanarak hücreleri üzerinde odak noktası ayarlayın.<ol>
<li>Mor ötesi ışık lamba tarafından yayılan DNA hasarı ışıklı sitelerde neden gibi BBET lekeli hücreleri üzerinde odak ayarlamak için widefield floresan kullanmaktan kaçının.</li>
		</ol>
</li>
		<li>BrdU etiketli hücreleri kullanıyorsanız, alt nükleer şekil öyle aynı derecede nükleulus bakarak fark girişim kontrast (DIC) veya faz kontrast görüntüleme kullanarak odağı ayarlayın.</li>
		<li>İÇY'leri Fluorescently etiketli ifade hücreleri kullanarak, bir odak düzlemi temsilcisi floresan yoğunluğu ile seçin. Not: güçlü overexpression manipülasyonun yerelleşme neden olabileceğinden POI düzeyi çok yüksek hızlı hücreleri kaçının. Ayrıca, POI (istikrarlı klonlar yelpazesi POI ifade ve işe alım seviyeleri farklılığı en aza indirmek için önerilir) karşılaştırılabilir düzeyde hızlı hücreleri seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskop sistem photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) _module sonra Floresans kurtarma kullanarak mikro-ışınlama adım için yapılandırın. Not: en önemli parametreler mikroskop sistem mikro-ışınlama deneyler için ayarlama göz önünde bulundurun: 405 nm lazer (Yani, sayı lazer üzerinde aynı koordinatlarda gidecek kez), yineleme sayısını çıkış gücü piksel/alan sayısı (63 X büyütme ve 1024 x 1024 çözünürlük, 1 piksel, 0,21 µm =) ve piksel başına Işınma Zamanı. Tüm bu faktörlerin hücreleri deneyim enerji miktarı etkisi olacak ve böylece oluşturulan (bkz: tartışma daha fazla doz en iyi duruma getirme bilgi için) miktarı ve türü DNA'sının zarar.</li>
	<li>Mikroskop sistem sıkı BAĞLAMAK modülü kullanılarak, mikro-hücreleri ışınlatayım. Not: çoğu sistemde mikro-ışınlama birden fazla hücreyi tek bir alanda noktalar ya da çizgiler/dikdörtgenler (geniş genellikle 1-2 µm) olarak gerçekleştirilebilir. Canlı görüntüleme fluorescently etiketli proteinlerin gerçekleştirirken hemen sonrası hasar, mikro ışınlatayım-her hücre için geçen süre DDR gecikmiş bir indüksiyon içinde neden olur çünkü mikro-ışınlama küçük bir alan başına hücre sayısı için sınırlama. Bu proteinler DNA lezyonlar için çok hızlı bir şekilde işe izlerken özellikle önemlidir.</li>
	<li>
Mikro-ışınlama, çok iyi slaytlar veya tabak bir kuluçka %5 CO2 37 ° C'de işleme örnekleri için önce gerekli süre için koy (Bölüm 5) sonra veya hemen canlı görüntüleme ile devam (Bölüm 3).
	<ol>
<li>İlk adım olarak, bir kaç dakika içinde ve en fazla bir kaç saat sonrası radyoterapi Eğer iletişim kuralı için hücreleri tamir. İşe Alım Kinetik POI bağlı olarak değişebilir. Genellikle, DSBs ve SSBs Kromatin ilişkili proteinler çok hızlı bir şekilde lezyon için yerelleştirilmesine ve bazen 5 dk içinde kaldırılır. Bu da ssDNA bir araya gibi bazı faktörler rezeksiyon makine meşgul olan bir kez daha sonraki zaman noktalarda alınacaktır ve orada saat için (bkz: şekil 1 ve başvuru4) kalır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. canlı görüntüleme Fluorescently etiketli proteinlerin
<ol><li>Mikro ışınlanmış hücre zaman hata görüntüleme gerçekleştirmek. Bir plato elde kadar her 1-2 dk lezyonlar için çok hızlı bir şekilde işe, bir kaç saniye kare başına ideal olacaktır, ancak hasarlı bölgeyi için daha sonra (örneğin, rezeksiyon faktörleri), satın alma yerelleştirmek proteinler için olabilir proteinler gerçekleştirilen için. Not: mümkün olduğu kadar ağartma önlemek için ve protein alımı hasar sitelerdeki sinyal miktar engel doygunluk ulaşmak değil emin olmak için resim alma için lazer gücü en aza indirmek ve sonraki inceliyor (bkz: veri analizi Bölüm 4). Sunulan sistemde görüntüleme 63 X ile yapıldı / 1.4 petrol kullanarak bir 8 µs/piksel Işınma Zamanı, 1024 x 1024 çözünürlük, 1 X zoom, objektif ve 2 / ortalama. Not Bu parametreler diğer sistemleri ve/veya farklı deneyler için optimize edilmiş olması gerekebilir.</li>
	<li>Mikro ışınlatayım-Kinetik ölçümleri kadar ek alanlar hücrelerde için 15-30 hücre elde edilir. Doğruluk ve işe alım Kinetik tekrarlanabilirlik emin olmak için en az 3 kez biyolojik çoğaltır deneylerde yineleyin. Not: Bu iletişim kuralı belirli bir confocal sistemine adapte, o bilinen fluorescently etiketli genom bakım faktörü işe alım Kinetik izleyerek başlatmak yararlı olabilir (örneğin, 53BP1-GFP, RPA32-GFP, vb). Mikro-ışınlama koşulları optimize etmek için canlı görüntüleme kullanarak kullanıcının birden çok parametre hızla test etmek izin verir.</li>
</ol>4. işe alım Kinetik analizi
<ol><li>Microirradiation analiz eklenti10 içinde Fiji görüntü analiz yazılımı11yükleyin.</li>
	<li>
Fiji'de alınan görüntüleri açın. "Hasar Analyzer" Microirradiation Analysis Suite açılan plugins menüsünden seçin. Bir arka plan bölgesi faiz (ROI) (genellikle 3 x 3 µm) ve sigara ışınlanmış ve ışınlanmış ROIs her mikro ışınlanmış hücre tanımlamak için istemleri izleyin.
	<ol>
<li>Potansiyel önyargıları en aza indirmek için kullanım ROIs aynı büyüklükte sinyal yoğunluklarda demek. Elde edilen görüntüler için de temel olarak işe mikro ışınlanmış sitelerde izlemek için kullanılan en az bir ön ışınlama çerçeve içerir.</li>
		<li>Tam hızlandırılmış serisi üzerinde tüm yatırım Getirisi veri topladıktan sonra sonuçlarını içeren bir csv (virgülle ayrılmış dosya) veya txt dosyası (sekmeyle ayrılmış) olarak eklenti tarafından oluşturulan dosyayı kaydedin. Bu dosya her zaman noktası ve her ROI (yani yoğunluğu arka plan, yani yoğunluğu olmayan ışınlanmış ve demek ışınlanmış yoğunluğu) için ortalama yoğunluk ölçümleri içerir. Not: Eklenti otomatik olarak arka plan yoğunluğu çıkarır (benb) düşük radyasyonlu ROIs yoğunluğu (bens) ve sigara ışınlanmış ROIs (benn). Ayrıca photobleaching (ışınlanmış/sigara-ışınlanmış) düzeltmek için (bkz. aşağıdaki formül) her iki değer arasında bir oranı hesaplar. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57410/57410eq1v2.jpg"> Eklenti Ayrıca bir normalleştirme arasında ilk zaman noktası (değeri 1 olarak ayarlayın) ve tüm hesaplar (oranı ilk kez noktaya göre) her çekirdek için diğer zaman puan. Ek bilgi-ebilmek bulunmak üstünde eklenti web sitesi10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tüm mikro ışınlanmış hücreleri için (en az 15-30) eklentisi kullanarak Çözümlemeyi gerçekleştirmek ve zaman içinde ortalama göreli zenginleştirme mikro radyasyona maruz bölgeler itibariyle grafiğini çizer. Her veri için ortalama standart hataları işaret ve onları arsa hesaplayın.
	<ol>
<li>İşe Alım Kinetik öğrencinin tgerçekleştirerek iki deneysel koşullar arasında farklılıklar onaylamak-testler her veri noktası için.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Eğer iletişim kuralı
<ol><li>
Eğer çözümleri hazırlayın. Pre/post-extraction çözüm hazırlamak (% 0.25 içeren buz gibi 1 x PBS Triton X-100), çözüm yıkama (1 x PBS % 0.05 içeren ara-20), çözüm engelleme (% 3 BSA ve %0,05 içeren 1 x PBS ara-20) ve fiksasyon çözüm (Paraformaldehyde % 3 + sukroz %2 PBS 1 içinde x) konik polipropilen borular içinde. Not: tek bir 8-şey microslide için pre/post-extraction çözüm, çözüm, engelleme çözüm 10 mL ve 5 mL fiksasyon çözeltisi yıkama 50 mL 10 mL gereklidir.<ol>
<li>Fiksasyon çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Kimyasal bir başlık altında çift distile su (GKD2O) 400 mL paraformaldehyde 15 g ve 1 L Erlenmeyer şişeye 10 N NaOH 30 µL karıştırın.</li>
			<li>Konteyner ve manyetik karıştırıcı sıcak tabakta 65 ° C ısıda paraformaldehyde tamamen solubilize için karıştırarak kapatın.</li>
			<li>25 mL pipet kullanarak, 50 mL 10 X PBS, heyecan ve 0,45 µm filtre kullanarak filtre ekleyin.</li>
			<li>10 g Sükroz ekleyin ve 500 ml GKD2O. ile tamamlamak</li>
			<li>Aliquot 15 mL konik tüpler çözümde; -20 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Çözüm 1 mg/mL 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 1 x PBS içinde stok çözeltisi sulandrarak boyama çekirdeklerin hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, dikkatle medyayı çok iyi mikroskobu slaytlar veya tabak kuyulardan çıkarıp hemen çözüm iki kez beklemeden değiştirerek Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile yıkayın. Not: Burada sunulan Eğer veri yıkanmış ve tüm çözümler 500 µL içinde inkübe 8-şey mikroskobu slaytlar yetiştirilen hücreleri kullanılarak elde edilmiştir. Birimleri Denemecileri tarafından kullanılan hücre kültürü kapları bağlı olarak ayarlanmalıdır. Ayrıca, hücreleri kolayca cam/polimer alttan bağlantısını kesin olarak aşırı kaygı eğer protokolüyle gerçekleştirin. Bir micropipette tüm çözüm değişiklikleri için hücre kaybı en aza indirmek için kullanın.</li>
	<li>Buz gibi Eğer pre/post-extraction çözüm ve girdap hafifçe el ön ayıklama gerçekleştirmek 15-30 s tarafından bu adım 500 µL ile 5 dk en sitoplazmik ve nucleoplasmic proteinleri kaldırır ve Kromatin sinyalini en üst düzeye çıkarır buz üzerinde kuluçkaya / DNA ilişkili faktörler.</li>
	<li>Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Eğer fiksasyon çözeltinin 500 µL oda sıcaklığında için 15 dk kuluçkaya. Alternatif olarak, önceden yapılmış paraformaldehyde çözüm (3-%4) fiksasyon adım için kullanın.</li>
	<li>Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>On Ice buz gibi Eğer pre/post-extraction çözüm 500 µL içinde 5 min için kuluçkaya ve sürgüyü yavaşça elle permeabilization adımı gerçekleştirmeniz için girdap.</li>
	<li>Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Eğer engelleme çözüm olarak 500 µL oda sıcaklığında en az 30 dk kuluçkaya.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak engelleme çözümü kaldırmak ve gecede 4 ° C'de oksijen odasında çözüm engelleme seyreltilmiş 250 µL birincil antikorlar ile kuluçkaya. Not: Kuluçka ardışık olarak potansiyel eş yerelleştirme eserleri önlemek için birincil antikorlar ile gerçekleştirmek için iyi bir yöntemdir. Bir kez uygun denetimleri gerçekleştirilmiş, aynı anda sürecini hızlandırmak için birincil antikorlar kuluçkaya.</li>
	<li>Eğer çamaşır çözüm nazik ajitasyon (bir rotator üzerinde 60 rpm) ile 5 dakika içinde 500 µL için dört kez yıkayın.</li>
	<li>Oksijen odası engelleme çözümde seyreltilmiş ikincil antikorların 250 µL ile 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Not: ikincil antikorlar fluorescently etiketli eklenmesi üzerine ışık örnekleri korumak.</li>
	<li>Dört kez her 5 min için 500 µL Eğer çamaşır çözüm nazik ajitasyon ile yıkayın.</li>
	<li>1 x PBS 1 µg/mL çekirdek leke DAPI içeren 500 µL içinde 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>1 x PBS 500 µL ile iki kez yıkayın ve görüntüleme için PBS çözüm x 1 500 µL hücrelerde bırakın.</li>
	<li>Gridded slaytlar veya kayıtlı sahne pozisyonları kullanarak, iyi karakterize bir DNA hasarı işaretçisi kullanarak mikro ışınlanmış hücreleri bulma (örneğin, γ-H2A.X, RPA32, vb).</li>
	<li>Görüntü çok iyi kültür slaytlar veya uygun ayarlar üzerinde lazer tarama confocal mikroskop kullanarak tüm ilgili Kanallar levha. Not: 63 X ile görüntüleme sunulan sistemde yapılan / 1.4 petrol kullanarak bir 8 µs/piksel Işınma Zamanı, 1024 x 1024 çözünürlük, 1 X zoom, objektif ve 2 / ortalama. Not Bu parametreler diğer sistemleri ve/veya farklı deneyler için optimize edilmiş olması gerekebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).</li><li>Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Introducing+Double-Strand+Breaks+into+Cellular+DNA.">A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA.</a> Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).</li><li>Polo, S. E., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+damage+response+proteins+at+DNA+breaks:+a+focus+on+protein+modifications.">Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications.</a> Genes &amp; development. 25 (5), 409-433 (2011).</li><li>Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+spatiotemporal+dynamics+of+mammalian+checkpoint+regulators+induced+by+DNA+damage.">Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage.</a> Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/">https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/</a> (2017)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Izhar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Analysis+of+Factors+Localized+to+Damaged+Chromatin+Reveals+PARP-Dependent+Recruitment+of+Transcription+Factors.">A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors.</a> Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).</li><li>Mar&#233;chal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRP19+Transforms+into+a+Sensor+of+RPA-ssDNA+after+DNA+Damage+and+Drives+ATR+Activation+via+a+Ubiquitin-Mediated+Circuitry.">PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry.</a> Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).</li><li>Dubois, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphorylation-and-ubiquitylation+circuitry+driving+ATR+activation+and+homologous+recombination.">A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).</li><li>Wan, L., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PSO4+Complex+Associates+with+RPA+and+Modulates+the+Activation+of+ATR.">The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).</li><li>Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+human+Psoralen+4+(hPso4)+complex+in+replication+stress+and+homologous+recombination.">The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).</li><li>Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+resection+at+DNA+double-strand+breaks+leads+to+de+novo+telomere+formation+and+enhances+gene+targeting.">Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting.</a> PLoS Genetics. 6 (5), (2010).</li><li>Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+double-strand+DNA+break+repair+by+homologous+recombination.">Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Scientific Reports. 5 (9592), (2015).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Dinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+multiple+DNA+repair+pathways+by+sub-nuclear+damage+induction+methods.">Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods.</a> Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells.">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).</li><li>Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Laser+Micro-irradiation+for+Examination+of+Single+and+Double+Strand+Break+Repair+in+Mammalian+Cells.">Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>Mortusewicz, O., Am&#233;, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-regulated+poly(ADP-ribosyl)ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells.">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li><li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+a+&#947;H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response.">Chemical proteomics reveals a &#947;H2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li><li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy.">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıda belirtilen yöntemlerle, 405 nm lazer mikro-ile BBET veya BrdU ile önceden sensitize hücre DNA lezyonlar DSBs yapisan insan hücrelerinin çekirdekleri içinde dahil yerelleştirilmiş nesil sağlar. Bu DSBs, DDR Kinetik ökaryotik hücreler9,18,19diğer yöntemleri ile oluşturulan benzer. DSB rezeksiyon mikro ışınlanmış sitelerdeki ssDNA-üretimi RPA32 hedefleme antikor veya bir RPA32-GFP füzyon kullanarak ta...

Hücreler sürekli genomik kendi bütünlüğünü tehdit eden endojen ve eksojen DNA hasar kaynakları için sunulur. DDR algılayan, sinyal ve genom istikrarı sürdürmek için DNA lezyonlar onarım yolları sinyal bir topluluk var. DNA çift iplikçikli tatili (DSBs), esas olarak iki tamamlayıcı platformlarda DDR oluşur: Kromatin γ H2A.X etiketli ve genellikle ssDNA bağlama karmaşık RPA1,2ile kaplı rezeke tek iplikçikli DNA (ssDNA) bölge.
UV-lazer mikro-ile timidin analog 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) veya bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Höchst 33342) DNA boya ile önceden sensitize hücreleri de dahil olmak üzere tek iplikçikli sonları (DNA lezyonlar karışımı oluşturur SSBs) ve Kromatin ve ssDNA platformlar3,4' te yerelleştirilmiş bir DDR temin DSBs. Önceki iş işe genom bakım faktörlerin DSB, bu iki farklı platformlar için yüksek enerji UV-A lazerler (335-365 nm) Eğer2,5ile kombine kullanarak ayrımcılık gösterdi. Yüksek enerjili lazer ve özel UV-A aktaran hedefleri 405 nm lazer ile çok daha az yaygın olarak karşılaşılan bazı akademik ve ilaç ayarlarında daha confocal mikroskoplar lazer tarama yapmak gerektiği gibi lazerler ile donatılmış mikroskoplar maliyetlidir satırları. Protein işe alım ve Satım mikro ışınlanmış sitelerdeki çalışmanın da genom bakım faktörler dinamik davranışını tanımlamak için gereken zahmetli el ile görüntü analizi tarafından durdurulmasını emretti.
İşte, BrdU veya BBET nükleik asit leke içeren hücrelerin öncesi Sensitizasyonu 405 nm lazer bir ortak confocal mikroskop genom bakım faktörü dynamics DNA lezyonlar, izleme sağlar mikro-ışınlama kullanarak takip göstermektedir. γ-H2A.X ya da RPA karmaşık alt birimleri için daha fazla alan derinliği ve deconvolution z istifleme birlikte platform işaretçileri için geliştirilmiş çözünürlük kullanarak yerel olarak DSBs için yaymak için bu işe faktörler ayırımcılık deneyci sağlar ilk lezyon çevreleyen büyük Kromatin etki alanları. Bu alt sınıflandırma ayrı intra nükleer bölmeleri göre mikro ışınlanmış sitelere işe uncharacterized proteinlerin potansiyel rolleri rafine yardımcı olur. Ayrıca, uygun iletişim kuralları sağlar ve boru hatları hızla genom bakım faktörler istimal açık kaynak yazılım Fiji (ImageJ dağıtım)6,7,8dinamiklerini analiz etmek için en iyi duruma getirilmiş. Geçerli mikro-radyoterapi yöntemleri için bu ayrıntılandırmaları DDR çalışmanın hemen hemen herhangi bir laboratuvar ortamında mümkün kılıyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">FluoView FV3000 software (version 2.1)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">405 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>OKO-UNO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">60X /1.4 Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">8-well culture slides on coverglass (X-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">U2OS osteosarcoma human cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Stable cell lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Caution toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine&#160;(BrdU)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59-14-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Caution toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Trypsin EDTA 0.1%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX777.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">JetPRIME transfection reagent&#160;</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">DMEM 1X, + phenol red</td>
			<td>Wisent&#160;</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">DMEM 1X, - phenol red</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-051-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent&#160;</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Mouse anti-RPA32 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2175</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit anti-&#947;-H2A.X antibody</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>9718S</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit Anti-53BP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4937S</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit Anti-PRP19 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27692</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4414S</td>
			<td>1:250 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Goat anti-mouse&#160; IgG Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4408S</td>
			<td>1:250 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fiji image analysis open-source software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">1918-K Power meter&#160; with a 918D-SL-0D3 sensor</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of protein recruitment to dna lesions using 405 nm laser micro-irradiation

DNA hasarı yanıt (DDR) proteinler bir bolluk tespit etmek, sinyal ve DNA lezyonlar onarmak için kullanır. Bu yanıtı operasyona genom bakım mekanizmalarını anlamak için önemlidir. İşe Alım ve Satım lezyonlar, proteinlerin son derece dinamik olduğundan, yaptıkları çalışmada hızlı ve dağınık şekilde ayrılmış bir şekilde DNA hasar oluşturma yeteneği gerektirir. Burada, yerel olarak bir 405 nm lazer çizgi ile donatılmış bir yaygın olarak bulunan lazer tarama confocal mikroskop kullanarak insan hücrelerinde DNA hasar ikna etmek için yordamlar açıklar. Faktörler lazer çizgili, ayirt (Eğer) veya gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilir genom bakım birikimi proteinler ile floresan gazetecilere öğesini kullanarak. Fosforile Histon H2A kullanarak. (γ-H2A.X) x ve çoğaltma Protein A (RPA) işaretleyici olarak, yerel olarak işe faktörler üzerinde bitişik Kromatin yayılan bu ayırımcılık için yeterli çözünürlük yöntemdir. Biz daha fazla verimli bir şekilde DNA, protein relocalization Kinetik izlemek için ImageJ tabanlı komut dosyaları siteleri zarar sağlamak. Bu ayrıntılandırmaları DDR dynamics çalışmanın büyük ölçüde basitleştirir.

Mikro-ışınlama hücreleri genom bakım proteinler1,12niteliğine bağlı olarak belirli bir süre için yeniden elde etmek için izin verilir. DSBs enzimler tarafından en yaygın olarak hızla RPA ve diğer genom bakım faktörler9tarafından kaplı ssDNA sınırlı bir bölge oluşturmak için hücre döngüsünün S ve G2 aşamaları sırasında işlenir. Bu ssDNA bölgede yaygın olarak işe alım ve...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation at JoVE.com

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

investigation-protein-recruitment-to-dna-lesions-using-405-nm-laser

Research

JoVE Journal

Genetics

9.3K Görüntüleme.  Université de Sherbrooke. DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Video: Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Genetik

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Cpf1&#39;i Kullanarak C-Brick DNA Standart Montajı İçin Protokoller

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

RNA sentezi 5-Bromouridine etiketleme ve Immunoprecipitation kullanarak incelenmesi

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the population. Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) provides a recording of the conformational changes taking place by individual molecules in real-time. Therefore, smFRET is powerful in measuring structural changes in the enzyme or substrate during binding and catalysis. This work presents a protocol for single-molecule imaging of the interaction of a four-way Holliday junction (HJ) and gap endonuclease I (GEN1), a cytosolic homologous recombination enzyme. Also presented are single-color and two-color alternating excitation (ALEX) smFRET experimental protocols to follow the resolution of the HJ by GEN1 in real-time. The kinetics of GEN1 dimerization are determined at the HJ, which has been suggested to play a key role in the resolution of the HJ and has remained elusive until now. The techniques described here can be widely applied to obtain valuable mechanistic insights of many enzyme-DNA systems.

Single-Molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Presented here is a protocol for performing single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer to study HJ resolution. Two-color alternating excitation is used for determining the dissociation constants. Single-color time lapse smFRET is then applied in real-time cleavage assays to obtain the dwell time distribution prior to HJ resolution.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler