この方法は、胚のガイドRNAをチェックしたり、初期の発生の質問をテストしたり、編集されたマウスを作成したりすることができます。CRISPR Cas9の進歩は、この方法で使用できます。この方法の主な利点は、習得が容易であり、マウスにアクセスできるラボで利用可能な試薬を使用することです。
将来的には、この技術は、コンパニオンアニマルまたは農業上重要な動物の子孫の病気または突然変異を修正するのに役立つでしょう。この方法は、マウス モデルの生成に最適です。私たちの研究室では、この方法のバリエーションを使用して、受精と着床前早期発生を取り巻くイベント、特に胚の効力における遺伝子制御を調査しています。
最も困難な部分は、ガラス針を使用して胚をプレートからプレートに移動することです。この手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストであるシャンタル・ディアロです。胚の収集と処理を開始するには、安楽死させた雌マウスを背中に置き、腹部に70%エタノールをスプレーして外科的に開きます。
腹腔を開いて卵管を除去するには、外科用ハサミで皮膚層を切断し、卵巣を見つけます。次に、卵巣の近位に位置する両方の卵管を外科的に除去し、それらをM2とBSA培地の個々の50マイクロリットルの液滴に入れます。実体顕微鏡下で、解剖鉗子を使用して卵管の膨大部に傷を付け、卵母細胞を含む積雲-卵母細胞複合体(COC)を放出し、破片のキャリーオーバーを避けるために、各卵母細胞を移し、20〜30マイクロリットルに設定されたハンドルピペットでM2とBSAの単一の50マイクロリットルの液滴に混ぜ合わせます。
次に、接合子から卵雲細胞を除去するには、少量の余分な培地を含むCOCを100マイクロリットルのM2とヒアルロニダーゼの液滴に移し、胚がはるかに小さな卵雲細胞から目に見えて分離されるまでピペッティングで穏やかに混合します。ヒアルロニダーゼを希釈し、緩んだ積雲細胞を取り除くには、口内ピペットを使用して接合子を新しい50マイクロリットルのM2プラスBSA液滴に移動します。次に、胚の透明帯を侵食し、試薬送達のための追加の物理的障害を減らすために、胚を60ミリメートルプレート上の酸チロードまたはAT溶液の予熱した100マイクロリットルの液滴に移します。
透明帯の30%が侵食されるまで実体顕微鏡下で接合子を連続的に観察し、次にATを希釈するために、M2とBSAの4つの50マイクロリットルの液滴に胚を通過させます。次に、実体顕微鏡でカウントすることにより、処理された胚の適切な数を決定します。胚を50マイクロリットルの還元血清培地の2滴に通すことによってBSAを希釈する。
次に、マウスピペット25〜30個の胚を10マイクロリットルの還元血清培地の液滴に入れ、次にハンドヘルドピペットを使用して10マイクロリットルのリボ核タンパク質またはRNP複合体を追加します。RNP複合体から粘性グリセロールを希釈し、10回または混合物が粘度を示さなくなるまでピペッティングによってサンプルを均質化します。次に、20マイクロリットルの胚とRNPの混合物を気泡を避けながら0.1センチメートルのエレクトロポレーションキュベットにピペットで入れ、次に編集試薬を接合子に送達し、30ボルトの方形波プロトコル、3ミリ秒のパルス長で4〜6パルス、100パルス間隔を使用して胚をエレクトロポレーションします。
次に、50マイクロリットルのM2とBSAをキュベットの上部に加えて、キュベットから胚を洗い流し、この混合物をプレートに静かにピペットで取り出します。胚培養の場合は、20〜30個の接合子を、事前に平衡化した培養プレート内のKSOMとBSAの液滴に移し、胚を液滴に移動します。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素、湿度95%で一晩インキュベートします。
翌日、2細胞胚のみをKSOMとBSA混合物の新鮮な液滴に移し、プレートをインキュベーターに戻します。死んだまたは受精していない胚を残すか捨てる。ジェノタイピングの前に、桑実胚盤胞胚を2滴のDPBSで洗浄し、PCR反応を妨げる可能性のある培地成分を希釈します。
マウスピペットを使用して、個々の胚を8ウェルPCRストリップの1ウェルに移し、10マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。次に、胚を溶解するために、サーマルサイクラーを摂氏55度に4時間プログラムし、次に摂氏95度で10分間インキュベートしてプロテイナーゼKを不活性化します。本研究では、非相同末端結合および相同性指向性修復のためのオリゴデザインおよびジェノタイピング戦略を含む、ポジティブコントロールとしてマウスチロシナーゼ遺伝子座を標的とする戦略の例を示す。
単一のシングルガイド(sgRNA)を送達する場合、RNPの送達は、C57ブラック6JおよびC57ブラック6Nマウス系統で最大100%であり、挿入欠失形成は50〜100%で発生し、小さなオリゴベースの置換は17〜63%の範囲であった。 ゲノム欠失を工学する場合、編集効果は3%から100%まで変化します胚は、可能な限り理想的な条件に近づけて、より迅速にプロトコルは完了しています。また、ヒアルロニダーゼと酸タイロードへの曝露を最小限に抑えます。この方法は、編集された動物を生成すること、着床または妊娠生存率をテストすること、または実験を複数回実行して、プランテーション前の開発中に測定値または画像および様々な測定基準を収集することを記述する。
