JHN İsviçre Ulusal Vakfı (SNSF 310030_146290) tarafından desteklenmektedir.

Fareler yetiştirilen ve belirli patojen-Alerjik (SPF) şartlarda, biyomedikal bölümü, Basel Üniversitesi (Basel, İsviçre) hayvan tesisi devam etti. Tüm fare deneyleri İsviçre Federal ve Kanton düzenlemeler (hayvan iletişim kuralı numarası 2816 [Kanton Basel-Stadt]) uygun olarak yapıldı.
1. LPS çözüm hazırlanması
<ol><li>Escherichia coli 0111:B4 steril koşullarda gelen saf LPS stokunun açın ve su 5 mg/mL konsantrasyonu için yeniden oluşturma.</li>
	<li>Steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 0.2 µg/µL çalışma konsantrasyonu ile LPS stok sulandırmak.</li>
</ol>2. LPS farelere mayi enjeksiyon
<ol><li>Çözüm bir 0.5 mL şırınga 30 G iğne Laminer hava akışı ile çalışma LPS Aspire edin.</li>
	<li>Kadın C57Bl/6 fare (10 hafta-in yaş altı) tartmak ve eklenecek LPS, miktarı: 10 µL (2 µg) /g vücut ağırlığı. Not: bir fare 20 g ardından 20 g x 10 µL tartmak Eğer örneğin, 200 µL LPS enjekte edilir çözüm ihtiyaçlarını çalışma =.</li>
	<li>Nazikçe ama sıkıca fare işlemek ve bir elinde hayvan dizginlemek. Hayvan ama normal nefes değil kıvrıl ve dön sırasında kısıtlama mümkün olduğundan emin olun.</li>
	<li>Fare burun biraz karın enjeksiyon için ortaya çıkarmak için yere doğru eğin. Karın ve enjeksiyon yeri orta hat düşük karın sol veya sağ orta hat üzerinden bulun. I.p. PBS LPS yerine kontrol fareler enjekte.</li>
	<li>Serbest el ile uygun birimi (2.2 adımda hesaplanan birim) enjekte çözüm çalışma LPS. İğne Periton boşluğuna aksi, mis enjeksiyonları karın kas katmanına oluşabilir girdiğini emin olun. Hala, o bölgede bulunan iç organlara zarar önlemek için peritoneal kavite içine iğneyle çok derine gitme.</li>
	<li>Hayvan dikkatli belgili tanımlık kafes kafes başına en fazla 5 fare ile dönün.</li>
</ol>3. monitör fareler
<ol><li>Hayvanlar oluşumu ve endotoksemi şiddeti için 8 h için enjeksiyon sonra enjeksiyon ve her 2 h anda izlemek. Bu nedenle, daha önce yayımlanmış makale 24adapte edilmiş bir skor sayfası (Tablo 1) kullanmalıdır.</li>
	<li>
LPS enjekte fareler tablo 1'de listelenen aşağıdaki parametreler için puan edinildi
	<ol>
<li>Normalde pürüzsüz olan kürk görünümü için kontrol edin. Kürk rahatsızlık ve/veya ağrı gösteren karıştırdı, dikenli veya kabarık kürk görüntülenirse, onları 1, 2 veya 3 puan edinildi.</li>
		<li>Fare etkinliği için kontrol edin. Not: Fareler normalde serbestçe yeme, içme, tırmanma bütün kafes hareket eder ama bastırılmış ya da kısıtlı aktivite acı belirtisi olabilir.</li>
		<li>Bilinç düzeyini kontrol edin. Not: Fareler çok meraklı, ve onlar normalde çevreleyen soruşturma kafes hareket eder. Eksikliği veya azaltılmış hareketi ağrı ve rahatsızlık önerebilirsiniz.</li>
		<li>Gözlere bakın. Not: Tam olarak açık gözleri sağlıklı farelerde bekleniyor, ancak muhtemelen salgılanması ile kısmen veya tamamen kapalı gözler acı belirtisi olabilir.</li>
		<li>İçin solunum hızını denetleyin. Not: Sağlıklı fareler genellikle normal ve hızlı solunum oranına sahip, düşük solunum oranı rahatsızlık belirtisi olabilir).</li>
		<li>Solunum kalitesi için kontrol edin. Not: Zahmetli nefes ya da nefes nefese olmadan acı bir işaretidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. doku örnekleme ribonükleik asit (RNA) çıkarımı ve homojenizasyon için
<ol><li>Toplama/homojenizasyon tüpleri hazırlayın: eklemek 1 mL tek adım RNA izolasyon reaktif 2 mL tüpler için 1.4 mm seramik küre ile doldurulmuş.</li>
	<li>Uygun zaman noktalarda ((0 h) önce ve 2 h, 4 h ve 8 h LPS enjeksiyon sonra) kan kaybı tarafından takip anestezik aşırı doz (isoflurane) fareyle ötenazi ve diseksiyon ile devam edin.</li>
	<li>Deri ve iç organları ile karın boşluğu makas çifti ile açığa kas katmanı kesti.</li>
	<li>Dikkatle dalak, karaciğer ve iki nokta üst üste incelemek, fat dosya sisteminden organlara temiz ve onları PBS buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Makas veya skalpel kullanarak her organ dan küçük bir parça (yaklaşık 0.5 cm uzunluğunda) kesip. Not: Her zaman her fare (iki nokta üst üste karaciğer, proksimal veya distal kısmının aynı LOB) organ yaklaşık aynı bölümünden parça almak önemlidir.</li>
	<li>Kısa bir süre doku kağıt doku parçası üzerinde kuru ve toplama/homojenizasyon tüp tamamen RNA izolasyon reaktif içinde batırılır emin yerleştirebilirsiniz.</li>
	<li>Bir yüksek hızlı benchtop homogenizer dokusunda lunaparkçı. Dalak, karaciğer ve iki nokta üst üste 1 döngüsü homojenizasyon için 30 6,00 hızda kullanmak gibi yumuşak dokular için s.</li>
	<li>Örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde yer ek bileşeni için sıvı azot tüp dondurma doku lysate. RNA izolasyon kadar-80 ° C'de lysate donmuş ek depolar.</li>
</ol>5. RNA doku çıkarma
Not: RNA izolasyon reaktifler, kloroform ve alkoller tehlikeli madde kabul edilir. RNA ayıklama kimyasal bir başlık altında gerçekleştirin. Sertifikalı RNase free reaktifler ve ekipman RNase içermeyen bir ortam sağlamak için kullanın.
<ol><li>
Faz ayrımı
	<ol>
<li>Buzda donmuş doku lysate çözülme.</li>
		<li>Örnek 4 ° C'de kalmayabilir kalan doku parçacıkları cips için 5 min için 1000 x g santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant yeni bir 1,5 mL nükleaz ücretsiz tüp aktarın.</li>
		<li>1 mL RNA izolasyon reaktif başına 200 µL buz gibi kloroform ekleyin ve elle 10-15 s için şiddetle çalkalanır.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 2-3 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj 12, 000 x g 4 ° C'de 15 dakika Not: Örnek şimdi 3 aşama içerir: alt kırmızı fenol kloroform faz, interfaz ve üst renksiz sulu faz. RNA üst sulu aşamasında bulunuyor.</li>
		<li>Üst sulu faz (toplam hacminin % 50) ve transfer yeni 1,5 mL nükleaz ücretsiz tüp içine toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA Yağış
	<ol>
<li>1 mL RNA izolasyon reaktif başına 0.5 mL buz gibi isopropanol ekleyin ve karışımı yavaşça 5 - 6 kez tüp ters çevirme tarafından.</li>
		<li>10-15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika için 12.000 x g, santrifüj Not: Bu aşamada RNA Pelet görünür olması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA Pelet yıkama
	<ol>
<li>Tamamen isopropanol Pelet bozmadan içeren süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Pelet 1 mL buz gibi % 75 etanol ilk lizis için kullanılan 1 mL RNA izolasyon reaktif başı ile yıkayın.</li>
		<li>Girdap örnek kısa bir süre.</li>
		<li>Santrifüj örneği 7,500 (ya da 12.000) x g ' 4 ° C'de 5 min için</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA eriterek
	<ol>
<li>Tamamen etanol içinde süpernatant Pelet bozmadan kaldırın.</li>
		<li>3-5 dakika oda sıcaklığında RNA Pelet kurumasını kimyasal başlık altında açılan tüp bırakın (Bu durumda RNA çözülmeye zor olacak gibi aşırı kuru değil).</li>
		<li>20-50 µL nükleaz ücretsiz su RNA Pelet dikkatlice yukarı ve aşağı pipetting tarafından geçiyoruz.</li>
		<li>Örnek 10-15 dk daha fazla RNA'ın çözüm geliştirmek için 55 ° C'de kuluçkaya. Not: Bu aşamada, RNA-80 ° c daha fazla analiz kadar saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. sindirim kalan DNA'ın
<ol><li>RNA konsantrasyon Spektrofotometre ile Spektrofotometre bir aliquot (2 µl) pipetting tarafından ölçmek ve önerilen konsantrasyon için ayarlayın.</li>
	<li>Max ile DNA kirletici sindirim başlatın. 10 µg RNA nükleaz ücretsiz 50 µL suda.</li>
	<li>10 ben tampon Dnaz ve ben her örnek ve karışımı yavaşça pipetting tarafından yukarı ve aşağı 1 µL rDNase x 0.1 birimi ekleyin.</li>
	<li>20-30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Girdap Dnaz Inactivation reaktif ve 0.1 birim de pipet ile karıştırma örnek ekleyin.</li>
	<li>Zaman zaman el ile karıştırma oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>10.000 x g 1.5 dakika, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yeni nükleaz ücretsiz tüp içine DNA-Alerjik RNA içeren süpernatant aktarın.</li>
	<li>Ölçü RNA konsantrasyon ve kalitesi ile Spektrofotometre.</li>
</ol>7. ters transkripsiyon
<ol><li>Piyasada bulunan deoksiribonükleik asit cDNA ters transkripsiyon (RT) kiti ters transkripsiyon için kullanın. Not: Burada, RNA 2 µg kadar kopya etmek ters kaydedilebilir.</li>
	<li>2 µg RNA içeren birimin hesaplayın. Yeni bir PCR tüp 2 µg RNA pipet.</li>
	<li>Son hacmi 10 µL PCR tüp örnekte nükleaz ücretsiz su ekleyin.</li>
	<li>2 x Master Mix karıştırma aşağıdaki bileşenleri tarafından Tablo 2 ' de listelenen hazırlamak
</li>
	<li>10 µL 2 Master Mix x 1 x Master Mix 20 µL hacmi elde etmek için 10 µl RNA ekleyin.</li>
	<li>Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp ve örnek aşağı spin kısaca kapatın.</li>
	<li>Örnekleri bir PCR Thermocycler yerleştirin ve Tablo 3' te listelenen ayarları ayarlayın.</li>
	<li>-20 ° c daha fazla çözümleme için oluşturulan cDNA saklayın.</li>
</ol>8. kantitatif PCR (qPCR)
<ol><li>Piyasada bulunan bir kit ile qPCR reaksiyonu gerçekleştirmek.</li>
	<li>Kendi tasarım ve intron kapsayan astar şablonu cDNA farklı konsantrasyonları ile kullanımdan önce sınayın. Standart bir eğri oluşturarak astar etkinliğini analiz ve yüksek etkinlik ve doğru erime eğrileri ile astar kullanabilirsiniz. Not: Bu deneyde kullanılan astar dizisi Tablo 2' de listelenmiştir.</li>
	<li>Tablo 4' te açıklanan tepki Kur ile kantitatif Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tepkimesi 384-şey plaka hazırlayın.</li>
	<li>Zaman reaksiyon karışımı hazırlanan tüm çözümler ve plaka plaka engellemek için alüminyum folyo kullanarak buz üzerinde ıslak tutmak.</li>
	<li>Bütün tepkiler triplicates içinde gerçekleştirin.</li>
	<li>Tablo 5' te listelenen ayarı kullanarak bir thermocycler PCR reaksiyon yerine getirir.</li>
	<li>Tüm triplicates tepkiler ortalama Ct değeri hesaplamak. Tüm hedef genlerin glycerinealdehyde-3-fosfat dehidrojenaz ifade seviyesine normalize (Gapdh) 2^(-ΔCt) hesaplayarak temizlik gen. Not: Tüm hedef genlerin ortalama Ct ile > 35 algılama sınırının altında olmak olarak kabul.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-bacterial+mutualism+in+the+human+intestine.">Host-bacterial mutualism in the human intestine.</a> Science. 307, 1915-1920 (2005).</li><li>Abreu, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NOD2+are+associated+with+fibrostenosing+disease+in+patients+with+Crohn's+disease.">Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+evidence+of+Listeria,+Escherichia+coli,+and+Streptococcus+antigens+in+Crohn's+disease.">Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).</li><li>Schaffer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Saccharomyces+cerevisiae+mannan+antibodies+(ASCA)+of+Crohn's+patients+crossreact+with+mannan+from+other+yeast+strains,+and+murine+ASCA+IgM+can+be+experimentally+induced+with+Candida+albicans.">Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn's patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans.</a> Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).</li><li>Sellon, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+enteric+bacteria+are+necessary+for+development+of+spontaneous+colitis+and+immune+system+activation+in+interleukin-10-deficient+mice.">Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice.</a> Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).</li><li>Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+in+mouse+models+of+inflammatory+bowel+disease.">The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease.</a> Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).</li><li>Schaubeck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysbiotic+gut+microbiota+causes+transmissible+Crohn's+disease-like+ileitis+independent+of+failure+in+antimicrobial+defence.">Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn's disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence.</a> Gut. 65, 225-237 (2016).</li><li>Steinert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stimulation+of+Macrophages+with+TLR+Ligands+Supports+Increased+IL-19+Expression+in+Inflammatory+Bowel+Disease+Patients+and+in+Colitis+Models.">The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models.</a> J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).</li><li>Gabele, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSS+induced+colitis+increases+portal+LPS+levels+and+enhances+hepatic+inflammation+and+fibrogenesis+in+experimental+NASH.">DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH.</a> J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).</li><li>Saunders, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin+SIGN-R1+has+a+role+in+experimental+colitis+and+responsiveness+to+lipopolysaccharide.">C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide.</a> J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).</li><li>Spadoni, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut-vascular+barrier+controls+the+systemic+dissemination+of+bacteria.">A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria.</a> Science. 350, 830-834 (2015).</li><li>Balmer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+may+act+as+a+firewall+mediating+mutualism+between+the+host+and+its+gut+commensal+microbiota.">The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota.</a> Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).</li><li>Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+bacterial+lipopolysaccharides+with+tissue+macrophages+and+plasma+lipoproteins.">Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins.</a> Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).</li><li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li><li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+clearance,+bacterial+clearance,+and+systemic+inflammatory+responses+are+regulated+by+cell+type-specific+functions+of+TLR4+during+sepsis.">Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis.</a> J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).</li><li>Kagan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAM+couples+endocytosis+of+Toll-like+receptor+4+to+the+induction+of+interferon-beta.">TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta.</a> Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).</li><li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunopathogenesis+of+sepsis.">The immunopathogenesis of sepsis.</a> Nature. 420, 885-891 (2002).</li><li>Suffredini, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+recombinant+dimeric+TNF+receptor+on+human+inflammatory+responses+following+intravenous+endotoxin+administration.">Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration.</a> J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).</li><li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5, 143-153 (2014).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282, 2085-2088 (1998).</li><li>Hoshino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Toll-like+receptor+4+(TLR4)-deficient+mice+are+hyporesponsive+to+lipopolysaccharide:+evidence+for+TLR4+as+the+Lps+gene+product.">Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product.</a> J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).</li><li>Corral, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipopolysaccharide+and+cecal+ligation+and+puncture+on+blood+coagulation+and+inflammation+in+sensitive+and+resistant+mice+models.">Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models.</a> Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).</li><li>Shrum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+scoring+system+to+evaluate+sepsis+severity+in+an+animal+model.">A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model.</a> BMC Res Notes. 7, 233 (2014).</li><li>Brandwein, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneously+colitic+C3H/HeJBir+mice+demonstrate+selective+antibody+reactivity+to+antigens+of+the+enteric+bacterial+flora.">Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora.</a> J Immunol. 159, 44-52 (1997).</li><li>Macpherson, A. J., McCoy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardised+animal+models+of+host+microbial+mutualism.">Standardised animal models of host microbial mutualism.</a> Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).</li><li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice,+Dirty+Mice,+and+Men:+Using+Mice+To+Understand+Human+Immunology.">Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology.</a> J Immunol. 199, 383-388 (2017).</li><li>Wirtz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+lethal+septic+peritonitis+by+neutralizing+the+biological+function+of+interleukin+27.">Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27.</a> J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı mikrobiyal kaynaklı ürünler tarafından işgalden sonra gerçekleşen immünolojik süreçleri taklit eder. Kritik protokol içinde fare çizgi, fareler hijyen durumunu, LPS, hayvanlar endotoksemi oluşumunu ve deney fesih süresi noktası için izleme doz seçimi adımlardır. En önemlisi, genetik arka plan fare baskı kabul gerekir. Farklı fare suşları LPS farklı duyarlılık var. Örneğin, indüklenen C3H/HeJ ve C57BL/10ScCr fareler için LPS dirençli endotoksemi21</sup...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57610/injections-lipopolysaccharide-into-mice-to-mimic-entrance-microbial">Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach</a>
One of the authors&#39; names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57610/injections-lipopolysaccharide-into-mice-to-mimic-entrance-microbial">Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach</a>.&#160;An author name was updated.

Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

İnsan bağırsak bir karşılıklı yararlı ilişkilerini evrimi sırasında ana bilgisayar ile geliştirmiştir microbiota, oluşturan mikroorganizmaların büyük bir konsorsiyum ile kolonize. Vitaminler, besin sindirim ve patojenler koruma microbiota1bulunduğu ana bilgisayara microbiota sağlar, ancak bu ilişkide, ana bilgisayar güvenli bir niş microbiota için sağlar. Ev sahibi ve microbiota yararlı bu ilişkisi rahatsız zaman, iltihabi bağırsak hastalığı (IBD) gibi hastalıklar gelişebilir. IBD bir multifaktöriyel kronik inflamatuar iki önemli biçimde, Crohn hastalığı (CD) ve Ülseratif Kolit (UC) oluşan genetik ve çevresel faktörler nedeniyle bağırsak hastalığıdır. İki IBD form arasındaki benzerlikler olsa da, onlar konum ve inflamatuar değişiklikler doğası bazı farklılıklar karakterizedir. CD UC transmural sigara ve kolon sınırlı iken potansiyel olarak gastrointestinal sistem herhangi bir bölüme genişletebilirsiniz bir relaps transmural inflamatuvar hastalıktır. Ayrıca, mutasyonlar nükleotit bağlama Oligomerizasyonda etki alanını içeren protein 2 (NOD2), Muramil dipeptid (MDP), bir bileşeni en gram-pozitif - negatif bakteriler, hücre duvarı tanıdığı bir desen tanıma reseptör (PRR) olduğunu CD2ile ilişkili. Ayrıca, Escherichia coli (e.coli), Listeria ve streptokok ürünlerini tüm makrofajlar içinde bir bariyeri sonra3ana girdiğiniz CD hastalarda bulunmuştur. Bakteri veya ürünlerini ana CD geliştirilmesi sırasında girdiğinizde, anti-bakteriyel antikorlar4dolaşan üretimi için önde gelen bir yanıt bağışıklık sistemi geliştirir. Belki de, en inandırıcı kanıt microbiota IBD patogenezinde rol için fare modelleri kaynaklanıyor. Hayvanlar antibiyotiklerle tedavi edilir zaman, ya da fareler döl-özgür (GF) koşullarda tutulur, hastalığın şiddeti en kolit modellerinde gibi farelerde IL-10-/-kolit GF İmkanları5,6geliştirdiğiniz değil azalır. Ayrıca, kolit da dengesiz bir kompozisyon ile karakterizedir ve dysbiosis7denilen zenginlik azaltılmış microbiota bileşimi rahatsız ediyor. Mikroplar ve mikrobiyal kaynaklı ürünler girişine doğru ev sahibi açabilir artan bir bağırsak geçirgenliği IBD sonucu olabilir.
Hayvanlarda, uygulama Dextran sodyum sülfat (DSS) epitel bariyer8bir artan geçirgenliği için önde gelen bir bağırsak epitel gedik neden olmaktadır. DSS kolit9ile hayvanlarda Portal LPS konsantrasyonları yüksek. İlginçtir, C tipi lektin reseptör belirli hücre içi adezyon molekülü-3 eksik hayvanlar nonintegrin kapma homolog ile ilgili 1 (işareti-R1) DSS kolit ve LPS kaynaklı endotoksemi10korunur. Daha fazla ana bilgisayar yaymak için bakteri veya türetilmiş bakteri ürünleri vasküler bariyer11, küçük ve büyük bağırsak bulunur Periton boşluğuna, Mezenterik lenf düğümleri ve/veya karaciğer12geçmek zorunda. Bu sistem karmaşıklığını azaltmak için tanımlanmış bir bakteriyel kaynaklı bileşik kullanıldı. LPS, endotoksemi yol açan mayi (IP) veya Intravenous (IV) sonra enjeksiyon13 İnterlökin Il6 ifade ve Bab ve sitokin Tnfa LPS karşılık olarak çalışmaya fareler, içine enjekte.
LPS olduğunu lipid A oluşan bir hücre duvarı bileşeni Ayagin Gram-negatif bakteriler, olarak ifade edilen bir patojen ilişkili moleküler desen (PAMP) (LPS yapısı ana PAMP), çekirdek oligosakkarit ve bir O zinciri14yan. Toll benzeri reseptör dendritik hücreler, makrofajlar ve epitel hücreleri tarafından ifade edilen 4 (TLR4) Co reseptörleri için uygun bağlama gerektiren LPS15, tanır. Akut Faz LPS farklılaşma 14 kümeye LPS (CD14), bir glycosylphosphatidylinositol bağlantılı membran protein aktarır bir kompleks oluştururlar, protein LPS-bağlayıcı protein (LBP) bağlar. CD14 daha fazla LPS lenfosit antijeni 96 veya diğer adıyla MD-2, TLR4 ekstrasellüler etki alanı ile ilişkili olduğu taşırma su bendi kapakları. MD-2 LPS bağlama Miyeloid farklılaşma İlköğretim içeren aşağı akım sinyal yolu14, etkinleştirmek için hücre içi adaptör molekülleri askere konformasyon değişiklikleri ikna etmek için TLR4/MD-2 dimerization kolaylaştırır Yanıt gen 88 (MyD88) - bağımlı yolu ve tır etki alanını içeren adaptör-inducing interferon-β (TRIF) - bağımlı yolu16. LPS TLR4 tarafından tanınması sonra NF-κB yolu etkinleştirir ve proinflamatuar sitokinler, TNFα, Il-6 ve IL-1β17gibi ifadesi indükler.
LPS enjekte edilir zaman hayvanlar, hayvanlar için verilen LPS konsantrasyonu içine özellikle, hayvan ve diyet genetik arka plan kabul gerekir. LPS yüksek konsantrasyonda hipotansiyon ve birden fazla organ arızaları, ile karakterize bir septik şoka yol açar ve sonunda ölüm18. Fareler nerede LPS konsantrasyonları 2-4 ng/kg vücut ağırlığı (BW) arasında bir sitokin fırtına19ikna edebiliyoruz daha az göre uzatmaktı, LPS duyarlıdır. Fareler için öldürücü doz (LD50), hangi ölüm yarısı 10-25 mg/kg BW20 bağlı olarak kullanılan fare zorlanma fareler aralıklarının neden olmaktadır. C57Bl/6 ve BALB/c, yaygın olarak kullanılan fare suşları için 10 mg/kg BW (LD50) % öldürücü doz 50'dir. Buna ek olarak, suşları C3H/HeJ ve C57BL/10ScCr Tlr421mutasyonların kaynaklanmaktadır indüklenen LPS endotoksemi korunuyorsunuz demektir. Sonuç olarak, Tlr4-eksik fareler hiporesponsif LPS22ile enjeksiyonlar için değildir. Diğer genetik olarak değiştirilmiş fare, PARP1/fareler23 gibi LPS kaynaklı toksik şok dayanıklı vardır.
Açıklanan fare modeli burada sistemik bir bariyer ihlali sonra LPS yayılması vücudun yüzeyler sonuçlarını taklit etmek için yönetilen LPS sublethal bir doz kullanır. Seçilen LPS konsantrasyonu (2 mg/kg BW) mortalite C56Bl/6 farelerde ama pro-inflamatuar sitokinlerin indüklenen sürümü ikna etmek değil.

<table><tbody><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set,</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>LPS Escherichia coli O111:B4</td><td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td><td>tlrl-eblps</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 Single-use insulin syringe</td><td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany</td><td>9151125</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Mikro 220R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System</td><td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td><td>R2050-1</td><td></td></tr></tbody></table>

injections of lipopolysaccharide into mice to mimic entrance of microbial-derived products after intestinal barrier breach

Bağırsak epitel bariyer normalde tolere veya göz ardı microbiota konaktan ayırır. Bu bariyer ihlali ana bilgisayar dolaşım ve iç organların iltihabi bağırsak hastalığı (IBD) olgularda gözlenen gibi kontrolsüz iltihap için önde gelen erişim ana bilgisayar içine bakteri veya bakteri kaynaklı ürün giriş sonuç bu tarafından artan bir bağırsak epitel geçirgenliği ile karakterizedir.
Ana girişinde bileşiklerin bakteriyel kaynaklı taklit etmek için bir endotoksemi modeli kabul hangi lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif bakteri dış hücre duvarına bir bileşenidir, fareler enjekte edildi. Bu çalışmada, LPS sublethal bir doz intraperitoneally enjekte ettiler ve fareler daha sonra 8 h bir hastalık Puan kullanarak takip. Ayrıca, Il6, Il1b ve Tnfa inflamatuar sitokinlerin düzeyde dalak, karaciğer ve kolon qPCR farklı zaman noktalarda tarafından analiz edildi ifade LPS enjeksiyon sonrası. Bu model bağışıklık yanıtı araştırmaların ardından mikroorganizmalar veya vücut yüzeyleri bariyer ihlali tarafından neden olduğu bakteriyel kaynaklı ürünler işgali ile ilgili çalışmaları için yararlı olabilir.

Sonuçları için ana bağırsak bariyer ihlali sonra oluşur giriş bakteri veya bakteriyel kaynaklı ürün sonra taklit etmek için LPS enjekte içine sublethal doz (2 µg/g vücut ağırlığı) farelerde C57Bl/6. Her tek fare takip ve fareler görünümünü, hayvanlar, gözler, durumu ve solunum hızı ve kalitesi (Tablo 1) faaliyet içerir skor tablosunda listelenen parametrelerle endotoksemi oluşumu için attı . Hayvanlar içinde 24 h (şeki...

Watch this Scientific Journal Video about Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach at JoVE.com

Bağırsak Bariyerinin İhlalinden Sonra Mikrobiyal Kaynaklı Ürünlerin Girişini Taklit Etmek İçin Farelere Lipopolisakkarit Enjeksiyonu | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

Burada bağırsak bariyer ihlali sonra girişinde bileşiklerin bakteriyel kaynaklı taklit için bir protokol sunulmuştur. Lipopolysaccharide sublethal düşük dozda sistemik 24 saat sonrası enjeksiyon için izlenen fareler içine enjekte ettiler. Pro-inflamatuar sitokinlerin ifade dalak, karaciğer ve iki nokta üst üste birkaç saat noktada tespit edilmiştir.

Lipopolysaccharide enjeksiyon bağırsak bariyer ihlali sonra giriş ürünlerin mikrobiyal kaynaklı taklit etmek için fareler içine

The intestinal epithelial barrier separates the host from the microbiota that is normally tolerated or ignored. The breach of this barrier results in the ...

injections-lipopolysaccharide-into-mice-to-mimic-entrance-microbial

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Human Biology

Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

19.3K Görüntüleme.  University of Basel. Burada bağırsak bariyer ihlali sonra girişinde bileşiklerin bakteriyel kaynaklı taklit için bir protokol sunulmuştur. Lipopolysaccharide sublethal düşük dozda sistemik 24 saat sonrası enjeksiyon için izlenen fareler içine enjekte ettiler. Pro-inflamatuar sitokinlerin ifade dalak, karaciğer ve iki nokta üst üste birkaç saat noktada tespit edilmiştir.

Video: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as pre-clinical models to test interventions. In these methods, we describe a technique in which lipopolysaccharide (LPS) is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple, effectively modeling mastitis, or inflammation, of the gland. This simulated infection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, as visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse1.
Our ultimate goal in developing these methods was to study the inflammation associated with mastitis in the lactating gland, which often includes redness, swelling, and immune cell infiltration2,3. Therefore, we were keenly aware that incision or any type of wounding of the skin, the nipple, or the gland in order to introduce the LPS could not be utilized in our methods since the approach would likely confound the read-out of inflammation. We also desired a straight-forward method that did not require specially made hand-drawn pipettes or the use of micromanipulators to hold these specialized tools in place. Thus, we determined to use a commercially available insulin syringe and to inject the agent into the mammary duct of an intact nipple. This method was successful and allowed us to study the inflammation associated with LPS injection without any additional effects overlaid by the process of injection. In addition, this method also utilized an NF-&kappa;B luciferase reporter transgenic mouse and bioluminescent imaging technology to visually and quantitatively show increased NF-&kappa;B signaling within the LPS-injected gland4.
These methods are of interest to researchers of many disciplines who wish to model disease within the lactating mammary gland, as ultimately, the technique described here could be utilized for injection of a number of substances, and is not limited to only LPS.

Described here is a technique in which lipopolysaccharide is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple to simulate mastitis, a condition commonly caused by bacterial infection. Lipopolysaccharide injection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse.

Mastitis Fare Model olarak LPS Intradüktal Enjeksiyon: Sinyal bir NF-KB Reporter Transgenik aracılığı ile görsel

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

Tıp

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of vaccine to lymph nodes where antigen presenting cells can interact with lymphocytes for generation of the wanted immune responses. The strength and the type of immune responses induced also depend on the density or frequency of interactions as well as the microenvironment, especially the content of cytokines. As only a minute fraction of peripherally injected vaccines reaches the lymph nodes, vaccinations of mice and humans were performed by direct injection of vaccine into inguinal lymph nodes, i.e.&#160;intralymphatic injection. In man, the procedure is guided by ultrasound. In mice, a small (5-10 mm) incision is made in the inguinal region of anesthetized animals, the lymph node is localized and immobilized with forceps, and a volume of 10-20 &#956;l of the vaccine is injected under visual control. The incision is closed with a single stitch using surgical sutures. Mice were vaccinated with plasmid DNA, RNA, peptide, protein, particles, and bacteria as well as adjuvants, and strong improvement of immune responses against all type of vaccines was observed. The intralymphatic method of vaccination is especially appropriate in situations where conventional vaccination produces insufficient immunity or where the amount of available vaccine is limited.

Prophylactic and therapeutic vaccination often fails to stimulate strong immune responses due to week drainage of the vaccine to lymph nodes and consequently poor involvement of immune cells. By direct injection of vaccine to lymph nodes, so-called intralymphatic injection, vaccine efficacy can be strongly improved and vaccine doses can be reduced.

Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Alternatifi olarak dilaltı immünoterapi Akut Solunum Enfeksiyonları Karşı Koruma tetikleyebilecek

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Doğrudan Intratracheal Lipopolysaccharide Instilasyon ile farelerde akut akciğer hasarının İndükleme

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

Biyoloji

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of acute lung injury or acute inflammation. The current most commonly used methods in acute lung injury mouse models are an intraperitoneal injection of LPS and tracheostomy for the tracheal infusion of LPS. However, the former method lacks lung targeting and damages other organs, and the latter method induces operative trauma, infection risk, and a low survival rate. Here, we recommend a noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation method for LPS instillation in mice. In this method, LPS is noninvasively introduced into the trachea through the oropharyngeal cavity to be instilled into the lung with the help of an apparatus for endotracheal intubation. This method not only assures lung targeting but also avoids damage and the risk of death in the animals. We expect that this approach will become widely used in the field of acute lung injury.

Here, we propose a protocol for intratracheal lipopolysaccharide (LPS) delivery via noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation. This method minimizes the trauma of the surgical procedure for the animal and accurately delivers LPS to the trachea and then to the lungs.

Farelerde Noninvaziv İntratrakeal Lipopolisakkarit Damlatma

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...

Subcutaneous Injection of Bacterial Antigen to Induce Systemic Inflammation in a Murine Model

Source: John, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62925">Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the induction of systemic inflammation in an anesthetized mouse. The injection of mycobacterial antigen-adjuvant depots triggers cytokine release and localized inflammation. Lymphatic vessels open, enabling immune cell entry into lymph nodes and activation of T cells, which release pro-inflammatory cytokines, leading to widespread inflammation.

Bir Murin Modelinde Sistemik İnflamasyonu İndüklemek için Deri Altı Bakteriyel Antijen Enjeksiyonu

Source: John, S. et al., Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis.&#160;J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünopatoloji

Konak-Patojen Etkileşim Modelleri

Induction of Cerebral Microhemorrhages in a Rat Model Using Lipopolysaccharide

Source: Li, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58423">Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of inducing blood-brain barrier (BBB) disruption and cerebral microhemorrhages in a rat model using lipopolysaccharide (LPS). It highlights the sequence of immune responses that lead to increased BBB permeability and subsequent brain tissue damage.

Lipopolisakkarit Kullanılarak Bir Sıçan Modelinde Serebral Mikrokanamaların İndüksiyonu

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Nörobilim

Neuropathology

Cerebrovascular Diseases

An Air Pouch Mouse Model for Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Exudate Collection

Source: Lu, Q., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60543">Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice.</a> J. Vis. Exp.&#160; (2020).
This video describes the procedure for generating an air pouch in the subcutaneous tissue of mice and collecting inflammatory exudates in response to lipopolysaccharide administration in vivo. This video also covers the analysis of the neutrophil infiltration in the air pouch.

Lipopolisakkarit ile İndüklenen İnflamatuar Eksüda Toplama için Bir Hava Torbası Fare Modeli

Source: Lu, Q., et al. Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice. J. Vis. Exp.&#160; (2020).
This video describes the procedure for ...