상대습도 미국 (R01HL116546 및 R01 AR064241) 건강의 국가 학회에 의해 지원 됩니다.

이 프로토콜에 사용 되는 동물의 오하이오 주립 대학 실험실 동물 자원에서 동물 사용 지침에 따라 유지 되었다. 모든 동물 연구 기관 동물 관리, 사용, 및 오하이오 주립 대학의 검토 위원회에 의해 승인 했다.
1. 디자인 및 CRISPR 벡터에 gRNAs의 복제
<ol><li>SaCas9에 대 한 dystrophin intron 20과 intron 23 (i20 및 i23)를 대상으로 하는 2 gRNAs 선택: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT 및 i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM 시퀀스는 밑줄을 표시 하 고 이탤릭체). 참고: i20 i23에 대 한 대상 사이트는 약 23 킬로 기본적인 쌍 (kbp) 멀리. 코딩 유전자 중단, 두 gRNAs NNGRRT 팸 일반적인 exons를 대상으로 SaCas9에 대 한 시퀀스 (선호 NNGAAT, NNGGGT 및 NNGAGT) 및 20 kbp 이내 거리는 것이 좋습니다.</li>
	<li>버퍼를 어 닐 링 x 1에서 다음 PCR 매개 변수 anneal gRNA oligos (100 µ / L)를 사용 (버퍼 재고를 어 닐 링 x 5 0.5 mol/L K-아세테이트, 150 mmol/L HEPES 포함-코, 10 mmol/L Mg-아세테이트, pH7.4): 95 ° C 10 분 당 0.4 ° c 95 ~ 59 ° C의 90 주기 감소 20 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 59 ~ 32 ° C의 90 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 32에 26 ° C의 20 주기 s.</li>
	<li>pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA로 단련된 gRNA oligos를 위하여 BsaI와 T4 DNA 리가 한 반응에 사용 하 여 (1 µ L 50 ng / µ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µ L 단련 oligos, 1.5 µ L 10 x T4 DNA 리가 버퍼, 0.5 µ L T4 DNA 리가, 1 µ L BsaI, 10 µ L ddH2O ), PCR cycler에서 다음 반응 조건: 5 주기 [37 ° C 5 분 및 16 ° C 10 분]; 37 ° C 20 분; 80 ° C 5 분입니다.</li>
	<li>15 µ L 결 찰 제품을 30 µ L 유능한 세포 변환, 100 µ g/mL 암 피 실린, 한 천 판에 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화 셀 접시.</li>
	<li>5-10 식민지와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c, 250 rpm 3-4 h 흔드는 인큐베이터에 들어 있는 LB 매체 문화를 선택 합니다.</li>
	<li>PCR에 의해 식민지 화면: 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스, 8 µ L ddH2O, 1 µ L 대장균 문화, 1 µ L 10 µ / L U6-앞으로 뇌관, 1 µ L i20 또는 i23 gRNA 역 뇌관. PCR 자전거 매개 변수: 95 ° C 5 분, 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 초, 72 ° C 30 s의 35 주기.</li>
	<li>추가 4 mL 신선한 파운드 중간 containing100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 250 rpm에서 하룻밤 문화에 의해 긍정적인 클론의 5 mL 문화를 준비 합니다.</li>
	<li>적절 한 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 DNA 플라스 미드 정화 하 고 생어에 의해 플라스 미드를 확인 시퀀싱 U6-앞으로 뇌관.</li>
	<li>10 %FBS 1% 보충 DMEM C2C12 셀 문화 펜-Strep 유전자는 플라스 미드의 효능 편집 테스트용 ~ 70 %confluency 도달할 때까지.</li>
	<li>Electroporate 5 µ g 1 x 106 C2C12 셀 제조업체의 프로토콜에 따라 1:1 어 금 니 비율에서 SaCas9/gRNA 플라스 미드 혼합물의 총.</li>
	<li>48 h 후 transfection 후 C2C12 세포를 수확 하 고 게놈 DNA를 추출 합니다.</li>
	<li>사용 100 ng genomic DNA 템플릿으로 마우스 dystrophin 로커 스에 대 한 PCR 반응을 수행 하: 전달 뇌관 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ L 10 µ / L), 반전 뇌관 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ L 10 µ / L), 10 µ L 2 녹색 PCR x 마스터 믹스, 7 µ L ddH2O, 1 µ L genomic DNA ( 100 ng). PCR를 사용 하 여 순환 조건 95 ° c 5 분, [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s]의 35 주기 72 ° C 2 분.</li>
</ol>2입니다. rAAV 생산
<ol><li>셀 문화, 15 cm의 20 ~ 40에 AD293 셀 씨 고 DMEM 10 %FBS 1% 보완 유지 펜-Strep transfection 대 ~ 90 %confluency 도달할 때까지.</li>
	<li>200 µ L로 희석 3 플라스 미드 감소 (접시) 당 혈 청 매체: 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 또는 다른 serotypes) 및 3) pX601-i20, pX601 i23 혼합물 (1:1 비율)의 5 µ g의 총. 80 µ L 페이와 혼합 하 여 polyethylenimine (페이) transfection를 수행 하 고 dropwise 방식에서 10 분 추가 AD293 세포 배양에 혼합물에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>AAV 바이러스 생산, 72 h 게시물 transfection 후 10 분 동안 1100 x g에서 원심 분리 하 여 미디어와 AD293 셀 알 약을 수집 하 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다.</li>
	<li>액체 질소와 42 ° C 물 탕에서 보육 교류 3 freeze-thaw 주기 다음 15 mL rAAV 세포의 용 해 버퍼 (50 mmol/L 트리 스 베이스, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5)에 셀 펠 릿 resuspend 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우 미래 처리를 위한-80 ° C에 세포 lysates를 저장 합니다.</li>
	<li>0.45 μ m 필터와 문화 미디어를 필터링 하 고 추가 40% PEG8000 2.5 mol/L NaCl에에서 8%의 최종 농도. 1 시간에 4 ° C에 혼합물 그리고 15 분 동안 1100 x g에서 원심 분리기를 품 어.</li>
	<li>RAAV 세포의 용 해 버퍼에 산 탄을 resuspend 하 고 단계 2.3, 뒤에 1 시간 동안 37 ° C에서 benzonase (50 U/mL) 치료에서에서 세포 lysates 결합.</li>
	<li>원심 benzonase 처리 rAAV 혼합물 1100 x g 4 ° C에서 15 분을 포함 하 고 상쾌한 (원유 rAAV 준비)를 저장 합니다.</li>
</ol>3. rAAV 정화 및 농도
<ol><li>하단에는 다음 순서에 따라 ultracentrifuge 튜브에 iodixanol 그라데이션에 원유 rAAV 준비 위에서 로드: 원유 AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15 %Iodixanol, 6 mL 25 %Iodixanol, 5 mL 40 %Iodixanol, 5 mL 58 %Iodixanol. 1 x DPBS를 사용 하 여 정상에 튜브의 나머지 빈 볼륨을 작성 합니다.</li>
	<li>230000 x g 10 ° C에서 120 분 ultracentrifuge로 터에서에 샘플 원심을 3-4 mL 18 G 바늘 rAAV 입자를 포함 하는 40% 그라데이션 분수의를 수집 합니다.</li>
	<li>1 x DPBS와 원심 분리기는 원심 필터 장치 (MWCO 100 kDa)를 사용 하 여 rAAV 입자를 희석. 대 한이 단계를 반복 3-5 시간 및 마지막으로 300-500 µ L rAAV 준비 집중.</li>
</ol>4입니다. rAAV Titering
<ol><li>2 µ L 집중 rAAV, 에탄올에 3 M NaOAc와 20 µ L ddH2O. resuspend 촉진에서 게놈 DNA를 추출</li>
	<li>PX601 플라스 미드의 직렬 희석에 의해 rAAV 정량에 대 한 표준 곡선을 얻기: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 각 10 µ L ddH2O. Dilute DNAase 치료 rAAV 1 x 105 부 샘플 1:10, 1시 50분, 1: 100, 그리고 1:1000.</li>
	<li>실시간 PCR 시스템에서 제조업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실시간 양이 많은 PCR (정량)에 의해 rAAV titer 결정: 1 µ L 10 µ / L 각 뇌관의 (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC 및 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ L PCR 마스터 믹스, 희석 1 µ L x 2 rAAV 샘플 및 2 µ L ddH2O. 자전거 매개 변수가 반응 실행: 95 ° C 3 분, 45의 주기 [95 ° C 5 초 61 ° C 20 초].</li>
</ol>5. 정 맥 및 복 rAAVrh.74-CRISPR 신생아 mdx/utrophin/- 생쥐에 주입
<ol><li>1 분 동안 얼음에 배치 하 여 mdx/utrophin+ 마우스 새끼 (3 일)를 immobilize 하 고 1 x 1012 복고풍 궤도 접근 또는 복 주사를 통해 체계적으로 마우스 당 50 µ L에서 바이러스 성 입자와 관리.</li>
	<li>복구 하 고 다시 자신의 집 새를 마우스 수 있습니다. RAAV 관리 후 10 주, 조직 컬렉션에 대 한 공동2 노출에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>스냅-동결 genomic DNA와 RNA 추출 및 사용 isopentane 최적의 절삭 온도와 조직 cryosectioning 복합 동결 액체 질소에 냉각에 대 한 조직.</li>
</ol>6입니다. 결과 편집 대상 유전자의 분석
<ol><li>
게놈 DNA PCR 분석
	<ol>
<li>Mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 조직에서 게놈 DNA 치료 또는 rAAV 없이 총을 격리 합니다.</li>
		<li>1.12 단계에서에서 동일한 프로토콜을 사용 하 여 PCR 분석에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dystrophin 식의 RT-PCR 분석
	<ol>
<li>제조업체의 설명서에 따라 RNA 추출 키트와 함께 심장 조직에서 총 RNA를 추출.</li>
		<li>반전 녹음 방송을 수행 하려면 미리 RNase 무료 DNase와 총 RNA를 치료 하 고 템플릿으로 처리 RNA의 5 µ g를 사용 하 여 반전 녹음 방송 장비를 가진 첫번째 물가 cDNA 합성에 대 한.</li>
		<li>반전 녹음 방송 제품을 사용 하 여 dystrophin cDNA 뇌관으로 dystrophin 식의 RT-PCR 분석: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 및 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정량 분석에 의해 효능을 편집 하는 유전자 예측
	<ol>
<li>양적 RT-PCR exon 22 포함 된 성적 (exon 21) 앞으로 뇌관을 사용 하 여 감소를 감지 하 여 효능을 편집 하는 유전자 예측: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, 그리고 역방향 뇌관 (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. 앞으로 뇌관 참조 유전자로 Gapdh 사용: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC 및 역방향 뇌관: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>양이 많은 실시간 PCR (정량) 실시간 PCR 시스템과 2 단계 반응 조건에서 제조 업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실행: 95 ° C 3 분, 95 ° C 5 sec와 61 ° C 30 초 45 주기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역 형광 분석 dystrophin 식 얼룩
	<ol>
<li>잘라 냉동된 조직 두께 10 µ m. 수정에는 cryostat를 사용 하 여 15 분 동안 실 온에서 4 %paraformaldehyde 냉동된 섹션.</li>
		<li>PBS로 2 배를 세척 하 고 1 시간에 대 한 솔루션 (10% 말 혈 청) 차단으로 품 어.</li>
		<li>안티 dystrophin 기본 항 체, 4 ° C 하룻밤에 품 어.</li>
		<li>PBS와 슬라이드를 씻어 3 × 5 분 및 1 시간에 대 한 실 온에서 형광 이차 항 체 (1: 500)를 품 어.</li>
		<li>DAPI를 장착 매체를 사용 하 여 거꾸로 confocal 현미경으로 이미징 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 오프 대상 분석 T7E1 분석 결과
<ol><li>온라인 CRISPR를 사용 하 여 잠재적인 대상 오프 사이트 디자인 도구와 같은 예측 < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>게놈 지역 취재는 상위 5-10 잠재적인 대상 오프 사이트 PCR에 의해 증폭: genomic DNA 200, 1 µ L 고 충실도 DNA 중 합 효소, 5 µ L 10 x PCR 버퍼 믹스, 1.5 µ L 10와 50 µ L 총 볼륨 조정 사이트별 정방향 및 역방향 뇌관의 µ / L ddH2o.</li>
	<li>전기 이동 법으로 PCR 제품을 실행 하 고 추출 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 광을 사용 하 여 농도 측정 합니다.</li>
	<li>변성 시키기 및 다시 사용 하 여 PCR cycler 버퍼 2.1에서 천천히 정화 amplicons 어 닐 링에 의해 heteroduplex 형성을 촉진 합니다. 동일한 자전거 상태를 사용 하 여 단계 1.2에서에서 상술 된 대로.</li>
	<li>0.5 µ L T7E1 효소, 37 ° C에서 30 분 동안 다시 단련된 제품을 소화 하 고 사용 하 여 1-2 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 반응 분석. 참고:는 amplicons 또한 타겟된 깊은 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice.">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery.">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates.">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li><li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases.">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li></ol>

관심의 없습니다 충돌 존재합니다.

이 프로토콜에서 우리 vivo 심장 유전자 SaCas9 및 2 개의 gRNAs의 납품 rAAVrh.74 중재를 사용 하 여 출생 후 생쥐에서 편집을 달성 하는 데 필요한 모든 단계를 상세하게. 이전 지적,이 이렇게 dystrophic 쥐에서 dystrophin 식27의 우리의 작업 설명 된 대로 복원 사용할 수 있지만 그것은 또한 급속 한 반전 유전학 연구의 긴 과정 없이 쥐 심장 관련 유전자의 활성화 수는 생성 하 고 사육...

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술 게놈 엔지니어링에서 가장 최근의 발전을 나타내고 세포와 유기 체 유전학의 현재 연습을 혁명을. CRISPR 관련 된 단백질 (Cas9) 9 등 CRISPR 관련 endonuclease 직접 단일 가이드 RNA (gRNA)을 이용 한다 CRISPR 기반 게놈 편집 하 고는 protospacer 시퀀스에 보완은 genomic DNA 대상에 Cpf1와 gRNA에 의해 인코딩 한 특정 protospacer 인접 한 모티브 (PAM)1,2. PAM은 Cas9 또는 Cpf1 유전자의 세균성 종에 따라 다릅니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 파생 된 가장 일반적으로 사용 되 Cas9 nuclease NGG 비 대상 가닥에 genomic DNA에서 직접 대상 시퀀스의 다운스트림 발견 되는 팸 시퀀스를 인식 합니다. 대상 사이트에 Cas9 및 Cpf1 단백질 생성 등 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 상 동 감독 수리 (HDR) 경로3내장 세포 DNA 수리 메커니즘을 통해 복구 다음, 이중 가닥 휴식 (DSB) 4. 동종 재결합에 대 한 DNA 템플렛의 부재, DSB는 주로 수리 삽입 또는 삭제 (indels)에서 발생할 수 있는 오류가 NHEJ 통로 DSB 코딩에서 만들어진 경우 frameshift 돌연변이 일으키는 뉴클레오티드의 6유전자5,지역. 따라서, CRISPR 시스템은 널리 사용 되었습니다 다양 한 휴대폰 모델 및 전체 유기 체에 있는 손실의 기능 돌연변이 하는 유전자의 기능을 조사 하기 위하여. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 및 Cpf1 transcriptionally를 개발 되었습니다 그리고 epigenetically 조절 대상 유전자7,8의 표현.
더 최근에, SpCas9 및 SaCas9 ( 황색 포도상구균에서 파생 됨)는 패키지 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 벡터 인간 질환의 동물 모델에서 출생 후 유전자 교정용으로 특히, 듀 켄 씨 근 위축 증 (DMD)9,10,11,12,13,,1415. DMD는 치명적인 X 연결 된 열성 질병 dystrophin 단백질16,17인코딩하는 DMD 유전자에 있는 돌연변이 기인한 신생아 심사18 에 따르면 약 3500에서 한 남성 출생에 영향을 미치는 , 19. 진보적인 근육 약점 그리고 낭비 특징 이다. DMD 환자는 일반적으로 20-30 년20의 나이 10 ~ 12 세 사이의 호흡기 또는 심장 실패의 다이 걸을 기능 손실. 특히, 심근에 개발 > DMD 환자와 나타냅니다 DMD 환자21,22에 죽음의 주요 원인의 90%. 비록 Deflazacort (항 염증 약물) 및 Eteplirsen (는 엑손 exon 51를 건너뛰는 데 약을 건너뛰는) 최근 승인 된 DMD에 대 한 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)23,24, 이러한 치료의 게놈 DNA 수준에서 유전적 결함을 수정 합니다. Exon 23 dystrophin 유전자의 점 돌연변이 운반, mdx 마우스 DMD 모델25로 널리 사용 되었습니다. 또한, 우리 이전 기능 dystrophin 식 취재 exons 21, 22, 23 일 근육 광고-SpCas9/gRNA 배달9 사용 하 여 mdx 쥐의 골격 근육에서 게놈 DNA의 프레임 삭제에 의해 복원 된 시연 , 그리고 정 맥 및 복 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 배달26를 사용 하 여 mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 근육에.
이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 출생 후 심장 유전자 dystrophin mdx/utrophin/- 생쥐 dystrophin 분석 심장 근육 섹션에 gRNA 디자인에서 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 벡터를 사용 하 여 복원 하려면 편집 모든 단계.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Safety Cabinets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1347</td>
			<td>1300 Series A2 Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI</td>
			<td>New England BioLabs Inc</td>
			<td>RO535S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 150mm</td>
			<td>Nest Scientific USA</td>
			<td>715001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Leica CM3050S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT10017CV</td>
			<td>Corning cellgro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>E2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26-140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Unit, 0.45&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed plasmid mini kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab139501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 2239 Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-11Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Heat Block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480 Instrument II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Capacity Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-910</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002445</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>NanoDrop&#8482; 2000/2000c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i20-F</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i20-R</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i23-F</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i23-R</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510-1kg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Seal centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>QS2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>337922</td>
			<td>Type 70Ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs Inc</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>8043-30-1192</td>
			<td>Optima le-80k</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC510096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adeno-associated virus-mediated delivery of crispr for cardiac gene editing in mice

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복 (CRISPR) 시스템은 크게 배양된 세포에 다양 한 종의 생물 게놈 엔지니어링을 촉진 했다. CRISPR 기술 또한 인간의 질병의 숫자에 대 한 새로운 치료제로 탐험 되었습니다. 개념 증명 데이터는 매우 고무적인 타당성과 듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD) murine 모델을 사용 하 여에 대 한 편집 기반 치료 방법은 유전자의 효능을 설명 하는 최근 학문에 의해 exemplified입니다. 특히, 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74)의 정 맥 및 복 주사 (SaCas9) 포도 상 구 균 CRISPR 관련 단백질 9의 효율적인 심장 배달 및 2 있었습니다. exon 23 마우스 Dmd 유전자에에서 돌연변이 codon 게놈 영역을 삭제 하려면 RNAs (gRNA) 안내. 이 같은 방법은 유전자의 관심 밖으로 노크 하는 gRNA 유전자의 코딩 지구를 대상으로 설계는 출생 후 마우스에 그들의 심장 기능을 공부도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 표시 rAAVrh.74 CRISPR 벡터 하는 방법 및 신생아 쥐에 고효율 심장 납품을 달성 하는 방법.

대상 게놈 DNA 영역 삭제를 유도 하는 gRNAs의 효능 vivo에서 학문을 위한 rAAV로 포장 하기 전에 셀 문화에서 평가 되어야 한다. 이 위해, gRNAs 및 SaCas9을 표현 구문 electroporated C2C12 세포로 되었고 대상 사이트 (그림 1) 측면 뇌관으로 PCR에 의해 게놈 DNA 분석. PCR 제품 ~ 500 bp 대상 게놈 DNA 유전자 제어 세포 게놈 DNA의 큰 크기로 인해 밴드 양보 하지 해야 하는...

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Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K 조회수.  Ohio State University Wexner Medical Center. 여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

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High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

재조합 Adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 벡터에 의해 간암 세포의 고효율 전달

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

연구

의학

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the arteries (&beta;2). When systemically administered, it increases cardiac demand. Thus, dobutamine unmasks abnormal rhythm or ischemic areas potentially at risk of infarction. 
Monitoring of heart function during a cardiac stress test can be performed by either ecocardiography or cardiac catheterization. The latter is an invasive but more accurate and informative technique that the former.
Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization accomplished as described here allows, in a single experiment, the measurement of the following hemodynamic parameters: heart rate (HR), systolic pressure, diastolic pressure, end-diastolic pressure, maximal positive pressure development (dP/dtmax) and maximal negative pressure development (dP/dtmin), at baseline conditions and under increasing doses of dobutamine.
As expected, in normal mice we observed a dobutamine dose-related increase in HR, dP/dtmax and dP/dtmin. Moreover, at the highest dose tested (12 ng/g/min) the cardiac decompensation of high fat diet-induced obese mice was unmasked.

We describe the protocol to perform a cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in normal mice. Also we show its application to unmask subclinical cardiac disease in high fat diet-induced obese mice.

심장 스트레스 테스트 Dobutamine에 의해 유도와 마우스의 심장 Catheterization에 의해 모니터링

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

마우스의 담관 결찰 : 폐쇄성 담즙에 의한 염증성 간 손상과 섬유화의 유도

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

신생아 쥐의 심근 경색, 심장 재생의 모델

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

신생아 마우스에서 내가 유전자 납품을 위한 후부 반원의 운하 접근

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.