Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada [keşif grant 5026 A.M için] ve yeni nesil bilim adamları bursu Kanser Araştırma Derneği [A.M 21531] tarafından desteklenmiştir. Jean-François Lucier üzerinde istatistiksel analiz Fiji Python komut dosyaları ve tavsiye mükemmel kalite kontrolü sağlamak için teşekkür ederiz. Dr Stephanie A. Yazinski Eğer fiksasyon çözüm tarifi için teşekkür ederiz. Paul-Ludovic Karsenti lazer gücü ölçümleri ile yardım için teşekkür.

1. ön Sensitizasyonu hücre
<ol><li>mikro-ışınlama deneme önce 24 h tohum 1 x DMEM içeren 8-şey kültür FBS 405 nm lazer ışığı ve mükemmel görüntüleme maksimal geçirgenliği sağlamak için 170 µm kalınlığında coverslip benzeri cam/polimer dipleri ile slaytlar % 10 bir kuyu başına 40.000 U2OS hücre bir lazer tarama ile confocal mikroskop ters. Bir 8-şey microslide kullanarak medya veya çözümleri 500 µL iyi tüm sonraki tedaviler ve yıkama adımları protokolü için kullanın. Not: düz onların morfolojisi nedeniyle iyi yapışma ve büyük çekirdekler, U2OS hücreleri mikro ışınlanmış sitelerdeki protein alımı algılama kolaylaştırmak ancak diğer yapisan hücre tipleri gerektiğinde kullanılabilir. Hücreleri ideal yaklaşık % 80'i olması gerektiğini confluency sayısını artırmak için mikro-radyoterapi anda ışınlanmış hücre başına deney. Çok yüksek izdiham belirli onarım yolları hücre döngüsü9S ve G2 aşamaları sırasında gerçekleşir homolog rekombinasyon gibi huzursuz hücre döngüsü değişikliklere neden olabilir.</li>
	<li>Gecede 37 ° C'de % 5 CO2hücreleri kuluçkaya ve hücreleri (Adım 1.3) ile önceden duyarlı BrdU veya (Adım 1.4) BBET (Höchst 33342). Not: canlı işe bir protein DNA lezyonlar (POI) ilgi gözlemlemek için transfect veya hücre tohum sonra bir füzyon floresan bir protein ve POI 24 s arasında taşıyan plazmid DNA transduce. 24 saat sonrası-transfection/iletim, önceden duyarlı ve gerçek zamanlı olarak DNA hasarı sitelerdeki POI alımı izlemek için hücreleri mikro ışınlatayım.</li>
	<li>Fuar için 405 nm lazer tarafından oluşturulan DSBs sayısını artırmak için mikro-Işınlama önce 24 h için medya BrdU 10 µM ekleyin. Mikro-Işınlama önce bir micropipette kullanarak, fenol maksimal maruz 405 nm lazer hücre sağlamak için kırmızı olmadan orta iki kez hücrelerle durulayın.</li>
	<li>Alternatif olarak, hücre, hücre kültürü kuluçka 37 ° C'de uygun ortamda 10 µg/mL BBET ile 15 dakika tedavi İki kez fenol kırmızı mikro-Işınlama önce olmadan orta ile kullanımdan sonra durulayın.</li>
</ol>2. hücre mikro-ışınlama
<ol><li>Uygun lazer tarama confocal mikroskop seçin. Not: Burada sunulan deneyler bir 50 mW 405 nm lazer çizgi ve 63 X 1.4 sayısal diyafram petrol amacı ile donatılmış bir mikroskop sistem üzerinde gerçekleştirilmiştir. DSBs üretmek için hücreleri 1 X 1024 x 1024 piksel/Field (0,21 µm/63 X büyütme, piksel) tarama zum mikro radyasyona maruz ve tek yönlü modunda 8 µs/piksel. Kullanılan lazer güç sırasıyla % 25 ve % 80 BBET - ve BrdU-pre-duyarlı hücreler için yapıldı. Kullanıcıların kendi sistem yapılandırmasına yardımcı olmak için lazer güç sonrası amaç sunulan sistemde üreticinin yönergelerine uygun bir güç metre kullanılarak ölçülmüştür. Ölçümler 2,6 için karşılık gelen mW ve 7,0 mW için BBET - ve BrdU-pre-duyarlı hücreleri, anılan sıraya göre.</li>
	<li>
Mikroskop ve çevre odası açın.
	<ol>
<li>Örnekleri hücrelere gereksiz stres önlemek için ve homojen DDR Kinetik deney sağlamak için sahne alanı üzerinde kombine kuluçka makinesi içine yerleştirmeden önce odayı 37 ° C % 5 CO2 ayarla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İyi dağıtılmış hücrelerle alanları seçin, odağı ayarlamak ve konumlarını resim alma Eğer Protokolü sonra kolaylaştırmak için kayıt. Mikro-ışınlama sonra protein alımı Kinetik izlemek için bir ön hasar başvuru noktası olarak hizmet edecek en az bir resim elde etmek. Not: Gridded kültür damarları da mikro ışınlanmış hücre sonraki adımlar yerelleştirme kolaylaştırmak için kullanılabilir.<ol>
<li>BBET etiketli hücreleri kullanarak Eğer deneyler için yersiz DNA hasarı önlemek için en düşük lazer güç hücreleri görselleştirmek için yeterli 405 nm lazer kullanarak hücreleri üzerinde odak noktası ayarlayın.<ol>
<li>Mor ötesi ışık lamba tarafından yayılan DNA hasarı ışıklı sitelerde neden gibi BBET lekeli hücreleri üzerinde odak ayarlamak için widefield floresan kullanmaktan kaçının.</li>
		</ol>
</li>
		<li>BrdU etiketli hücreleri kullanıyorsanız, alt nükleer şekil öyle aynı derecede nükleulus bakarak fark girişim kontrast (DIC) veya faz kontrast görüntüleme kullanarak odağı ayarlayın.</li>
		<li>İÇY'leri Fluorescently etiketli ifade hücreleri kullanarak, bir odak düzlemi temsilcisi floresan yoğunluğu ile seçin. Not: güçlü overexpression manipülasyonun yerelleşme neden olabileceğinden POI düzeyi çok yüksek hızlı hücreleri kaçının. Ayrıca, POI (istikrarlı klonlar yelpazesi POI ifade ve işe alım seviyeleri farklılığı en aza indirmek için önerilir) karşılaştırılabilir düzeyde hızlı hücreleri seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskop sistem photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) _module sonra Floresans kurtarma kullanarak mikro-ışınlama adım için yapılandırın. Not: en önemli parametreler mikroskop sistem mikro-ışınlama deneyler için ayarlama göz önünde bulundurun: 405 nm lazer (Yani, sayı lazer üzerinde aynı koordinatlarda gidecek kez), yineleme sayısını çıkış gücü piksel/alan sayısı (63 X büyütme ve 1024 x 1024 çözünürlük, 1 piksel, 0,21 µm =) ve piksel başına Işınma Zamanı. Tüm bu faktörlerin hücreleri deneyim enerji miktarı etkisi olacak ve böylece oluşturulan (bkz: tartışma daha fazla doz en iyi duruma getirme bilgi için) miktarı ve türü DNA'sının zarar.</li>
	<li>Mikroskop sistem sıkı BAĞLAMAK modülü kullanılarak, mikro-hücreleri ışınlatayım. Not: çoğu sistemde mikro-ışınlama birden fazla hücreyi tek bir alanda noktalar ya da çizgiler/dikdörtgenler (geniş genellikle 1-2 µm) olarak gerçekleştirilebilir. Canlı görüntüleme fluorescently etiketli proteinlerin gerçekleştirirken hemen sonrası hasar, mikro ışınlatayım-her hücre için geçen süre DDR gecikmiş bir indüksiyon içinde neden olur çünkü mikro-ışınlama küçük bir alan başına hücre sayısı için sınırlama. Bu proteinler DNA lezyonlar için çok hızlı bir şekilde işe izlerken özellikle önemlidir.</li>
	<li>
Mikro-ışınlama, çok iyi slaytlar veya tabak bir kuluçka %5 CO2 37 ° C'de işleme örnekleri için önce gerekli süre için koy (Bölüm 5) sonra veya hemen canlı görüntüleme ile devam (Bölüm 3).
	<ol>
<li>İlk adım olarak, bir kaç dakika içinde ve en fazla bir kaç saat sonrası radyoterapi Eğer iletişim kuralı için hücreleri tamir. İşe Alım Kinetik POI bağlı olarak değişebilir. Genellikle, DSBs ve SSBs Kromatin ilişkili proteinler çok hızlı bir şekilde lezyon için yerelleştirilmesine ve bazen 5 dk içinde kaldırılır. Bu da ssDNA bir araya gibi bazı faktörler rezeksiyon makine meşgul olan bir kez daha sonraki zaman noktalarda alınacaktır ve orada saat için (bkz: şekil 1 ve başvuru4) kalır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. canlı görüntüleme Fluorescently etiketli proteinlerin
<ol><li>Mikro ışınlanmış hücre zaman hata görüntüleme gerçekleştirmek. Bir plato elde kadar her 1-2 dk lezyonlar için çok hızlı bir şekilde işe, bir kaç saniye kare başına ideal olacaktır, ancak hasarlı bölgeyi için daha sonra (örneğin, rezeksiyon faktörleri), satın alma yerelleştirmek proteinler için olabilir proteinler gerçekleştirilen için. Not: mümkün olduğu kadar ağartma önlemek için ve protein alımı hasar sitelerdeki sinyal miktar engel doygunluk ulaşmak değil emin olmak için resim alma için lazer gücü en aza indirmek ve sonraki inceliyor (bkz: veri analizi Bölüm 4). Sunulan sistemde görüntüleme 63 X ile yapıldı / 1.4 petrol kullanarak bir 8 µs/piksel Işınma Zamanı, 1024 x 1024 çözünürlük, 1 X zoom, objektif ve 2 / ortalama. Not Bu parametreler diğer sistemleri ve/veya farklı deneyler için optimize edilmiş olması gerekebilir.</li>
	<li>Mikro ışınlatayım-Kinetik ölçümleri kadar ek alanlar hücrelerde için 15-30 hücre elde edilir. Doğruluk ve işe alım Kinetik tekrarlanabilirlik emin olmak için en az 3 kez biyolojik çoğaltır deneylerde yineleyin. Not: Bu iletişim kuralı belirli bir confocal sistemine adapte, o bilinen fluorescently etiketli genom bakım faktörü işe alım Kinetik izleyerek başlatmak yararlı olabilir (örneğin, 53BP1-GFP, RPA32-GFP, vb). Mikro-ışınlama koşulları optimize etmek için canlı görüntüleme kullanarak kullanıcının birden çok parametre hızla test etmek izin verir.</li>
</ol>4. işe alım Kinetik analizi
<ol><li>Microirradiation analiz eklenti10 içinde Fiji görüntü analiz yazılımı11yükleyin.</li>
	<li>
Fiji'de alınan görüntüleri açın. "Hasar Analyzer" Microirradiation Analysis Suite açılan plugins menüsünden seçin. Bir arka plan bölgesi faiz (ROI) (genellikle 3 x 3 µm) ve sigara ışınlanmış ve ışınlanmış ROIs her mikro ışınlanmış hücre tanımlamak için istemleri izleyin.
	<ol>
<li>Potansiyel önyargıları en aza indirmek için kullanım ROIs aynı büyüklükte sinyal yoğunluklarda demek. Elde edilen görüntüler için de temel olarak işe mikro ışınlanmış sitelerde izlemek için kullanılan en az bir ön ışınlama çerçeve içerir.</li>
		<li>Tam hızlandırılmış serisi üzerinde tüm yatırım Getirisi veri topladıktan sonra sonuçlarını içeren bir csv (virgülle ayrılmış dosya) veya txt dosyası (sekmeyle ayrılmış) olarak eklenti tarafından oluşturulan dosyayı kaydedin. Bu dosya her zaman noktası ve her ROI (yani yoğunluğu arka plan, yani yoğunluğu olmayan ışınlanmış ve demek ışınlanmış yoğunluğu) için ortalama yoğunluk ölçümleri içerir. Not: Eklenti otomatik olarak arka plan yoğunluğu çıkarır (benb) düşük radyasyonlu ROIs yoğunluğu (bens) ve sigara ışınlanmış ROIs (benn). Ayrıca photobleaching (ışınlanmış/sigara-ışınlanmış) düzeltmek için (bkz. aşağıdaki formül) her iki değer arasında bir oranı hesaplar. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57410/57410eq1v2.jpg"> Eklenti Ayrıca bir normalleştirme arasında ilk zaman noktası (değeri 1 olarak ayarlayın) ve tüm hesaplar (oranı ilk kez noktaya göre) her çekirdek için diğer zaman puan. Ek bilgi-ebilmek bulunmak üstünde eklenti web sitesi10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tüm mikro ışınlanmış hücreleri için (en az 15-30) eklentisi kullanarak Çözümlemeyi gerçekleştirmek ve zaman içinde ortalama göreli zenginleştirme mikro radyasyona maruz bölgeler itibariyle grafiğini çizer. Her veri için ortalama standart hataları işaret ve onları arsa hesaplayın.
	<ol>
<li>İşe Alım Kinetik öğrencinin tgerçekleştirerek iki deneysel koşullar arasında farklılıklar onaylamak-testler her veri noktası için.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Eğer iletişim kuralı
<ol><li>
Eğer çözümleri hazırlayın. Pre/post-extraction çözüm hazırlamak (% 0.25 içeren buz gibi 1 x PBS Triton X-100), çözüm yıkama (1 x PBS % 0.05 içeren ara-20), çözüm engelleme (% 3 BSA ve %0,05 içeren 1 x PBS ara-20) ve fiksasyon çözüm (Paraformaldehyde % 3 + sukroz %2 PBS 1 içinde x) konik polipropilen borular içinde. Not: tek bir 8-şey microslide için pre/post-extraction çözüm, çözüm, engelleme çözüm 10 mL ve 5 mL fiksasyon çözeltisi yıkama 50 mL 10 mL gereklidir.<ol>
<li>Fiksasyon çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Kimyasal bir başlık altında çift distile su (GKD2O) 400 mL paraformaldehyde 15 g ve 1 L Erlenmeyer şişeye 10 N NaOH 30 µL karıştırın.</li>
			<li>Konteyner ve manyetik karıştırıcı sıcak tabakta 65 ° C ısıda paraformaldehyde tamamen solubilize için karıştırarak kapatın.</li>
			<li>25 mL pipet kullanarak, 50 mL 10 X PBS, heyecan ve 0,45 µm filtre kullanarak filtre ekleyin.</li>
			<li>10 g Sükroz ekleyin ve 500 ml GKD2O. ile tamamlamak</li>
			<li>Aliquot 15 mL konik tüpler çözümde; -20 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Çözüm 1 mg/mL 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 1 x PBS içinde stok çözeltisi sulandrarak boyama çekirdeklerin hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, dikkatle medyayı çok iyi mikroskobu slaytlar veya tabak kuyulardan çıkarıp hemen çözüm iki kez beklemeden değiştirerek Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile yıkayın. Not: Burada sunulan Eğer veri yıkanmış ve tüm çözümler 500 µL içinde inkübe 8-şey mikroskobu slaytlar yetiştirilen hücreleri kullanılarak elde edilmiştir. Birimleri Denemecileri tarafından kullanılan hücre kültürü kapları bağlı olarak ayarlanmalıdır. Ayrıca, hücreleri kolayca cam/polimer alttan bağlantısını kesin olarak aşırı kaygı eğer protokolüyle gerçekleştirin. Bir micropipette tüm çözüm değişiklikleri için hücre kaybı en aza indirmek için kullanın.</li>
	<li>Buz gibi Eğer pre/post-extraction çözüm ve girdap hafifçe el ön ayıklama gerçekleştirmek 15-30 s tarafından bu adım 500 µL ile 5 dk en sitoplazmik ve nucleoplasmic proteinleri kaldırır ve Kromatin sinyalini en üst düzeye çıkarır buz üzerinde kuluçkaya / DNA ilişkili faktörler.</li>
	<li>Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Eğer fiksasyon çözeltinin 500 µL oda sıcaklığında için 15 dk kuluçkaya. Alternatif olarak, önceden yapılmış paraformaldehyde çözüm (3-%4) fiksasyon adım için kullanın.</li>
	<li>Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>On Ice buz gibi Eğer pre/post-extraction çözüm 500 µL içinde 5 min için kuluçkaya ve sürgüyü yavaşça elle permeabilization adımı gerçekleştirmeniz için girdap.</li>
	<li>Eğer çamaşır çözüm 500 µL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Eğer engelleme çözüm olarak 500 µL oda sıcaklığında en az 30 dk kuluçkaya.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak engelleme çözümü kaldırmak ve gecede 4 ° C'de oksijen odasında çözüm engelleme seyreltilmiş 250 µL birincil antikorlar ile kuluçkaya. Not: Kuluçka ardışık olarak potansiyel eş yerelleştirme eserleri önlemek için birincil antikorlar ile gerçekleştirmek için iyi bir yöntemdir. Bir kez uygun denetimleri gerçekleştirilmiş, aynı anda sürecini hızlandırmak için birincil antikorlar kuluçkaya.</li>
	<li>Eğer çamaşır çözüm nazik ajitasyon (bir rotator üzerinde 60 rpm) ile 5 dakika içinde 500 µL için dört kez yıkayın.</li>
	<li>Oksijen odası engelleme çözümde seyreltilmiş ikincil antikorların 250 µL ile 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Not: ikincil antikorlar fluorescently etiketli eklenmesi üzerine ışık örnekleri korumak.</li>
	<li>Dört kez her 5 min için 500 µL Eğer çamaşır çözüm nazik ajitasyon ile yıkayın.</li>
	<li>1 x PBS 1 µg/mL çekirdek leke DAPI içeren 500 µL içinde 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>1 x PBS 500 µL ile iki kez yıkayın ve görüntüleme için PBS çözüm x 1 500 µL hücrelerde bırakın.</li>
	<li>Gridded slaytlar veya kayıtlı sahne pozisyonları kullanarak, iyi karakterize bir DNA hasarı işaretçisi kullanarak mikro ışınlanmış hücreleri bulma (örneğin, γ-H2A.X, RPA32, vb).</li>
	<li>Görüntü çok iyi kültür slaytlar veya uygun ayarlar üzerinde lazer tarama confocal mikroskop kullanarak tüm ilgili Kanallar levha. Not: 63 X ile görüntüleme sunulan sistemde yapılan / 1.4 petrol kullanarak bir 8 µs/piksel Işınma Zamanı, 1024 x 1024 çözünürlük, 1 X zoom, objektif ve 2 / ortalama. Not Bu parametreler diğer sistemleri ve/veya farklı deneyler için optimize edilmiş olması gerekebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).</li><li>Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Method+for+Introducing+Double-Strand+Breaks+into+Cellular+DNA.">A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA.</a> Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).</li><li>Polo, S. E., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+damage+response+proteins+at+DNA+breaks:+a+focus+on+protein+modifications.">Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications.</a> Genes &amp; development. 25 (5), 409-433 (2011).</li><li>Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+spatiotemporal+dynamics+of+mammalian+checkpoint+regulators+induced+by+DNA+damage.">Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage.</a> Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/">https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/</a> (2017)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Izhar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Analysis+of+Factors+Localized+to+Damaged+Chromatin+Reveals+PARP-Dependent+Recruitment+of+Transcription+Factors.">A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors.</a> Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).</li><li>Mar&#233;chal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRP19+Transforms+into+a+Sensor+of+RPA-ssDNA+after+DNA+Damage+and+Drives+ATR+Activation+via+a+Ubiquitin-Mediated+Circuitry.">PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry.</a> Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).</li><li>Dubois, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphorylation-and-ubiquitylation+circuitry+driving+ATR+activation+and+homologous+recombination.">A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).</li><li>Wan, L., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PSO4+Complex+Associates+with+RPA+and+Modulates+the+Activation+of+ATR.">The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).</li><li>Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+human+Psoralen+4+(hPso4)+complex+in+replication+stress+and+homologous+recombination.">The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).</li><li>Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+resection+at+DNA+double-strand+breaks+leads+to+de+novo+telomere+formation+and+enhances+gene+targeting.">Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting.</a> PLoS Genetics. 6 (5), (2010).</li><li>Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+double-strand+DNA+break+repair+by+homologous+recombination.">Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Scientific Reports. 5 (9592), (2015).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Dinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+multiple+DNA+repair+pathways+by+sub-nuclear+damage+induction+methods.">Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods.</a> Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells.">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).</li><li>Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Laser+Micro-irradiation+for+Examination+of+Single+and+Double+Strand+Break+Repair+in+Mammalian+Cells.">Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>Mortusewicz, O., Am&#233;, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-regulated+poly(ADP-ribosyl)ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells.">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li><li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+a+&#947;H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response.">Chemical proteomics reveals a &#947;H2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li><li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy.">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıda belirtilen yöntemlerle, 405 nm lazer mikro-ile BBET veya BrdU ile önceden sensitize hücre DNA lezyonlar DSBs yapisan insan hücrelerinin çekirdekleri içinde dahil yerelleştirilmiş nesil sağlar. Bu DSBs, DDR Kinetik ökaryotik hücreler9,18,19diğer yöntemleri ile oluşturulan benzer. DSB rezeksiyon mikro ışınlanmış sitelerdeki ssDNA-üretimi RPA32 hedefleme antikor veya bir RPA32-GFP füzyon kullanarak ta...

Hücreler sürekli genomik kendi bütünlüğünü tehdit eden endojen ve eksojen DNA hasar kaynakları için sunulur. DDR algılayan, sinyal ve genom istikrarı sürdürmek için DNA lezyonlar onarım yolları sinyal bir topluluk var. DNA çift iplikçikli tatili (DSBs), esas olarak iki tamamlayıcı platformlarda DDR oluşur: Kromatin γ H2A.X etiketli ve genellikle ssDNA bağlama karmaşık RPA1,2ile kaplı rezeke tek iplikçikli DNA (ssDNA) bölge.
UV-lazer mikro-ile timidin analog 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) veya bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Höchst 33342) DNA boya ile önceden sensitize hücreleri de dahil olmak üzere tek iplikçikli sonları (DNA lezyonlar karışımı oluşturur SSBs) ve Kromatin ve ssDNA platformlar3,4' te yerelleştirilmiş bir DDR temin DSBs. Önceki iş işe genom bakım faktörlerin DSB, bu iki farklı platformlar için yüksek enerji UV-A lazerler (335-365 nm) Eğer2,5ile kombine kullanarak ayrımcılık gösterdi. Yüksek enerjili lazer ve özel UV-A aktaran hedefleri 405 nm lazer ile çok daha az yaygın olarak karşılaşılan bazı akademik ve ilaç ayarlarında daha confocal mikroskoplar lazer tarama yapmak gerektiği gibi lazerler ile donatılmış mikroskoplar maliyetlidir satırları. Protein işe alım ve Satım mikro ışınlanmış sitelerdeki çalışmanın da genom bakım faktörler dinamik davranışını tanımlamak için gereken zahmetli el ile görüntü analizi tarafından durdurulmasını emretti.
İşte, BrdU veya BBET nükleik asit leke içeren hücrelerin öncesi Sensitizasyonu 405 nm lazer bir ortak confocal mikroskop genom bakım faktörü dynamics DNA lezyonlar, izleme sağlar mikro-ışınlama kullanarak takip göstermektedir. γ-H2A.X ya da RPA karmaşık alt birimleri için daha fazla alan derinliği ve deconvolution z istifleme birlikte platform işaretçileri için geliştirilmiş çözünürlük kullanarak yerel olarak DSBs için yaymak için bu işe faktörler ayırımcılık deneyci sağlar ilk lezyon çevreleyen büyük Kromatin etki alanları. Bu alt sınıflandırma ayrı intra nükleer bölmeleri göre mikro ışınlanmış sitelere işe uncharacterized proteinlerin potansiyel rolleri rafine yardımcı olur. Ayrıca, uygun iletişim kuralları sağlar ve boru hatları hızla genom bakım faktörler istimal açık kaynak yazılım Fiji (ImageJ dağıtım)6,7,8dinamiklerini analiz etmek için en iyi duruma getirilmiş. Geçerli mikro-radyoterapi yöntemleri için bu ayrıntılandırmaları DDR çalışmanın hemen hemen herhangi bir laboratuvar ortamında mümkün kılıyor.

<table><tbody><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV3000 software (version 2.1)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>Radiation source</td></tr><tr><td>Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1</td><td>Okolab</td><td>OKO-UNO-1</td><td></td></tr><tr><td>60X /1.4 Objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>Oil immersion objective</td></tr><tr><td>8-well culture slides on coverglass (X-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr><tr><td>U2OS osteosarcoma human cell line</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Stable cell lines&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Caution toxic</td></tr><tr><td>5-bromo-2&amp;prime;-deoxyuridine&amp;nbsp;(BrdU)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59-14-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Caution toxic</td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.1%&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>TRX777.100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME transfection reagent&amp;nbsp;</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, + phenol red</td><td>Wisent&amp;nbsp;</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, - phenol red</td><td>Wisent</td><td>319-051-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Wisent&amp;nbsp;</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-RPA32 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2175</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;gamma;-H2A.X antibody</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>9718S</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-53BP1 antibody</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4937S</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-PRP19 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab27692</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4414S</td><td>1:250 for IF</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse&amp;nbsp; IgG Alexa Fluor 488&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4408S</td><td>1:250 for IF</td></tr><tr><td>Fiji image analysis open-source software&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>1918-K Power meter&amp;nbsp; with a 918D-SL-0D3 sensor</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigation of protein recruitment to dna lesions using 405 nm laser micro-irradiation

DNA hasarı yanıt (DDR) proteinler bir bolluk tespit etmek, sinyal ve DNA lezyonlar onarmak için kullanır. Bu yanıtı operasyona genom bakım mekanizmalarını anlamak için önemlidir. İşe Alım ve Satım lezyonlar, proteinlerin son derece dinamik olduğundan, yaptıkları çalışmada hızlı ve dağınık şekilde ayrılmış bir şekilde DNA hasar oluşturma yeteneği gerektirir. Burada, yerel olarak bir 405 nm lazer çizgi ile donatılmış bir yaygın olarak bulunan lazer tarama confocal mikroskop kullanarak insan hücrelerinde DNA hasar ikna etmek için yordamlar açıklar. Faktörler lazer çizgili, ayirt (Eğer) veya gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilir genom bakım birikimi proteinler ile floresan gazetecilere öğesini kullanarak. Fosforile Histon H2A kullanarak. (γ-H2A.X) x ve çoğaltma Protein A (RPA) işaretleyici olarak, yerel olarak işe faktörler üzerinde bitişik Kromatin yayılan bu ayırımcılık için yeterli çözünürlük yöntemdir. Biz daha fazla verimli bir şekilde DNA, protein relocalization Kinetik izlemek için ImageJ tabanlı komut dosyaları siteleri zarar sağlamak. Bu ayrıntılandırmaları DDR dynamics çalışmanın büyük ölçüde basitleştirir.

Mikro-ışınlama hücreleri genom bakım proteinler1,12niteliğine bağlı olarak belirli bir süre için yeniden elde etmek için izin verilir. DSBs enzimler tarafından en yaygın olarak hızla RPA ve diğer genom bakım faktörler9tarafından kaplı ssDNA sınırlı bir bölge oluşturmak için hücre döngüsünün S ve G2 aşamaları sırasında işlenir. Bu ssDNA bölgede yaygın olarak işe alım ve...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation at JoVE.com

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

investigation-protein-recruitment-to-dna-lesions-using-405-nm-laser

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K Görüntüleme.  Université de Sherbrooke. DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Video: Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Genetik

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Kanser Araştırmaları

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Cpf1&#39;i Kullanarak C-Brick DNA Standart Montajı İçin Protokoller

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Biyokimya

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Biyoloji

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler