Name: image-guided resection of glioblastoma and intracranial implantation of therapeutic stem cell-seeded scaffolds
Uploaded: 2018-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds at JoVE.com

著者は、博士キャサリン Pietrosimone から編集の貢献を認めます。PLA の足場は、ノースカロライナ州立大学で博士エリザベス Loboa の研究室で製造されました。この作品は、UNC 施設の大学がん研究基金と UNC トランスレーショナルリサーチと臨床科学研究所 (KL2TR001109、UL1TR001111) によって支えられました。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のノースカロライナ大学チャペルヒル校によって承認されています。
注: 開く開頭術、マウスにこの手順を実行 Mostany と・ ポルテラ Cailliau19の摘出は骨組織を破棄する前記によるプロトコルの修正されたバージョンとして設立バリアフリー脳を残して、最終的な糸球体基底膜腫瘍切除術。小沢氏とジェームズの20記載, 開頭手術後腫瘍は定位注入を介して確立されます。我々 インプラント (前から mm) で次の定位座標で 1 × 105 U87 mCh Fl 細胞: (2.5, 0,-0.5)。
1. 細胞培養足場の準備
注: 足場は、マウスに注入する前に 48 h が準備されるべき。以下のボリュームは、足場ごとに基づいて提供しています。追加足場の必要に応じて数量を乗算します。
<ol><li>切除キャビティ サイズ (約 2 mm × 2 mm) に PLA の足場を切る。足場は、はさみを使用してまたは再現性の穴パンチを使用して手でカットできます。</li>
	<li>滅菌 PBS 中に浸漬後 15 分間 70% エタノールに浸漬します。播種用細胞を準備している間 10% 牛胎児血清 (FBS) 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) に足場を配置します。</li>
	<li>0.05% トリプシン (T75 フラスコの 3-5 mL) を用いた培養 MSCs を持ち上げます。37 ° C、5 分セルが持ち上げたことを確認で孵化させなさい、トリプシンを不活化するフラスコに 7-10 mL DMEM を追加します。</li>
	<li>15 mL 遠心管にフラスコの内容を転送します。診断を使用してセルをカウントします。5 x 105 5 分 100 × g で遠心分離を介して各足場 MSCs をペレットします。</li>
	<li>上清を吸引し、5 x 10 の5セルあたり 5 μ l 添加 DMEM で MSCs を再懸濁します。</li>
	<li>それらの乾燥を叩き、シードの足場を準備します。<ol>
<li>DMEM 浸漬から鉗子で足場を削除し、一時的に 6 ウェル プレートの蓋の上に置きます。過剰な DMEM の液滴を残して、ふたを足場を持ち上げます。</li>
		<li>新しい、乾燥場所で、再び蓋に戻って足場を配置します。3-5 回、繰り返す播種 6 ウェル プレートで部分的に乾燥した足場を配置します。各足場に対して繰り返します。 注: 部分的乾燥足場は、最適な細胞播種結果を提供します。足場が余りにぬれている場合、細胞は足場をオフにスライドし、ウェル プレートの下に従います。足場があまりにも乾燥している場合、液滴が全体の足場は、貧しい人々 の初期細胞配分に終って上普及していません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピペットを使用して、優しく、底に解決するかもしれないいくつかの細胞懸濁液を均質化する幹細胞のバイアルをミックスします。</li>
	<li>ゆっくりと新鮮な足場では、足場の上に小さな液滴を作成する上で直接 MSC を懸濁液を混合 2.5 μ L をピペットします。</li>
	<li>各井戸の端に 300 μ L DMEM を追加します。これはセル液滴の急速な蒸発を防ぐ。足場に付けるセルを許可する 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>鉗子、優しくウェル プレートで足場を反転します。シード 2.5 μ L 混合新鮮な MSC に懸濁液 (この結果、足場ごとシード 5 x 10 の5セルの合計)。足場に付けるセルを許可する 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>6 ウェル プレートの各ウェルに 2 mL を追加して DMEM で足場をカバーしてください。メディアがそれらの下に流れるように足場をそっと持ち上げます。移植手術前に 48 h にこの状態で 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>24 h と追加/変更メディア後足場を確認する余分な蒸発または pH の不均衡のため変色したメディアが観察される場合。</li>
</ol>2. 蛍光ガイド下切除と足場注入
注: 手術の初期化前にすべてのツールを滅菌します。機関 IACUC プロトコルに従って、予防的鎮痛を管理します。
<ol><li>解剖顕微鏡蛍光の段階の脳定位固定装置のフレームを配置します。</li>
	<li>誘導室における吸入イソフルランの下にマウスを麻酔します。一度麻酔、イソフルラン ノーズコーン アダプターを介して連続的な吸入麻酔供給脳定位固定装置のフレームでマウスを固定します。加熱パッドやプローブの体温を維持します。 注: 4-5% イソフルランは誘導に適した 2-3% 維持のために適して、この適応および各マウスの監視が必要であります。</li>
	<li>角膜の乾燥を防ぐために目に眼軟膏を適用します。3 つのアルコールや betadine ワイプの 3 つのシリーズで頭皮の切開部位を消毒します。</li>
	<li>各肢のつま先ピンチ反射テストを実行し、適切な anesthetization を確保するための否定応答を確認します。約 55 65 呼吸/分で安定した呼吸率を確保します。</li>
	<li>鉗子を使用して、ピンチ、優しく頭皮を持ち上げます。外科はさみで正中線の線形の吻側尾側切開を作る。PBS の切開部位に水を引くし、ブラッシングの円運動で綿の先端アプリケータと皮下脂肪を除去します。以前に確立した頭蓋ウィンドウが完全に表示されるよう、皮膚を配置します。</li>
	<li>優しくだけ 18 G 針を用いて頭蓋のウィンドウの境界線の内側の硬膜を穿刺します。切開完全トレース ウィンドウの内部までを繰り返します。</li>
	<li>硬膜を削除するには、離れて明らかに基になる柔組織と腫瘍の微細鉗子を使用してそれを剥離します。</li>
	<li>部屋のライトをオフにして、実体顕微鏡蛍光モードをオンにして U87 mCh フロリダ腫瘍を見つけます。真空ポンプのチューブの端に 1-200 μ L ピペット チップを読み込むことによって切除の準備します。</li>
	<li>真空ポンプをオンにします。信号がなくなるまで優しく蛍光組織を吸引によって腫瘍を切除します。真空ポンプの電源を切り、ピペット チップを破棄します。オン オフ蛍光と部屋のライトを入れます。 注: 出血を制御するため冷 PBS で灌漑し、綿の先端アプリケータと着実に圧力を適用します。深刻なケースで切除空洞も一時的にパックできます止血剤で出血が別の PBS の灌漑に続いて停止した後削除されます限り。</li>
	<li>注入直前にゆっくりと不要なメディアおよび関連コンポーネントを削除する PBS の PLA の MSC シード足場を浸しなさい。切除空洞に足場を注入します。必要な場合は、場所に 1 μ L フィブリノゲン (67 106 mg/mL) 1 μ L トロンビン、足場を確保する (400 625 な U/mL) に続いてを追加します。</li>
	<li>削除硬膜と骨フラップ既に破棄頭蓋の] ウィンドウから、皮膚を閉じるし、手術用の接着剤を適用するだけで傷をシールします。吸入麻酔薬から動物を外し、加熱面に回復することができます。</li>
	<li>ケージに戻り、一度歩行マウス。IACUC 承認スケジュールで鎮痛剤を管理します。各マウスの手順を繰り返します。</li>
</ol>3. 術後画像
<ol><li>28 G インスリン注射用の針を使用して、D-ルシフェリン (150 mg/kg 腹腔内投与) でマウスを注入します。</li>
	<li>10 分を待ちます。これは体全体を循環し、ピークの式を取得する脳内ルシフェラーゼ発現がん細胞と反応するルシフェリンをできるようになります。</li>
	<li>(前述のように) として、イソフルラン麻酔下で生物発光イメージング腫瘍を可視化する (結合) システムでマウスをイメージします。必要な (数秒から数分) 腫瘍の大きさに応じて、露出時間は異なります。</li>
	<li>腫瘍の成長速度を決定するため必要に応じて画像検査手順を繰り返します。動物の健康を監視し続けます。 注: 治療上の MSCs 恒常トレイル、がん細胞を殺すと全体的な腫瘍の成長を抑制することを表明します。2-5 日ごとのイメージングは、この目的のため十分な頻度を提供します。</li>
	<li>IACUC プロトコルで説明されている定義済みのエンドポイントが満たされているとき、transcardial 潅流によってマウスを犠牲にし解析のためのティッシュを収集します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Adamson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+a+review+of+where+we+have+been+and+where+we+are+going.">Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going.</a> Expert opinion on investigational drugs. 18 (8), 1061-1083 (2009).</li><li>Asthagiri, A. R., Pouratian, N., Sherman, J., Ahmed, G., Shaffrey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Brain+Tumor+Surgery.">Advances in Brain Tumor Surgery.</a> Neurologic Clinics. 25 (4), 975-1003 (2007).</li><li>Affronti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+of+newly+diagnosed+glioblastoma+patients+receiving+carmustine+wafers+followed+by+radiation+and+concurrent+temozolomide+plus+rotational+multiagent+chemotherapy.">Overall survival of newly diagnosed glioblastoma patients receiving carmustine wafers followed by radiation and concurrent temozolomide plus rotational multiagent chemotherapy.</a> Cancer. 115 (15), 3501-3511 (2009).</li><li>Erpolat, O., Akmansu, M., Goksel, F., Bora, H., Yaman, E., B&#252;y&#252;kberber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+newly+diagnosed+glioblastoma+patients+treated+by+radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide:+a+long-term+analysis.">Outcome of newly diagnosed glioblastoma patients treated by radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide: a long-term analysis.</a> Tumori. 95 (2), 191-197 (2009).</li><li>Minniti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma+in+elderly+patients.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma in elderly patients.</a> Journal of Neuro-Oncology. 88 (1), 97-103 (2008).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P., Corrales-Garc&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18 (11), 1062-1071 (2016).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticle-labeled+mesenchymal+stem+cell+tropism+to+malignant+gliomas+using+magnetic+resonance+imaging.+Laboratory+investigation.">In vivo tracking of superparamagnetic iron oxide nanoparticle-labeled mesenchymal stem cell tropism to malignant gliomas using magnetic resonance imaging. Laboratory investigation.</a> Journal of Neurosurgery. 108 (2), 320-329 (2008).</li><li>Nakamizo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+treatment+of+gliomas.">Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.</a> Cancer Research. 65 (8), 3307-3318 (2005).</li><li>Xu, F., Shi, J., Yu, B., Ni, W., Wu, X., Gu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+mediate+mesenchymal+stem+cell+migration+toward+gliomas+in+vitro.">Chemokines mediate mesenchymal stem cell migration toward gliomas in vitro.</a> Oncology Reports. 23 (6), 1561-1567 (2010).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4-transfected+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+exhibit+enhanced+migratory+capacity+toward+gliomas.">CXCR4-transfected human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells exhibit enhanced migratory capacity toward gliomas.</a> International Journal of Oncology. 38 (1), 97-103 (2011).</li><li>Ho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Metalloproteinase+1+Is+Necessary+for+the+Migration+of+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Toward+Human+Glioma.">Matrix Metalloproteinase 1 Is Necessary for the Migration of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Toward Human Glioma.</a> STEM CELLS. 27 (6), 1366-1375 (2009).</li><li>Bexell, D., Svensson, A., Bengzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+therapy+for+malignant+glioma.">Stem cell-based therapy for malignant glioma.</a> Cancer Treatment Reviews. 39 (4), (2012).</li><li>Nouri, F., Wang, X., Hatefi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+theranostic+mesenchymal+stem+cells+for+the+evaluation+of+the+anticancer+efficacy+of+enzyme/prodrug+systems.">Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems.</a> Journal of Controlled Release. 200, 179-187 (2015).</li><li>Kauer, T., Figueiredo, J. -. L., Hingtgen, S., Shah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+therapeutic+stem+cells+implanted+in+the+tumor+resection+cavity+induce+cell+death+in+gliomas.">Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas.</a> Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).</li><li>Bag&#243;, J., Pegna, G., Okolie, O., Hingtgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+matrices+enhance+the+transplant+and+efficacy+of+cytotoxic+stem+cell+therapy+for+post-surgical+cancer.">Fibrin matrices enhance the transplant and efficacy of cytotoxic stem cell therapy for post-surgical cancer.</a> Biomaterials. 84, 42-53 (2016).</li><li>Bag&#243;, J., Pegna, G., Okolie, O., Mohiti-Asli, M., Loboa, E., Hingtgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+scaffolds+increase+the+efficacy+of+stem+cell-mediated+therapy+of+surgically+resected+glioblastoma.">Electrospun nanofibrous scaffolds increase the efficacy of stem cell-mediated therapy of surgically resected glioblastoma.</a> Biomaterials. 90, 116-125 (2016).</li><li>Loebinger, M., Eddaoudi, A., Davies, D., Janes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell+Delivery+of+TRAIL+Can+Eliminate+Metastatic+Cancer.">Mesenchymal Stem Cell Delivery of TRAIL Can Eliminate Metastatic Cancer.</a> Cancer Research. 69 (10), 4134-4142 (2009).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).</li></ol>

夫妻のシート、Bagó、および Hingtgen の諸相幹細胞と足場技術 UNC チャペルヒルからライセンスを取得しているファルコン治療で公平があります。

次の点を考慮に入れて精度を最大化し、時間のかかる落とし穴を避けることを考えれば通常マウスあたり 30 分以内で手術を完了できます。まず、正しく手順を開始する前に脳定位固定装置でマウスを確認します。不要な頭の動きは、開頭手術の手術の精度、腫瘍移植と腫瘍切除の程度の位置に制限されます。切除前、硬膜腫瘍の部分を完全に削除します。それを吸引中にステータス退避とタ...

膠芽腫 (GBM) は、成人、陰気な生存期間中央値は 12-15 ヶ月1,2,3,4、5の最も一般的な脳腫瘍の症例です。2005 現在の放射線と併用し、補助のテモゾロマイド化学療法に続いて最大の外科的切除の臨床標準の頃6,7を採用したので生存率は、大幅に改善しません。この治療法は、患者の症状の一時的な救済を提供しながら治療の標準に必ず結果再発浸潤癌病巣切除を回避するし、血液脳関門 (BBB) によって全身療法から保護されます。この積極的な衰弱させる病気に対するトラクションを得るためには、BBB を回避しながら腫瘍浸潤巣を対象とする戦略が急務します。
ヒト間葉系幹細胞 (MSCs) は、そのネイティブの腫瘍親和性8,9による糸球体基底膜の配送車薬として約束を示します。MSCs の受容体を持っているし、間質細胞由来因子 1 α など、腫瘍が分泌する可溶性因子への移行 (自衛隊 1 α)、マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ 1 (MMP 1)、および単球走化性因子タンパク質-1 (MCP-1) 他の人の間で10,11,12,13。 工学 MSCs 表現および細胞毒性薬を分泌する腫瘍ホーミング薬物送達車として活かされることができます。設計された MSCs は、腫瘍浸潤巣に向かって移動、治療用タンパク質を提供します。このアプローチは、さまざまな臨床糸球体基底膜モデル9,14の可能性を実証しています。しかし、これらのモデルの大半はこのコンポーネントの臨床関連性にもかかわらず外科的切除を含めないでください。切除の新しいモデルを用いた研究を新たな外科的摘出が摘出腔15に直接注入される幹細胞の永続性を減少させることを明らかにしました。実行可能性の損失結果減少効果、腫瘍浸潤病巣に線量そして薬剤の持続期間の減少により可能性が配信されました。
幹細胞と薬剤投与を増やす、注入前に足場に MSCs をシードできます。このプロトコルでは生体親和性と吸収性のエレクトロスピニング ナノ poly(lactic acid))、MSCs PLA 折り曲げとインプラント治療のカバレッジを最大化、最小化時に切除キャビティの形状に適合のための足場として使用されます、。MSCs の距離は、腫瘍細胞に到達する旅行する必要があります。MSCs は、注入中に足場上に残ります、注入16,17後腫瘍細胞へ足場を移行します。MSCs と彼らを運ぶ、細胞傷害性薬剤は腫瘍巣に蓄積されます。腫瘍への薬剤の配達には、MSC 生存率および足場の注入による支援の永続化が必要です。
この手順でレンチウイルスベクターを使用 (体外追跡) 蛍光と発光 (生体内での追跡) を安定に発現を誘導するがんと幹細胞ラインのマーカー。ヒト糸球体基底膜ライン U87 は mCherry とホタルのルシフェラーゼ (U87 母子-フロリダ州) と GFP および renilla ルシフェラーゼ (MSC GFP Rluc) と非治療の MSCs に感染しています。MSCs の治療のバリエーションは、tnf α 関連アポトーシス誘導リガンド (TRAIL-MSC) を表現します。近くの癌の死の受容体にバインド トレイル、構成的分泌蛋白質、細胞およびカスパーゼ - アポトーシス18を開始。
ここでは、前臨床画像誘導 GBM の外科的切除と MSC シード足場の注入のためのプロトコルを提供します。簡単に言えば、ヌードマウスに開頭手術 3 日後に原発腫瘍を確立する U87 mCh フロリダの定位の同所性注入が続きますが与えられています。明らかな移植腫瘍は、約 1 週間の期間が増加します。PLA の足場は、切除手術する前に MSCs 48 h にシードされます。蛍光の指導の下で腫瘍は切除し、MSC ロード足場が切除キャビティ内に注入されます。腫瘍の負担とマウスの生存率は、生物発光イメージング (結合) の手術後、追跡されます。これらのプロシージャのタイムラインを (図 1) を以下に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57452/57452fig1.jpg"> 図 1: プロシージャのタイムライン。マウスは、当初頭蓋ウィンドウ (0 日) を受け取る。腫瘍は、3 日間の回復期間後 (日 3) を注入し、約 1 週間の成長します。足場は、腫瘍の切除と移植の手順 (10 日) の前に 2 日間 MSCs (8 日) にシードされます。腫瘍の進行と治療効果は、術後その後イメージング (日 10 +) を介して評価されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57452/57452fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>Just for mouse stereotaxic instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Maintains steady head positioning during surgery</td></tr><tr><td>Fluorescence dissecting stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC&amp;nbsp;</td><td>Allows real-time imaging of tumor during resection</td></tr><tr><td>Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system</td><td>Stoelting</td><td>53315</td><td>Allows precise tumor cell injection volume and rate</td></tr><tr><td>Vetbond tissue adhesive</td><td>3M</td><td>1469</td><td>Sugical glue to close skin wound</td></tr><tr><td>Artificial tears</td><td>Akorn</td><td>664268</td><td>Prevents eyes from drying during surgery</td></tr><tr><td>Webcol alcohol preps</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td>Sterilize incision site</td></tr><tr><td>Betadine surgical scrub</td><td>Purdue Fredick Company</td><td>6761815117</td><td>Sterilize incision site</td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicators</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-115</td><td>Surgery tool</td></tr><tr><td>E-vac aspirating system</td><td>Argos</td><td>EV310</td><td>Vacuum pump used to resect tumor</td></tr><tr><td>Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL</td><td>Baxter</td><td></td><td>To temporarily secure the scaffold in the resection cavity</td></tr><tr><td>IVIS Kinetic in vivo optical imaging system</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td>Bioluminescent Imager</td></tr><tr><td>D-Luciferin potassium salt</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>In vivo imaging agent</td></tr></tbody></table>

image-guided resection of glioblastoma and intracranial implantation of therapeutic stem cell-seeded scaffolds

膠芽腫 (GBM)、最も一般的で積極的な脳腫瘍の症例は 12-15 ヶ月の余命を運ぶ。余命の短いは、侵襲性の腫瘍巣を除去するために続いて放射線と化学療法、外科的切除から成る現在の治療のできない一部予定です。これらの病巣の治療は、抗腫瘍ヒト間葉系幹細胞 (MSCs) によって改善されること。MSCs では、強力な腫瘍親和性を展示し、腫瘍細胞を殺す表現治療タンパク質を設計することができます。前臨床モデルの進歩を示すその切除早期 MSC 喪失を誘導し、治療効果を低減します。MSC 治療の有効性は、生分解性 poly(lactic acid)) 足場に播種 MSCs によって改善できます。PLA 足場に外科的切除空洞に MSC 配信は、セルの保持、保存、および腫瘍の殺害を復元します。糸球体基底膜の PLA の MSC シード注入の効果を研究、正確な前臨床モデルが必要です。ここで注入後 MSC シード足場免疫欠損マウスにおける糸球体基底膜の画像ガイド下腫瘍切除のため前臨床外科プロトコルを提供します。MSCs は、構成を表現し、蛍光の追跡を許可する緑色蛍光タンパク質 (GFP) と同様、治療 tnf α 関連アポトーシス誘導リガンド (TRAIL) を分泌するレンチ ウイルスの構造に設計されています。同様に、U87 腫瘍細胞は、エクスプレス mCherry とホタルのルシフェラーゼ、デュアル蛍光/発光の追跡を提供する設計されています。現在、治療の幹細胞を介した配信を調査に使用、このプロトコルは糸球体基底膜の他の介入に外科的切除の影響を調査する変更でした。

U87 腫瘍細胞は、高速 mCherry しホタルのルシフェラーゼ (U87 母子-フロリダ州)、注入前と画像誘導切除および発光 (図 2 a・ C) を追跡できるように設計されました。幹細胞同様に診断 GFP-Rluc (MSC GFP) または治療の GFP 試み (MSC 歩道) で設計されて, 添付ファイル (図 2 Dの-F) の増殖を確認する PLA 足場上.</...

Watch this Scientific Journal Video about Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds at JoVE.com

Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

膠芽腫の治療の幹細胞シード足場の頭蓋内注入画像誘導切除

腫瘍を求めて治療間葉系幹細胞 (MSCs) 侵襲神経膠芽腫のための処置として約束を示します。最適な移植には、足場に腫瘍切除キャビティへの MSCs の配信が含まれます。ここでは、神経膠芽腫の MSC 治療を研究する臨床技術を含んで提供される: 画像ガイド下腫瘍切除;MSC シード足場; の注入術後療法を追跡します。

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in ...

image-guided-resection-glioblastoma-intracranial-implantation

Research

JoVE Journal

Medicine

8.2K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. 腫瘍を求めて治療間葉系幹細胞 (MSCs) 侵襲神経膠芽腫のための処置として約束を示します。最適な移植には、足場に腫瘍切除キャビティへの MSCs の配信が含まれます。ここでは、神経膠芽腫の MSC 治療を研究する臨床技術を含んで提供される: 画像ガイド下腫瘍切除;MSC シード足場; の注入術後療法を追跡します。

ビデオ: Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単​​なガイドスクリュー方式

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

医学

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの</emマウス神経膠腫の>生物発光イメージング

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

定位頭蓋内注入と<emインビボ&gt;</em多形性膠芽腫のマウスモデル系における腫瘍異種移植片の&gt;生物発光イメージング

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers patients only modest benefits, as most patients do not survive more than five years following diagnosis due to glioma relapse 1,2. The discovery of cancer stem cells in human brain tumors holds promise for having an enormous impact on the development of novel therapeutic strategies for glioma 3. Cancer stem cells are defined by their ability both to self-renew and to differentiate, and are thought to be the only cells in a tumor that have the capacity to initiate new tumors 4. Glioma relapse following radiation therapy is thought to arise from resistance of glioma stem cells (GSCs) to therapy 5-10. In vivo, GSCs are shown to reside in a perivascular niche that is important for maintaining their stem cell-like characteristics 11-14. Central to the organization of the GSC niche are vascular endothelial cells 12. Existing evidence suggests that GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells are important for tumor development, and identify GSCs and their interaction with endothelial cells as important therapeutic targets for glioma. The presence of GSCs is determined experimentally by their capability to initiate new tumors upon orthotopic transplantation 15. This is typically achieved by injecting a specific number of GBM cells isolated from human tumors into the brains of severely immuno-deficient mice, or of mouse GBM cells into the brains of congenic host mice. Assays for tumor growth are then performed following sufficient time to allow GSCs among the injected GBM cells to give rise to new tumors-typically several weeks or months. Hence, existing assays do not allow examination of the important pathological process of tumor initiation from single GSCs in vivo. Consequently, essential insights into the specific roles of GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells in the early stages of tumor initiation are lacking. Such insights are critical for developing novel therapeutic strategies for glioma, and will have great implications for preventing glioma relapse in patients. Here we have adapted the PoRTS cranial window procedure 16and in vivo two-photon microscopy to allow visualization of tumor initiation from injected GBM cells in the brain of a live mouse. Our technique will pave the way for future efforts to elucidate the key signaling mechanisms between GSCs and vascular endothelial cells during glioma initiation.

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

By combining a polished and reinforced thin-skull (PoRTS) cranial window and glioblastoma (GBM) cell injection, we can observe glioma initiation and growth from injected GBM cells in the brain of a live mouse longitudinally.

イメージンググリオーマ開始<emインビボで&gt;</em&gt;ポリッシュと補強シン頭蓋骨頭蓋窓スルー

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed electric fields (PEFs) are promising for the improvement of treatment efficiency. However, they rely on rigid electrodes that cause acute and chronic damage, especially in soft tissues such as the brain. In this work, flexible electronics were used to deliver PEFs to tumors and the biological response was evaluated with fluorescent microscopy. Interdigitated gold electrodes on a thin, transparent parylene-C substrate were coated with the conducting polymer PEDOT:PSS, resulting in a conformable and biocompatible device. The effects of PEFs on tumors and their microenvironment were examined using various biological models. First, monolayers of glioblastoma cells were cultured on top of the electrodes to investigate phenomena in vitro. As an intermediate step, an in ovo model was developed where engineered tumor spheroids were grafted in the embryonic membrane of a quail. Due to the absence of an immune system, this led to highly vascularized tumors. At this early stage of development, embryos have no immune system, and tumors are not recognized as foreign bodies. Thus, they can develop fast while developing their own vessels from the existing embryo vascular system, which represents a valuable 3D cancer model. Finally, flexible electrode delivery of PEFs was evaluated in a complete organism with a functional immune system, using a syngenic, orthograft (intracranial) mouse model. Tumor spheroids were grafted into the brain of transgenic multi-fluorescent mice prior to the implantation of flexible organic electrode devices. A sealed cranial window enabled multiphoton imaging of the tumor and its microenvironment during treatment with PEFs over a period of several weeks.

This work describes the development of flexible interdigitated electrodes for implementation in 3D brain tumor models, namely, in vitro culture, in ovo model, and in vivo murine model. The proposed method can be used to evaluate the effects of pulsed electric fields on tumors at different levels of complexity.

膠芽腫のパルス電界治療のための柔軟な有機電子デバイス

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

がん研究

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

2P-IVMを用いた脳腫瘍内ナノ粒子のマウスリアルタイム追跡

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the accumulation and distribution of macromolecules in brain tumors in vivo would greatly enhance our ability to understand and optimize drug delivery in preclinical models. This protocol describes a method for real-time in vivo tracking of intravenously administered fluorescent-labeled nanoparticles with two-photon intravital microscopy (2P-IVM) in a mouse model of glioblastoma (GBM).
The protocol contains a multi-step description of the procedure, including anesthesia and analgesia of experimental animals, creating a cranial window, GBM cell implantation, placing a head bar, conducting 2P-IVM studies, and post-surgical care for long-term follow-up studies. We show representative 2P-IVM imaging sessions and image analysis, examine the advantages and disadvantages of this technology, and discuss potential applications.
This method can be easily modified and adapted for different research questions in the field of in vivo preclinical brain imaging.

著者スポットライト:膠芽腫治療における薬物送達と早期発見を最適化するためのマルチモーダルイメージング戦略

We present a novel approach for two-photon microscopy of the tumor delivery of fluorescent-labeled iron oxide nanoparticles to glioblastoma in a mouse model.

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

膠芽腫の治療の幹細胞シード足場の頭蓋内注入画像誘導切除

要約

さらに動画を探す

この動画の章

マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単なガイドスクリュー方式

その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの生物発光イメージング

定位頭蓋内注入と

イメージンググリオーマ開始

膠芽腫のパルス電界治療のための柔軟な有機電子デバイス

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

膠芽腫の治療の幹細胞シード足場の頭蓋内注入画像誘導切除

要約

さらに動画を探す

この動画の章

マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単​​なガイドスクリュー方式

その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの生物発光イメージング

定位頭蓋内注入と

イメージンググリオーマ開始

膠芽腫のパルス電界治療のための柔軟な有機電子デバイス

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単なガイドスクリュー方式