このプロトコルは、膠芽腫に対するそれらの治療効果を研究するために、フレキシブルエレクトロニクスによるパルス電界の送達を可能にする。これは、腫瘍の微小環境をin vivoでイメージングで視覚化することによって行われます。バイオエレクトロニクスは、癌に対する脈動場の影響を研究するために、複雑さを増すいくつかの異なるモデルを使用してこのプロトコルに統合されています。
この研究で提示された微細加工技術は、患者由来の異種移植片を含む他のタイプの癌を治療する手段としてもテストできます。これは、個々の患者に合わせた精密医療のアイデアに向かっています。これらのプローブは標準的な微細加工技術で作られているため、製造は簡単で、クリーンルームがあれば誰でも作成できます。
金電極のパターニングには、パリレン蒸着システムで3マイクロメートルのパリレンC層を蒸着チャンバー内にきれいなスライドガラスを配置して堆積させます。アルミボートで6グラムのパリレンCを計量し、それを炉に入れ、機械を排気し、原稿に記載されているパラメータで堆積を開始します。堆積が終了し、気化器の温度が摂氏40度を下回ったら、チラー、気化器、炉の電源を切ります。
機械をベントし、サンプルを収集します。プラズマ処理したサンプルをネガ型フォトレジストで1, 000倍Gで40秒間スピンコートします。インターディジット電極設計を特徴とするマスクを通してフォトレジストを露光します。
その後、サンプルを金属イオンフリー現像液に3分間浸漬し、未露光のフォトレジストを除去します。サーマルエバポレーターで20ナノメートルのクロム付着層と300ナノメートルの金層を堆積させるには、エバポレーターマシンをベントし、金属ネジで上部の丸いプレートにサンプルをクリップします。専用のるつぼにそれぞれクロムと金を入れます。
機械を密閉して排気し、サンプルホルダーの回転を開始します。クロムを含むるつぼを選択し、堆積速度が毎秒0.2オングストロームに達するまでゆっくりと電流を増やします。シャッターを開き、20ナノメートルのクロムが堆積するまで待ち、シャッターを閉じて、ゼロミリアンペアまで電流をゆっくりと下げます。
るつぼを含む金を選択し、毎秒0.2オングストロームの堆積速度になるまでゆっくりと電流を増やします。シャッターを開いて金を蒸発させ、10ナノメートルの金が堆積するまで待ってから、約1.5ナノメートルが堆積するまで堆積速度を毎秒300オングストロームに上げます。シャッターを閉じ、電流をゆっくりとゼロミリアンペアまで下げます。
アセトンを含むビーカーにサンプルを浸します。次に、サンプルをイソプロパノールですすぎ、エアガンで乾燥させます。4層のPEDOT:PSS溶液を150倍Gで35秒間スピンコートします。
試料を水に浸して犠牲パリレンC層を除去する。サンプルを脱イオン水に30分間浸して、PEDOT:PSSフィルムに残っている石鹸と低分子量化合物を除去し、サンプルをガラス基板から剥離します。96ウェルプレートの各ウェルに75マイクロリットルの溶融1%アガロース溶液を注意深く加え、室温で15分間固化させます。
安定した細胞株作製中に得られた形質導入膠芽腫細胞を剥離する。1ウェルあたり10, 000個の膠芽腫細胞を追加し、1リットル当たり1グラムのグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および重炭酸ナトリウム、10%ウシ胎児血清、ペニシリン1マイクロリットル当たり100単位、およびストレプトマイシン1マイクロリットル当たり100マイクログラムを含むDMEMを使用して、ウェル当たり150マイクロリットルに総容量を構成する。アガロースまたはスフェロイド自体への損傷を避けるために、ピペットチップをウェルの上部に保ちながら、さらなる実験まで2日ごとに培地の半分を新しい培地に交換します。
ニホンウズラ、Coturnix japonicaの受精卵を、2時間ごとに卵を回転させる自動回転子を備えたトレイの上のインキュベーターに入れます。この日は胚のゼロ日目と見なされます。胚の3日目に、70%エタノールで事前に洗浄した細い先端のピンセットを使用して卵をそっと開きます。
胚をプラスチック製の計量ボートに注ぎ、別の計量ボートで覆い、37°Cの標準的な加湿インキュベーターに3日間入れます。胚の6日目に、23ゲージの針で絨毛尿膜を小さく切開します。ピペットを使用して切開部に7日間のスフェロイドを置き、さらなる実験まで3日間胚をインキュベーターに戻します。
開頭術を覆うためにDPBSを一滴置きます。フレキシブル電極をDPBSのドロップの上に置き、コンタクトパッド付きのプローブの背面をマウスの背面にそっと置きます。プローブが硬膜の上に平らに置かれ、脳の湾曲に追従できるようになるまで、DPBSドロップを小さな紙で吸収し、生理食塩水の小さな層が電極の下に残り、接着剤のスピルオーバーに対するバリアとして機能するようにします。
プローブにシリコン接着剤を少量滴下し、5ミリメートルの丸いカバーガラスで覆います。シリコーンが均等に分散し、カバーガラスとプローブの間の距離が最小になるまで、カバーガラスを押し下げます。次に、シリコーンが固まるまで30秒待ちます。
カバーガラスを固定するには、側面に瞬間接着剤をすばやく塗布し、接着剤が固まるまで押し下げます。つまようじを使用してプローブの首に瞬間接着剤を塗布し、瞬間接着剤が首の下に引かれるように注意して、安定したサポートを提供します。頭蓋骨を歯科用セメントで覆い、慢性キャップを作り、カバーガラスの端だけを覆うように特別な注意を払ってください。
プローブの背面を持ち上げ、プローブのネックの下にセメントを塗布します。プローブが硬化する前に、プローブをセメントに残します。プローブのネックを軽く押し下げて、実験中に顕微鏡の対物レンズの邪魔にならないように、カバーガラスと同じ高さに表面を配置します。
プローブネックの上部を1.5ミリメートル以下の歯科用セメント層で覆い、プローブをしっかりと保持します。カバーガラスの周囲1〜2ミリメートルに1.5ミリメートルの尾根を示すセメントウェルを構築し、2つの光子イメージング用の浸漬流体用の盆地を作成します。セメントが硬化したら、術後鎮痛を行い、ペーパータオルで包み、赤外線電球の近くに置いて、回復するまで動物を暖かく保ちます。
PEDOT:PSSコーティングされた電極は、カットオフ周波数で区切られた典型的な容量性および抵抗性が支配的な領域を示しますが、コーティングされていない電極は容量性挙動のみを示します。明視野顕微鏡で観察されたスフェロイドの成長は、細胞株と播種された細胞数に応じて、球状で高密度のスフェロイドを得るのに少なくとも2〜3日が必要であることを明らかにしました。in ovoモデルでは、生細胞が細胞内カルシウムを持っているため、脈絡膜のスフェロイドの移植片を蛍光顕微鏡で評価でき、腫瘍の血管新生は蛍光色素を血管に注入することで評価できます。
生理食塩水中のインピーダンスと比較して、生物学的環境の存在により、100ヘルツを超える周波数でin vivoでインピーダンスの増加が予想されます。血管新生神経実質および腫瘍浸潤は、2つの光子顕微鏡によって数週間にわたって透明な基質を通して観察および特徴付けることができる。目的の細胞で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物の使用は、電極移植のみによって誘発される最小限の炎症プロセスを実証することができます。
パルス電界刺激電極の移植後26日目にミクログリアおよび単球の存在を示すことができる。末梢単球由来細胞と脳共鳴ミクログリア細胞の両方が腫瘍の周囲および内部に見られました。インプラント手術を成功させるための重要なポイントは、頭蓋窓のシーリングと平坦性を確保し、プローブとの接触の質を最適化することです。
生体内イメージングに加えて、私たちのプロトコルを、サイトカインの血液検査のサンプリングや測定、フローサイトメトリーによる免疫状態、さらには行動分析などの他の測定や技術と組み合わせることを検討できます。この研究は、癌に対する柔軟な埋め込み型デバイスの使用への道を開き、この慢性疾患に対するバイオエレクトロニクス医学の使用の新しい展望を開きます。
