Name: injections of lipopolysaccharide into mice to mimic entrance of microbial-derived products after intestinal barrier breach
Uploaded: 2018-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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マウスは飼育され、特定条件下で病原体フリー (SPF) 動物実験施設でバーゼル大学 (バーゼル、スイス連邦共和国) 生物医学の続けた。スイス連邦および州の規則 (動物のプロトコル番号 2816 [カントンのバーゼル ・ シュタット]) に従ってすべてのマウス実験を行った。
1. 組合溶液の調製
<ol><li>無菌条件下での大腸菌0111:B4 から精製した LPS の在庫を開き、5 mg/mL の濃度に水でそれを再構成します。</li>
	<li>作業濃度 0.2 μ g/μ L の滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と組合の株式を希釈します。</li>
</ol>2 LPS のマウスの腹腔内投与
<ol><li>層流空気流中における 30 G 針で 0.5 mL シリンジでソリューションの作業組合を吸い出しなさい。</li>
	<li>注入される LP の量を計算して女性の c57bl/6 マウス (10 週齢 6) の重量を量る: 10 μ L (2 μ g)/g 体重。 注: たとえば、マウスの重さ 20 g、20 g × 10 μ L = 200 μ L LPS 注入するソリューション ニーズの作業します。</li>
	<li>優しく、しっかりとマウスを処理し、1 つの手で動物を抑制します。動物が普通に呼吸するが、ないにツイストし、拘束中にできることを確認します。</li>
	<li>注射用腹部を公開する床に向かって少しマウスの鼻を傾けます。正中線から左右低腹部の腹部と噴射場所の正中線を探します。LP ではなく i. p. PBS をマウスに注入します。</li>
	<li>無料の手で適切なボリューム (ステップ 2.2 で計算されたボリューム) を注入作業ソリューション lps。針が入ったことで腹膜としてそれ以外の場合、腹部の筋肉層への誤注入が発生するかどうかを確認します。まだ、行っていない針で深すぎるその地区の内部器官の負傷を避けるために腹腔内に。</li>
	<li>1 檻あたり最大 5 マウスをケージに動物を慎重に戻ります。</li>
</ol>3. モニター、マウス
<ol><li>発生とエンドトキシン血症の重症度の 8 h の注入後注射とすべての 2 h の時に動物を監視します。そのため、以前に公開された原稿24から適応されているスコア シート (表 1) を使用します。</li>
	<li>
次のパラメーターを表 1 に示すスコア LPS 注入マウス
	<ol>
<li>通常滑らかになる毛皮の外観を確認します。毛皮に波立たせられた、先の尖ったまたはふくらんでいる毛皮の不快感や痛みを示すが表示される場合は、1、2、または 3 でスコアします。</li>
		<li>マウスの動作を確認します。 注: マウス通常移動自由に食べて、飲んで、登山、全体のケージの周り、抑制または制限された活動は、痛みの兆候かもしれない。</li>
		<li>意識のレベルをチェックします。 注: マウスは非常に好奇心が強く、彼らは通常周辺を調査してケージの周りに移動します。不足または減らされた動きは、痛みや不快感にお勧めできます。</li>
		<li>目をチェックします。 注: 完全に開いて目が健康なマウスに期待されているが、おそらく分泌物と、部分的または完全に閉じた目は痛みの指標をすることができます。</li>
		<li>呼吸率をチェックします。 注: 健康なマウスに通常が通常、急速な呼吸率、減らされた呼吸の不快感の徴候である可能性があります)。</li>
		<li>呼吸の質をチェックします。 注: 不自然な呼吸やあえぐことがなく、痛みのサインです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 リボ核酸 (RNA) の抽出と均質化のため組織サンプリング
<ol><li>コレクション/均質化管の準備: 1.4 mm セラミック球が充填された追加 1 mL シングル ステップ RNA 分離試薬 2 mL チューブに。</li>
	<li>適切な時点で ((0 h) 前に 2 h、4 h と 8 h LPS 投与後) 後急激に麻酔薬の過剰摂取 (イソフルラン) とマウスを安楽死させるし、解剖を進めます。</li>
	<li>皮膚と筋層のはさみのペアを使用内部の臓器を腹腔内を公開するカットします。</li>
	<li>慎重に脾臓、肝臓と大腸の解剖、脂肪から臓器をきれい、氷の上の PBS でそれらを保ちます。</li>
	<li>ハサミやメスを使用して各器官からの小さい部分 (約 0.5 cm 長い) をカットします。 注: 常に各マウス (肝、近位または遠位結腸部の同じ葉) の器官のおよそ同じ部分からの部分を取ることが重要です。</li>
	<li>まもなく紙組織片の組織を乾燥し、RNA 分離試薬に完全に没頭していることを確かめるコレクション/均質化管に配置。</li>
	<li>高速卓上ホモジナイザーで組織をホモジナイズしてください。脾臓、肝臓、結腸、速度 6.00 で均質化の 1 サイクルを使用して、30 のような軟部組織の s。</li>
	<li>室温で 5 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>慎重にチューブを置き、液体窒素凍結をスナップを組織ライセート。RNA の隔離まで-80 ° C にて凍結スナップインを格納します。</li>
</ol>5 組織から RNA の抽出
注: アルコール、クロロホルム、分離試薬 RNA は、有害物質として考慮されます。化学のフードの下で RNA の抽出を実行します。RNase フリーの環境を維持するために認定の RNase フリー試薬と装置を使用します。
<ol><li>
相分離
	<ol>
<li>氷の上凍結組織ライセートを解凍します。</li>
		<li>左が残りの組織粒子をペレットへの 4 ° C で 5 分間 1,000 x g のサンプルを遠心します。</li>
		<li>新しいヌクレアーゼ フリー 1.5 mL チューブに上清を転送します。</li>
		<li>200 μ L の冷たいクロロホルム 1 mL RNA 分離試薬ごとに追加、10-15 秒の手によって積極的に振る。</li>
		<li>室温で 2-3 分間インキュベートします。</li>
		<li>12 で遠心分離機、4 ° C で 15 分間 000 x g 注: 3 つのフェーズが含まれます今サンプル: 赤フェノール クロロホルム相、相間、上部の無色の水相を下げます。上層の水相に RNA があります。</li>
		<li>新しいヌクレアーゼ フリー 1.5 mL チューブに上層の水相 (総量の 50%) と転送を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA の沈殿物
	<ol>
<li>1 mL RNA 分離試薬あたり 0.5 mL 冷たいイソプロパノールを追加、5-6 回チューブを反転して軽く混ぜます。</li>
		<li>室温で 10-15 分間インキュベートします。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離 注: RNA の餌は、この段階で表示する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA の餌の洗浄
	<ol>
<li>ペレットを乱すことがなく、イソプロパノールを含む上清を完全に削除します。</li>
		<li>初期の換散に使用される 1 mL RNA 分離試薬あたり 1 mL 冷たい 75% エタノールの餌を洗浄します。</li>
		<li>渦サンプルを簡単に。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間遠心する 7,500 (または 12,000) × g のサンプル</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA を溶解
	<ol>
<li>ペレットを乱すことがなく清エタノールを完全に削除します。</li>
		<li>室温で RNA の餌を風乾する 3-5 分の化学のフードの下で開かれたチューブのまま (乾燥しないでください以上その場合は RNA を分解することは困難であるので)。</li>
		<li>上下慎重にピペットで 20-50 μ L ヌクレアーゼ フリー水に RNA ペレットを溶解します。</li>
		<li>さらに RNA のソリューションを改善するために 10-15 分の 55 ° C にサンプルをインキュベートします。 注: この段階で RNA はさらに詳しい分析まで-80 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 残りの DNA の消化力
<ol><li>分光光度計で分光光度計に (2 μ l) に硫酸をピペッティングによる RNA 濃度を測定し、推奨の濃度を調整します。</li>
	<li>Max で DNA を汚染の消化を開始します。50 μ L ヌクレアーゼ フリー水で 10 μ g の RNA。</li>
	<li>DNase 私のバッファーと 1 μ L rDNase 上下サンプルと軽くピペッティングによるミックス当り x 10 の 0.1 のボリュームを追加します。</li>
	<li>37 ° c 20-30 分間インキュベートします。</li>
	<li>渦 DNase 不活化試薬ピペットとよく混合サンプルに 0.1 のボリュームを追加します。</li>
	<li>時々 手で混ぜ、室温で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>1.5 分 10,000 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>無料の DNA の RNA を含む新しいヌクレアーゼ フリー チューブに上清を転送します。</li>
	<li>分光光度計による RNA 濃度と品質を測定します。</li>
</ol>7. 逆のトランスクリプション
<ol><li>逆のトランスクリプションのため市販のデオキシリボ核酸の cDNA の逆のトランスクリプション (RT) キットを使用します。 注: ここでは、RNA の 2 μ g まで取り消すことができます転写。</li>
	<li>2 μ g RNA が含まれたボリュームを計算します。新しい PCR チューブに 2 μ g RNA のピペットします。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー水を 10 μ L の最終巻に PCR チューブにサンプルに追加します。</li>
	<li>表 2に記載されている次のコンポーネントを混合することによってマスター ミックス 2 x を準備します。
</li>
	<li>20 μ L の総ボリュームのマスター ミックス × 1 を入手する 10 μ l RNA に 10 μ L 2 × マスター ミックスを追加します。</li>
	<li>ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブとスピン ・ ダウン サンプルを簡単に閉じます。</li>
	<li>PCR たちにサンプルを配置し、表 3の設定を設定します。</li>
	<li>さらに分析のための-20 ° C で生成された cDNA を格納します。</li>
</ol>8. 量的な PCR (qPCR)
<ol><li>市販キットと qPCR 反応を実行します。</li>
	<li>自己設計し、テンプレートの cDNA の異なる濃度の使用前に、イントロンにまたがるプライマーをテストします。標準曲線を作成することによってプライマーの有効性を分析し、高効率と正しい融解曲線のプライマーを使用します。 メモ: この実験で使用されるプライマーの配列は、表 2に表示されます。</li>
	<li>表 4に示された反応セットアップで 384 ウェル プレートでの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 反応を準備します。</li>
	<li>すべてのソリューションを保ち、反応混合物は準備ができたときに濡れるプレートを防ぐためにアルミ箔を使って氷の上プレート。</li>
	<li>トリプリケートのすべての反応を実行します。</li>
	<li>表 5に記載されている設定を使用してたちに PCR 反応を行います。</li>
	<li>トリプリケートからすべての反応の平均 Ct 値を計算します。Glycerinealdehyde-3-リン酸脱水素酵素の発現レベルにすべてのターゲット遺伝子を正規化 (Gapdh) 2^(-ΔCt) を計算することによって家計の遺伝子。 注: すべてのターゲット遺伝子平均 ct > 35 が検出限界の下にあると考えられていた。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-bacterial+mutualism+in+the+human+intestine.">Host-bacterial mutualism in the human intestine.</a> Science. 307, 1915-1920 (2005).</li><li>Abreu, M. 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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルは、微生物由来製品による侵入の後で発生する免疫学的プロセスを模倣します。プロトコルの中で重要なステップは、マウスの線、マウスの衛生状態、エンドトキシン血症の発生し、実験終了の時点の動物の監視, lps 投与量の選択です。最も重要なは、マウス系統の遺伝的背景が考慮されます。異なるマウス系統 LPS に対する感受性があります。たとえば、C3h/hej および C57BL/10...

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One of the authors&#39; names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic

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Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

人間の腸は、進化の過程でホストと相互に有益な関係を開発したが、内細菌叢を形成する微生物の大規模なコンソーシアムと植民地化します。この関係でホスト、細菌はビタミン、栄養素の消化や、微生物叢が1に存在する、ホスト病原体からの保護を提供しますが、微生物叢のため確保するニッチ市場に提供します。このホストと、細菌の有益な関係が妨げられるとき炎症性腸疾患 (IBD) などの病気は成長できます。IBD は、クローン病 (CD) と潰瘍性大腸炎 (UC) の 2 つの主要な形式は、遺伝と環境要因によって引き起こされる腸の多因子性の慢性炎症性疾患です。IBD の 2 つの形式の間の類似点にもかかわらず、彼らは場所や炎症性変更の性質の特定の相違によって特徴付けられます。CD は、UC は、非貫壁性とコロンに制限されている可能性がある消化管のどの部分に拡張できます再発貫壁性の炎症性疾患です。さらに、ヌクレオチド結合のオリゴメリゼーション ドメインを含む蛋白質 2 (NOD2) ムラミルジペプチド (MDP) 最もグラム陽性および陰性菌の細胞壁成分を認識するパターン認識受容 (PRR) の変異は、します。CD2に関連付けられています。なお、エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)、リステリアやレンサ球菌や自社製品すべてを見つけられたマクロファージ内バリア3に違反した後、ホストを入力した CD 患者の。細菌や自社製品 CD の開発中にホストを入力、免疫システムは循環抗細菌抗体4の生産につながる反応を開発しています。多分、IBD の病因における微生物叢の役割のための最も説得力のある証拠は、マウスモデルから生じています。動物は抗生物質と扱われたとき、またはマウス (GF) の無菌状態で保たれるとき、病気の重症度はほとんどの大腸炎モデルなどで減る IL-10-/-マウスの GF 設備5,6の大腸炎を発症しません。さらに、大腸炎はまた不均衡な構成によって特徴付けられる、dysbiosis7と呼ばれる豊かさの減少細菌叢の組成を妨げます。IBD の結果は、ホストに微生物や微生物由来製品の入り口につながることができます消化管の透過性が亢進することができます。
動物では、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) のアプリケーションは上皮バリア8の透過性亢進につながる腸上皮の違反を誘発します。ポータルの LPS 濃度が DSS 大腸炎9動物に昇格されます。興味深いことに、欠けている、C 型レクチン受容体細胞内の特定の接着分子-3 動物 nonintegrin をつかんで関連の相同物 1 (記号 R1) から保護されます DSS 大腸炎と LPS 誘導性エンドトキシン血症10。さらにホストに発信、細菌や細菌の派生製品が血管障害11、大小の腸がある腹膜、腸間膜リンパ節や肝12を渡す必要が。このシステムの複雑さを減らすためには、定義された細菌由来の化合物が使用されました。LP、腹腔や静脈の後のエンドトキシン血症をおこす注射13はインターロイキンIl6の式とインナーリードボンディングと組合への応答におけるサイトカイン日の勉強をマウスに注入されました。
LPS は、病原体関連分子パターン (種緑化) 脂質 A で構成されるグラム陰性菌の細胞壁成分として表現される (LPS の構造の主な種緑化)、コア オリゴ糖、O 側鎖14。Toll 様受容体 4 (TLR4) 上皮細胞、マクロファージ、樹状細胞によって表現される組合15、適切なバインド用共受容体を必要とするを認識します。急性期タンパク質 LPS 結合タンパク質 (LBP) 転送分化 14 のクラスターに LPS (CD14) 一種アンカー型膜タンパク質複合体を形成する組合にバインドします。CD14 さらに TLR4 の細胞外ドメインに関連付けられているリンパ球抗原 96 またはまたとして知られている MD-2 LP を往復します。LPS の MD 2 の結合を容易に下流シグナリング経路14、骨髄性分化プライマリを含むをアクティブに細胞内のアダプターの分子を募集する構造変化を誘発する TLR4/MD-2 の二量体化応答遺伝子 88 (MyD88) - 依存経路と TIR ドメインを含むアダプター誘導インターフェロン-β (TRIF) - 依存経路16。TLR4 の lp レコードの認識は、NF-κ B の経路をアクティブにし、tnf α、IL-6、および il-117などの炎症性サイトカインの発現を誘導します。
特に、動物、動物に与えられた組合の濃度が注入される組合動物とダイエットの遺伝的背景が考慮されるが。組合の高濃度は、敗血症性ショック、低血圧と複数の臓器障害によって特徴づけられる、最終的に死の18に。マウスは、人間と比較して組合に敏感 2 4 ng/kg 体重 (BW) LPS 濃度がサイトカイン ストーム19を誘導することができます。マウス、マウス範囲 10-25 mg/kg BW20使用マウス株に応じてからの半分の死を誘導する致命的な線量 (LD50)。致命的な線量 50% (LD50) は、一般的に使用されるマウス系統、C57Bl/6 および BALB/c 10 mg/kg BW です。対照的に、C3h/hej および C57BL/10ScCr 系統による LPS エンドトキシン血症、 Tlr421の突然変異が原因ですから保護されます。したがって、Tlr4 欠損マウスは LPS22注射する hyporesponsive です。化における PARP1-/-マウス23などの他の遺伝子組み換えマウス線 LPS 誘導性有毒な衝撃に耐性があります。
説明マウス モデルはここ、体の表面の障壁の違反の後組合の普及の結果を模倣するように全身管理組合の致死線量を使用します。選択した LPS 濃度 (2 mg/kg BW) C56Bl/6 マウスの死亡率が、炎症性サイトカインの放出を誘発しなかった。

<table><tbody><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set,</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>LPS Escherichia coli O111:B4</td><td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td><td>tlrl-eblps</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 Single-use insulin syringe</td><td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany</td><td>9151125</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Mikro 220R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System</td><td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td><td>R2050-1</td><td></td></tr></tbody></table>

injections of lipopolysaccharide into mice to mimic entrance of microbial-derived products after intestinal barrier breach

腸管の上皮バリアは通常容認または無視される細菌叢からホストを切り離します。この障壁の違反は、ホスト、ホストの循環および炎症性腸疾患 (IBD) の患者に見られる無秩序の炎症につながる内部器官へのアクセスに細菌や細菌由来製品の入り口に結果を腸上皮透過性亢進によって特徴付けられます。
ホストに細菌由来化合物の入り口を模倣するには、エンドトキシン血症モデルのどのリポポリサッカライド (LPS)、グラム陰性菌の外側の細胞壁の成分で採用されている、マウスに注入しました。本研究では LPS の致死線量は腹腔内投与し、マウスその後 8 h 病スコアを使用して調査しました。さらに、炎症性サイトカインIl6、 Il1b、および日のレベルを異なる時点で qPCR 脾臓、肝臓、結腸で行った式は、lps を投稿します。このモデルは、微生物や体表面の障壁の違反によって引き起こされる細菌由来製品の侵入の後の免疫反応の調査を含む研究の役に立つかもしれない。

ホストの腸粘膜バリアー違反の後に発生する細菌または細菌由来製品の入学後結果を模倣、組合は致死用量 (2 μ g/g 体重) の c57bl/6 マウスに注入されました。すべての単一のマウスだった監視し、エンドトキシン血症の発生、マウスの外観、動物、目の条件と呼吸速度と品質 (表 1) の活動を含むスコア シートに記載されているパラメーターを持つ得点.動?...

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腸管バリア破壊後の微生物由来産物の侵入を模倣するためのマウスへのリポ多糖の注射 |免疫学と感染症 |ビデオ

Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

ここで腸の障壁の違反の後細菌由来化合物の入り口を模倣するためのプロトコルが表示されます。リポ多糖の低致死線量は全身投与後 24 時間の監視されたマウスに注入しました。プロ炎症性サイトカインの発現は大腸、肝臓、脾臓でいくつかの時点で決定されます。

リポ多糖の腸粘膜バリアー違反の後微生物由来製品の入り口を模倣するマウスに注射

The intestinal epithelial barrier separates the host from the microbiota that is normally tolerated or ignored. The breach of this barrier results in the ...

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19.3K ビュー.  University of Basel. ここで腸の障壁の違反の後細菌由来化合物の入り口を模倣するためのプロトコルが表示されます。リポ多糖の低致死線量は全身投与後 24 時間の監視されたマウスに注入しました。プロ炎症性サイトカインの発現は大腸、肝臓、脾臓でいくつかの時点で決定されます。

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Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as pre-clinical models to test interventions. In these methods, we describe a technique in which lipopolysaccharide (LPS) is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple, effectively modeling mastitis, or inflammation, of the gland. This simulated infection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, as visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse1.
Our ultimate goal in developing these methods was to study the inflammation associated with mastitis in the lactating gland, which often includes redness, swelling, and immune cell infiltration2,3. Therefore, we were keenly aware that incision or any type of wounding of the skin, the nipple, or the gland in order to introduce the LPS could not be utilized in our methods since the approach would likely confound the read-out of inflammation. We also desired a straight-forward method that did not require specially made hand-drawn pipettes or the use of micromanipulators to hold these specialized tools in place. Thus, we determined to use a commercially available insulin syringe and to inject the agent into the mammary duct of an intact nipple. This method was successful and allowed us to study the inflammation associated with LPS injection without any additional effects overlaid by the process of injection. In addition, this method also utilized an NF-&kappa;B luciferase reporter transgenic mouse and bioluminescent imaging technology to visually and quantitatively show increased NF-&kappa;B signaling within the LPS-injected gland4.
These methods are of interest to researchers of many disciplines who wish to model disease within the lactating mammary gland, as ultimately, the technique described here could be utilized for injection of a number of substances, and is not limited to only LPS.

Described here is a technique in which lipopolysaccharide is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple to simulate mastitis, a condition commonly caused by bacterial infection. Lipopolysaccharide injection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse.

乳腺炎のモデルマウスとしてのLPS管内注入：シグナリングは、NF-κBレポータートランスジェニックを介して可視化

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

医学

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

免疫・感染学

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

慢性サルモネラ感染誘発性腸線維症

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, and neuroinflammation is often observed as a co-occurrence. Here, we describe a sub-acute CMHs rat model induced by lipopolysaccharide (LPS) injection, as well as a method for detecting CMHs. Systemic LPS injection is relatively simple, economical, and cost-effective. One major advantage of LPS injection is its stability to induce inflammation. CMHs caused by LPS injection could be detected by gross observation, hematoxylin and eosin (HE) staining, Perl&#39;s Prussian staining, Evans blue (EB) double-labeling, and magnetic resonance imaging-susceptibility weighted imaging (MRI-SWI) technology. Finally, other methods of developing CMHs animal models, including their advantages and/or disadvantages, are also discussed in this report.

We present a protocol to induce and detect CMHs caused by LPS injection in Sprague-Dawley rats, which may be utilized in future research investigations on the pathogenesis of CMHs.

ラットにおけるリポ多糖投与による亜急性の脳 Microhemorrhages

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, ...

神経科学

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

直接気管内リポ多糖刺激によるマウスの急性肺損傷の誘導

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

新生児腸管の発達に及ぼす急性絨毛膜炎の影響を研究する母体炎症への胎児暴露のマウスモデル

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of acute lung injury or acute inflammation. The current most commonly used methods in acute lung injury mouse models are an intraperitoneal injection of LPS and tracheostomy for the tracheal infusion of LPS. However, the former method lacks lung targeting and damages other organs, and the latter method induces operative trauma, infection risk, and a low survival rate. Here, we recommend a noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation method for LPS instillation in mice. In this method, LPS is noninvasively introduced into the trachea through the oropharyngeal cavity to be instilled into the lung with the help of an apparatus for endotracheal intubation. This method not only assures lung targeting but also avoids damage and the risk of death in the animals. We expect that this approach will become widely used in the field of acute lung injury.

Here, we propose a protocol for intratracheal lipopolysaccharide (LPS) delivery via noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation. This method minimizes the trauma of the surgical procedure for the animal and accurately delivers LPS to the trachea and then to the lungs.

マウスにおける非侵襲的気管内リポ多糖点滴

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

生物学

Subcutaneous Injection of Bacterial Antigen to Induce Systemic Inflammation in a Murine Model

Source: John, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62925">Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the induction of systemic inflammation in an anesthetized mouse. The injection of mycobacterial antigen-adjuvant depots triggers cytokine release and localized inflammation. Lymphatic vessels open, enabling immune cell entry into lymph nodes and activation of T cells, which release pro-inflammatory cytokines, leading to widespread inflammation.

マウスモデルにおける全身性炎症を誘発するための細菌抗原の皮下注射

Source: John, S. et al., Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis.&#160;J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the ...