Name: image-guided resection of glioblastoma and intracranial implantation of therapeutic stem cell-seeded scaffolds
Uploaded: 2018-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds at JoVE.com

저자 박사 캐서린 Pietrosimone에서 사설 기여를 인정합니다. PLA 건설 기계는 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 박사 엘리자베스 Loboa의 연구소에 의해 제조 되었다. 이 작품은 UNC Lineberger 종합 암 센터의 암 연구 기금 및 UNC 변환 및 임상 과학 연구소 (KL2TR001109, UL1TR001111)에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 노스 캐롤라이나 대학의 채 플 힐에서에 의해 승인 되었습니다.
참고:이 절차는 오픈 craniotomy와 쥐에 수행 Mostany와 Portera-리아우19 수술로 제거 된 뼈 조직을 삭제 점에서 프로토콜의 수정된 된 버전으로 떠나는 두뇌 설립에 대 한 접근 및 궁극적인 GBM 종양의 절제입니다. 오자와 제임스20에 설명 된 대로 craniotomy, 종양 정위 적 주입을 통해 설립 됩니다. 우리는 다음 정위 적 좌표에 (mm)에서 bregma 1 x 105 U87 mCh-플로리다 세포 이식: (2.5, 0,-0.5).
1. 세포 배양 준비 발판 및
참고: 건설 기계 48 h 쥐에 주입 하기 전에 준비 되어야 한다. 다음 볼륨 당 발판으로 제공 됩니다. 추가 건설 기계에 대 한 필요에 따라 수량을 곱하면 됩니다.
<ol><li>PLA 건설 기계 절제술 구멍 크기 (약 2mm x 2mm) 조각으로 잘라. 건설 기계가 위를 사용 하 여 또는 반복성에 대 한 구멍 펀치를 사용 하 여 손으로 자를 수 있습니다.</li>
	<li>15 분 뒤에 PBS에 immersing 70% 에탄올에 immersing 하 여 소독. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스 시드를 위한 세포를 준비 하는 동안 포함 된에 비 계를 배치 합니다.</li>
	<li>0.05 %trypsin (T75 플라스 크에 대 한 3-5 mL)을 사용 하 여 교양된 MSCs를 들어올립니다. 5 분 셀 해제는 없는지에 대 한 37 ° C에서 품 어 다음 트립 신 비활성화를 플라스 크에 7-10 mL DMEM을 추가 합니다.</li>
	<li>15 mL 원심 분리기 튜브를 플라스 크 내용을 전송 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 5 x 105 MSCs 5 분 x 100g에 원심 분리를 통해 각 비 계에 대 한 작은</li>
	<li>상쾌한 오프 aspirate와 5 x 105 셀 당 5 µ L DMEM에서에서 MSCs를 resuspend.</li>
	<li>건조 그들에 아 티 하 여 시드에 건설 기계를 준비 합니다.<ol>
<li>DMEM 침수에서 집게로는 비 계를 제거 하 고 일시적으로 6-잘 접시의 뚜껑에 배치. 초과 DMEM의 물방울을 남겨두고 뚜껑을 비 계를 들어올립니다.</li>
		<li>다시 새로운, 건조 위치에에서 뚜껑에 다시 발판을 놓습니다. 반복 3-5 번, 다음 시드를 위한 새로운 6 잘 플레이트에 부분적으로 말린된 비 계를 배치 합니다. 각 비 계를 반복 합니다. 참고: 부분적으로 말린된 비 계 시드 결과 최적의 셀을 제공 합니다. 발판 너무 젖은 경우에, 세포 발판 미끄러져 하 고 잘 플레이트 아래에 준수. 발판은 너무 건조, 드롭릿에 가난한 초기 셀 배포 결과 전체 비 계에 확산 되지 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여, 부드럽게 줄기 세포 일부 셀 바닥에 정착 할 수 있습니다 중지를 균질의 유리병 믹스.</li>
	<li>천천히 2.5 µ L 갓 MSC 정지 비 계, 발판의 정상에 작은 물방울을 만들기에 직접 혼합 플라스틱.</li>
	<li>300 µ L DMEM의 각 가장자리를 추가 합니다. 이 셀 물방울의 급속 한 증발이 되지 것입니다. 발판에 연결할 셀 수 있도록 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>겸 자와 함께 부드럽게 플립는 건설 기계 잘 접시에. 씨 2.5 혼합 갓 µ L MSC 현 탁 액 (비 계 당 시드 5 x 105 셀의 총에서 결과). 발판에 연결할 셀 수 있도록 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 각 음을 2 mL를 추가 하 여 DMEM에서 건설 기계를 커버. 그들 밑에 흐르는 매체를 허용 하는 건설 기계를 부드럽게 들어올립니다. 이식 수술 전에 48 h에 대 한이 상태에서 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>초과 증발 또는 pH 불균형으로 인해 변색된 미디어 관찰 되는 경우 24 시간 및 추가/변경 미디어 후에 건설 기계를 확인 합니다.</li>
</ol>2. 형광 유도 절제 및 비 계 주입
참고: 초기화 수술 전에 모든 도구 소독. 관리 예방 무 통 기관 IACUC 프로토콜에 명시 된.
<ol><li>Stereomicroscope 해 부 형광의 무대에서 stereotaxic 프레임을 배치 합니다.</li>
	<li>유도 챔버에서 흡입된 isoflurane 아래 마우스 anesthetize 취, 일단 isoflurane 코 콘 어댑터를 통해 지속적인 흡입된 마 취 공급 stereotaxic 프레임에 마우스를 보안 합니다. 가 열 패드 또는 프로브 체온을 유지 한다. 참고: 4-5 %isoflurane 유도 적합 및 2-3%는 유지 보수에 적합 하지만이 적응 되어야 하며 각 마우스에 대 한 모니터링.</li>
	<li>각 막의 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다. 3 알코올 및 3 betadine 잎사귀의 일련의 두 피 절 개 사이트를 소독.</li>
	<li>각 다리에 발가락 핀치 반사 테스트를 수행 하 고 적절 한 anesthetization를 위해 부정적인 응답을 확인 합니다. 약 55-65 호흡/분 꾸준한 호흡 속도 확인 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 꼬 집 고 두 피를 부드럽게 리프트. 수술가 위로 중간 선형 rostral 꼬리 절 개를 확인 합니다. PBS와 절 개 사이트를 관개 하 고 솔 질 원운동에 목화 제보 주걱으로 쳇 지방 제거. 이전에 설립 두개골 창 완전히 표시 되도록 피부를 정렬 합니다.</li>
	<li>그냥 인테리어는 18 G 바늘을 사용 하 여 두개골 창의 테두리를 경질을 찔린 부드럽게 합니다. 절 개는 완벽 하 게 윈도우의 내부 추적 될 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>멀리 공개 기본 실질과 종양 미세 집게를 사용 하 여 그것을 박 리 하 여 두 라를 제거 합니다.</li>
	<li>객실 조명 및 stereomicroscope 형광 모드 의해 U87 mCh-플로리다 종양을 찾습니다. 진공 펌프의 배관의 끝에 1-200 µ L 피 펫 팁을 로드 하 여 절제에 대 한 준비.</li>
	<li>진공 펌프를 켭니다. 신호가 남아 때까지 부드럽게 형광 조직 발음 하 여 종양을 resect. 진공 펌프를 끄고 열이 피 펫 팁 삭제. 형광 조명에 다시 룸을 끌. 참고: 출혈을 제어 하려면 차가운 PBS와 관개 하 고 목화 제보 주걱으로 꾸준한 압력을 적용 합니다. 더 심한 경우 절제술 구멍 수 또한 일시적으로 포장 hemostatic 에이전트도 출혈 뒤에 또 다른 PBS 관개 멈춘 후 제거 됩니다.</li>
	<li>이식, 직전 원치 않는 미디어와 관련 된 구성 요소를 제거 하는 PBS에 MSC 시드 PLA 비 계를 찍어 천천히. 절제술 캐비티에 발판을 이식. 필요한 경우, 장소에 1 µ L fibrinogen (67-106 mg/mL) 1 µ L 트 롬 빈 (400-625 U/mL) 발판을 확보 하 여 다음을 추가 합니다.</li>
	<li>경질 제거와 두개골 창 이미 삭제에서 뼈 플랩, 피부를 닫고 외과 접착제를 적용 하면 상처를 봉인. 흡입된 마 취에서 동물을 제거 하 고 온수 표면에 복구할 수 있도록.</li>
	<li>일단 외래, 반환 마우스 케이지를 합니다. IACUC 승인 일정에 진통제를 관리 합니다. 각 마우스에 대 한 절차를 반복 합니다.</li>
</ol>3입니다. 수술 후 이미징
<ol><li>28 G 인슐린 주사기를 사용 하 여, D-소 (150mg/kg 복)와 쥐를 주사.</li>
	<li>10 분을 기다립니다. 이것은 몸 전체에 순환 하 고 피크 식을 뇌의 luciferase 표현 암 세포와 반응 하 소가 있습니다.</li>
	<li>(언급 했 듯이 이전) isoflurane 마 취, 종양을 시각화 (BLI) 시스템 이미징 생물 발광에 쥐 이미지. 노출 시간 필요한 (초 분) 종양 크기에 따라 다릅니다.</li>
	<li>종양 성장 속도 론을 확인 하는 데 필요한 이미징 절차를 반복 합니다. 동물의 건강 모니터링을 계속 합니다. 참고: 치료 MSCs constitutively 흔적, 암 세포를 죽이 고 전체 종양의 성장을 억제를 표현할 것 이다. 2-5 일 마다 이미징이 목적을 위해 충분 한 주파수를 제공 합니다.</li>
	<li>IACUC 프로토콜에서 설명 하는 미리 결정 된 끝점 충족 되었을 때 transcardial 관류 하 여 쥐를 희생 하 고 조직 분석에 대 한 수집 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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박사 장, Bagó, 및 Hingtgen 줄기 세포 및 비 계 기술에서 UNC 채 플 언덕의 측면을 허가 했다 누가 팔 콘 치료제에 주식을 있다.

다음 사항을 고려 하 정밀도 극대화 하 고 시간이 걸리는 함정을 피하기 위해 하는 수술 일반적으로 마우스, 당 30 분 안에 완료할 수 있습니다. 먼저, 마우스는 제대로 절차를 시작 하기 전에 stereotaxic 악기에 배치 됩니다 확인 합니다. 원치 않는 머리 움직임에서 craniotomy의 외과 정확도, 종양 이식 및 종양 절제의 위치를 제한 합니다. 절제, 전에 완전히 종양을 취재 하는 경질의 부분을 제거 합니다...

세포종 (GBM)은 성인, 단지 12-15 개월1,2,3,,45의 음침한 메디아 생존에 가장 일반적인 기본 뇌 암. 생존은 최대한 외과 절제술 방사선 및 수 반하 및 보조 temozolomide 요법의 현재 임상 표준 때 20056,7채택 이후 크게 개선 하지. 이 치료 환자 증상의 임시 구호를 제공, 치료 치료의 표준 변함없이 결과 하지 되풀이 침략 암 foci 절제를 회피 하 고 체계적인 치료에서 혈액-뇌 장벽 (BBB)에 의해 보호 됩니다. 침략 적인 종양 foci BBB를 우회 하는 동안 대상 전략 시급히이 공격적이 고 쇠 약 질병에 대 한 견인을 얻기 위해 필요 합니다.
인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 마약 배달 차량 때문에 그들의 네이티브 종양 차 있는 굴곡 운동8,9GBM 약속 표시. MSCs에 대 한 수용 체를 소유 하 고 stromal 세포 유래 인자 1α를 포함 하 여 종양 분 비 성 요인으로 마이그레이션 (자위대-1α), 매트릭스 metalloproteinase-1 (MMP-1), 및 monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) 다른 사람의 사이에서10, 11 , 12 , 13. 표현 하 고 분 비 세포 독성 약물 엔지니어링 MSCs 종양 유도 마약 배달 차량으로 다룰 수 있도록. 조작된 MSCs 침략 적인 종양 foci 쪽으로 이동 하 고 치료 단백질을 제공 합니다. 이 방법은 다양 한 전 임상 GBM 모델9,14에서 타당성을 설명 했다. 그러나, 이러한 모델의 대부분에는이 구성의 임상 관련성에도 불구 하 고 수술 절제를 포함 되지 않습니다. 신흥 연구 절제의 새로운 모델을 사용 하 여 공개 외과 종양 제거 수술 구멍15에 직접 주입 하는 줄기 세포의 고집을 감소. 생존 능력의 손실 귀착되 었 다 감소 효능, 침략 적인 종양 foci 감소 복용량에 약물의 기간으로 인해 전달.
높이기 위해 줄기 세포 생존 능력 및 약물 전달, MSCs 건설 기계 주입 이전에 시드할 수 있습니다. 이 프로토콜, 생체 및 resorbable electrospun nanofibrous poly(lactic acid) (PLA) MSCs PLA flexes 및 이식, 치료 범위를 최대화 하 고 최소화 시 절제 구멍의 모양에 대 한 발판으로 사용 합니다 거리 MSCs는 종양 세포에 도달 여행 해야 합니다. MSCs 주입 동안 발판에 유지 하 고 주입16,17후 종양 세포를 향해 비 계에서 마이그레이션합니다. MSCs와 그들이 다음에 수행 하는 세포 독성 약물 종양 foci에서 축적. 종양 세포 독성 약물의 배달 MSC 생존 및 지 속성, 둘 다 건설 기계에 이식 하 여 주 었 필요 합니다.
이 절차에서는 lentiviral 벡터 (시험관에 있는 추적) 형광 및 발광 (vivo에서 추적)의 안정적인 식 유도 하 되 암과 줄기 세포 라인에 마커. 인간의 GBM 라인 U87 mCherry와 반딧불 luciferase (U87 mCh-플로리다), 그리고 GFP와 renilla luciferase (MSC GFP-Rluc)와 비 치료 MSCs 감염입니다. MSCs의 치료 변종 TNFα 관련 apoptosis 유도 하는 리간드 (MSC-트레일)을 표현 한다. 트레일, constitutively 분 비 단백질, 암에 죽음 수용 체 근처에 바인딩합니다 세포 및 caspase 중재 apoptosis18시작.
여기, 우리는 전 임상 이미지 기반 GBM 외과 절제술 및 MSC 시드 장비의 이식에 대 한 프로토콜을 제공합니다. 간단히, 누드 마우스의 U87 mCh-설정할 기본 종양 정위 적 orthotopic 주입 후 3 일 뒤 craniotomy를 받는다. 약 1 주일 동안 engrafted 종양 성장. PLA 건설 기계는 절제 수술 전에 MSCs 48 h 시드. 종양은 다음 형광 지도, 절제 하 고 MSC 로드 비 절제술 구멍으로 이식. 종양 및 마우스 생존 다음 post-operatively (BLI) 이미징 하는 생물 발광으로 추적 됩니다. 이 절차의 타임 라인 (그림 1) 아래 제공 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57452/57452fig1.jpg"> 그림 1: 절차의 타임 라인. 마우스 처음 두개골 창 (0 일) 받을 수 있습니다. 종양은 3 일의 회복 기간 후 (3 일)를 이식 하 고 약 1 주일에 대 한 성장. 건설 기계 종양 절제와 이식 절차 (10 일)에 앞서 2 일 MSCs (8 일)와 시드 있습니다. 종양의 진행 및 치료 효능은 수술 후 그 후 이미징 (하루 10 +)을 통해 평가 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57452/57452fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Just for mouse stereotaxic instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Maintains steady head positioning during surgery</td></tr><tr><td>Fluorescence dissecting stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC&amp;nbsp;</td><td>Allows real-time imaging of tumor during resection</td></tr><tr><td>Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system</td><td>Stoelting</td><td>53315</td><td>Allows precise tumor cell injection volume and rate</td></tr><tr><td>Vetbond tissue adhesive</td><td>3M</td><td>1469</td><td>Sugical glue to close skin wound</td></tr><tr><td>Artificial tears</td><td>Akorn</td><td>664268</td><td>Prevents eyes from drying during surgery</td></tr><tr><td>Webcol alcohol preps</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td>Sterilize incision site</td></tr><tr><td>Betadine surgical scrub</td><td>Purdue Fredick Company</td><td>6761815117</td><td>Sterilize incision site</td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicators</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-115</td><td>Surgery tool</td></tr><tr><td>E-vac aspirating system</td><td>Argos</td><td>EV310</td><td>Vacuum pump used to resect tumor</td></tr><tr><td>Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL</td><td>Baxter</td><td></td><td>To temporarily secure the scaffold in the resection cavity</td></tr><tr><td>IVIS Kinetic in vivo optical imaging system</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td>Bioluminescent Imager</td></tr><tr><td>D-Luciferin potassium salt</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>In vivo imaging agent</td></tr></tbody></table>

image-guided resection of glioblastoma and intracranial implantation of therapeutic stem cell-seeded scaffolds

세포종 (GBM), 가장 일반적이 고 적극적인 1 차 뇌 암, 12-15 개월의 평균 수명이 운반합니다. 짧은 수명은 침략 적인 종양 foci 제거 현재 치료, 방사선 및 화학 요법, 수술 절제의 구성의 무 능력 때문에 부분 이다. 이러한 foci의 처리 청소년 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)와 함께 향상 될 수 있습니다. MSCs는 강력한 종양 차 있는 굴곡 운동 전시 하 고 종양 세포를 죽 일 익스프레스 치료 단백질 설계 될 수 있다. 전 임상 모델에서 발전 그 외과 절제술 조 MSC 손실 유도 및 치료 효능을 감소를 나타냅니다. MSC 치료의 효능 시드 MSCs 생 분해성 poly(lactic acid) (PLA) 비 계에 향상 될 수 있습니다. PLA 비 계에 외과 절제술 캐비티에 MSC 배달 셀 보존, 지 속성, 및 종양 살해를 복원합니다. GBM에 MSC 시드 PLA 이식의 효과 공부 하는 정확한 전 임상 모델 필요 합니다. 여기 뒤에 MSC 시드 비 계 주입 면역 결핍 쥐에 GBM의 이미지 기반 종양 절제 수술 하는 임상 프로토콜을 제공 합니다. MSCs는 lentiviral 구문 constitutively을 표현 하 고 치료 TNFα 관련 apoptosis 유도 ligand (흔적)로 형광 추적 있도록 녹색 형광 단백질 (GFP) 분 비와 함께 설계 되었습니다. 마찬가지로, U87 종양 세포는 표현 mCherry와 반딧불 luciferase, 듀얼 형광/발광 추적 제공 하도록 설계 됩니다. 현재 조사 하 고 중재 하는 줄기 세포 치료제의 배달에 사용 하는 동안이 프로토콜 다른 GBM 개입에 외과 절제술의 영향을 조사 하 수정 될 수 있습니다.

U87 종양 세포 표현 mCherry와 반딧불 luciferase (U87 mCh-플로리다) 주입, 이전 및 이미지 기반 절제 및 생물 발광 (그림 2A-C)을 추적 가능 하도록 설계 했다. 줄기 세포 마찬가지로 진단 GFP-Rluc (MSC-GFP) 또는 치료 GFP-재판 (MSC-트레일) 설계 되었고 첨부 파일 및 확산 (그림 2D-F) PLA 건설 기계에 시드.
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Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

종양을 추구 치료 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 침략 세포종에 대 한 치료로 서 약속을 보여줍니다. 최적의 이식 건설 기계에 종양 절제술 구멍으로 MSCs의 납품을 포함 한다. 여기, MSC 세포종의 치료를 공부 하기 전 임상 기술을 포함 하 여 제공 됩니다: 이미지 기반 종양 절제술; 주입 장비의 MSC 시드; 그리고 수술 후 치료 추적입니다.

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in ...

image-guided-resection-glioblastoma-intracranial-implantation

Research

JoVE Journal

Medicine

8.2K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill. 종양을 추구 치료 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 침략 세포종에 대 한 치료로 서 약속을 보여줍니다. 최적의 이식 건설 기계에 종양 절제술 구멍으로 MSCs의 납품을 포함 한다. 여기, MSC 세포종의 치료를 공부 하기 전 임상 기술을 포함 하 여 제공 됩니다: 이미지 기반 종양 절제술; 주입 장비의 MSC 시드; 그리고 수술 후 치료 추적입니다.

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A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

마우스에 Intracranial 이종 이식 연구에 대한 간단한 안내 스크류 방법

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

연구

의학

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서</emMurine Gliomas의> 발광 생물 이미징

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotactic Intracranial 주입 및<em&gt; 생체에</emGlioblastoma의 Multiforme의 마우스 모델 시스템에서 종양 Xenografts의&gt; 발광 생물 이미징

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers patients only modest benefits, as most patients do not survive more than five years following diagnosis due to glioma relapse 1,2. The discovery of cancer stem cells in human brain tumors holds promise for having an enormous impact on the development of novel therapeutic strategies for glioma 3. Cancer stem cells are defined by their ability both to self-renew and to differentiate, and are thought to be the only cells in a tumor that have the capacity to initiate new tumors 4. Glioma relapse following radiation therapy is thought to arise from resistance of glioma stem cells (GSCs) to therapy 5-10. In vivo, GSCs are shown to reside in a perivascular niche that is important for maintaining their stem cell-like characteristics 11-14. Central to the organization of the GSC niche are vascular endothelial cells 12. Existing evidence suggests that GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells are important for tumor development, and identify GSCs and their interaction with endothelial cells as important therapeutic targets for glioma. The presence of GSCs is determined experimentally by their capability to initiate new tumors upon orthotopic transplantation 15. This is typically achieved by injecting a specific number of GBM cells isolated from human tumors into the brains of severely immuno-deficient mice, or of mouse GBM cells into the brains of congenic host mice. Assays for tumor growth are then performed following sufficient time to allow GSCs among the injected GBM cells to give rise to new tumors-typically several weeks or months. Hence, existing assays do not allow examination of the important pathological process of tumor initiation from single GSCs in vivo. Consequently, essential insights into the specific roles of GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells in the early stages of tumor initiation are lacking. Such insights are critical for developing novel therapeutic strategies for glioma, and will have great implications for preventing glioma relapse in patients. Here we have adapted the PoRTS cranial window procedure 16and in vivo two-photon microscopy to allow visualization of tumor initiation from injected GBM cells in the brain of a live mouse. Our technique will pave the way for future efforts to elucidate the key signaling mechanisms between GSCs and vascular endothelial cells during glioma initiation.

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

By combining a polished and reinforced thin-skull (PoRTS) cranial window and glioblastoma (GBM) cell injection, we can observe glioma initiation and growth from injected GBM cells in the brain of a live mouse longitudinally.

이미징 Glioma 개시<em&gt; 생체 내</em&gt; 연마하고 강화 얇은 두개골 두개골 창을 통해

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed electric fields (PEFs) are promising for the improvement of treatment efficiency. However, they rely on rigid electrodes that cause acute and chronic damage, especially in soft tissues such as the brain. In this work, flexible electronics were used to deliver PEFs to tumors and the biological response was evaluated with fluorescent microscopy. Interdigitated gold electrodes on a thin, transparent parylene-C substrate were coated with the conducting polymer PEDOT:PSS, resulting in a conformable and biocompatible device. The effects of PEFs on tumors and their microenvironment were examined using various biological models. First, monolayers of glioblastoma cells were cultured on top of the electrodes to investigate phenomena in vitro. As an intermediate step, an in ovo model was developed where engineered tumor spheroids were grafted in the embryonic membrane of a quail. Due to the absence of an immune system, this led to highly vascularized tumors. At this early stage of development, embryos have no immune system, and tumors are not recognized as foreign bodies. Thus, they can develop fast while developing their own vessels from the existing embryo vascular system, which represents a valuable 3D cancer model. Finally, flexible electrode delivery of PEFs was evaluated in a complete organism with a functional immune system, using a syngenic, orthograft (intracranial) mouse model. Tumor spheroids were grafted into the brain of transgenic multi-fluorescent mice prior to the implantation of flexible organic electrode devices. A sealed cranial window enabled multiphoton imaging of the tumor and its microenvironment during treatment with PEFs over a period of several weeks.

This work describes the development of flexible interdigitated electrodes for implementation in 3D brain tumor models, namely, in vitro culture, in ovo model, and in vivo murine model. The proposed method can be used to evaluate the effects of pulsed electric fields on tumors at different levels of complexity.

교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

암 연구학

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

마우스에서 2P-IVM을 사용한 뇌종양의 나노 입자 실시간 추적

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the accumulation and distribution of macromolecules in brain tumors in vivo would greatly enhance our ability to understand and optimize drug delivery in preclinical models. This protocol describes a method for real-time in vivo tracking of intravenously administered fluorescent-labeled nanoparticles with two-photon intravital microscopy (2P-IVM) in a mouse model of glioblastoma (GBM).
The protocol contains a multi-step description of the procedure, including anesthesia and analgesia of experimental animals, creating a cranial window, GBM cell implantation, placing a head bar, conducting 2P-IVM studies, and post-surgical care for long-term follow-up studies. We show representative 2P-IVM imaging sessions and image analysis, examine the advantages and disadvantages of this technology, and discuss potential applications.
This method can be easily modified and adapted for different research questions in the field of in vivo preclinical brain imaging.

저자 스포트라이트: 교모세포종 치료에서 약물 전달 및 조기 발견 최적화를 위한 멀티모달 이미징 전략

We present a novel approach for two-photon microscopy of the tumor delivery of fluorescent-labeled iron oxide nanoparticles to glioblastoma in a mouse model.

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

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마우스에 Intracranial 이종 이식 연구에 대한 간단한 안내 스크류 방법

이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서 발광 생물 이미징

Stereotactic Intracranial 주입 및

이미징 Glioma 개시

교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의