私たちのプロトコルは、CRISPR編集の正確な統合と簡単な視覚的検出の両方のためのパイプラインと、編集後の表現型の例を提供します。このアプローチの主な利点は、CRISPR編集の検出が容易であり、成功した編集を効率的かつ簡単に識別できることです。このアプローチにより、ゼブラフィッシュの疾患関連変異体の簡単な生成と特性評価が可能になります。
ここでは、QT延長症候群について検討しています。その後、薬物療法に関する追跡調査を実施することができます。まず、目的の遺伝子のゼブラフィッシュオルソログを同定することにより、ノックインターゲットサイト配列を切除するための2つのsgRNAガイドを設計します。
Ensemblを使用して、テンプレートの作成に使用される2キロ塩基の隣接配列を含む、目的の遺伝子配列内のターゲットサイトを特定します。CRISPORなどの設計ソフトウェアツールを使用して、ダニオレリオ種とCas酵素を選択します。2つのsgRNAアプローチでは、ターゲットエクソンの前に1つのsgRNAを選択し、すぐ下流のイントロン内に2番目のsgRNAを選択します。
選択したsgRNAの特異性が高く、予測されるオフターゲット結合が低いことを確認してください。CRISPOR ランキングを使用して、オフターゲットバインディングを最小限に抑えたガイドを特定します。次に、PCRベースのサンガーシーケンシングジェノタイピングの最も可能性の高いオフターゲットサイトを特定します。
2つのsgRNAを選択した後、それぞれについて逆相補体、変異に先行する2つの相補的オリゴ、および変異の下流にある2つの相補的オリゴを得る。各オリゴに互換性のある制限部位を追加して、選択したプラスミドにガイドを組み込みます。選択したガイド配列をDR274プラスミドに統合するには、5つのプライムBSA1制限部位を使用してオーバーハングを作成し、ガイドの5つのプライムエンドでBSA1認識サイトを設計します。
次に、PKHR5プラスミドに収容されたM静脈YFPレポーター遺伝子に隣接する2つの配列断片を選択することにより、ゼブラフィッシュにおけるHDRの外因性テンプレートを設計します。テンプレートを2つのセグメントに分割して、M静脈YFPレポーター遺伝子の両側に挿入します。コーディングシーケンスが切断されないように、分割サイトがイントロン内にあることを確認してください。
原稿に記載されているすべての必要な修飾を組み込んで、PKHR5プラスミドへのクローニングを容易にします。受精後約40分で1細胞期に胚を注入します。3日間の受精後、ゼブラフィッシュの幼虫を0.3%MS222を含む25ミリメートルのペトリ皿に移し、自己回復反射を失うまで麻酔をかけます。
麻酔をかけたら、幼虫を24ウェルプレートのウェルに移します。GFPまたはYFPを検出できる顕微鏡を用いて、幼虫の眼におけるレポーター遺伝子蛍光についてスクリーニングする。幼虫の画像を撮影した後、レポーター遺伝子発現の有無を文書化する。
正確で正確なHDR遺伝子編集を確認するには、前述のように受精後3日目に幼虫に麻酔をかけ、ホットショット法を使用してテールクリップからゲノムDNAを分離することにより、ジェノタイピングを実行します。切除したテールクリップを15マイクロリットルの25ミリモル水酸化ナトリウムに加え、摂氏95度で20分間インキュベートし、次に1.5マイクロリットルのトリス塩酸で中和します。13, 800倍Gで30秒間遠心分離し、抽出したゲノムDNAを含む上清を保持する。
E3培地で幼虫を回収し、さらなる研究が意図されている場合はそれを住宅システムに戻す。抽出したゲノムDNAを鋳型として使用して、オンターゲット部位とオフターゲット部位のPCRベースのサンガーシーケンシングを実行します。オンターゲットプライマーデザインが変異部位と最も近いsgRNA結合部位を捕捉していることを確認します。
挿入された相同性アームと標的遺伝子からの移行を検出するための別のシーケンシングプライマーを設計し、目的の遺伝子への組み込みを確認する。プライマーを設計して、上位3つの潜在的なオフターゲット部位を配列決定します。オンターゲットおよびオフターゲットのジェノタイピング、心拍数、心膜寸法、ECG表現型、および各ゼブラフィッシュについて識別可能なレポーター遺伝子データをコンパイルします。
YFP M静脈レポーター遺伝子発現が島で観察され、テンプレート統合の成功のポジティブレポーターとして機能しました。レポーター遺伝子陽性魚は、R56Q変異体をZKCNH6Aに導入する正確な編集G2Aを有することが判明した。眼面積の比率としての心膜寸法の測定がここに示されている。
ゼブラフィッシュの心臓再分極障害に関連する心膜浮腫の増加を伴う徐脈の傾向は、R56Q遺伝子編集幼虫で観察されました。受精後3日目のゼブラフィッシュ幼虫の心臓からのECG記録がここに示されています。このアプローチの最も重要な側面は、CRISPR手順でよくあるように、ガイド設計です。
効果的なガイドは、CRISPR編集を成功させるために不可欠です。代替のCRISPRメソッドに従うことができ、より高い精度やその他の機能が可能になります。さらに、in vivo誘導編集システムを提供するプライム編集複合体などの大きな遺伝子を挿入することができます。
