組織線維症は、慢性炎症や老化に応答して、臓器が時間の経過とともに失敗する主な方法です。実際、感染症や癌で死ななければ、年齢を重ねるにつれて臓器線維症で死亡する可能性が高いと主張します。残念ながら、人間の組織線維症を模倣するための素晴らしいマウスモデルはあまりありません。
だから私たちが開発したものはクローン病のマウスモデルであり、それは腸の線維症を引き起こし、ほとんど治療不可能なヒトの病気です。実際には, それを治療できる唯一の方法は、線維組織の外科的除去と腸の再ライゲーションを介して.私たちのモデルの利点は、それがすべてのマウス株に完全に浸透し、人間のクローン病を非常に密接に模倣し、線維症は本当に堅牢なモデルである1ヶ月以上持続することです。
この手順の最も困難な部分は、マウスの取り扱い、特に多くの実践特別認証が必要であるため、経口ギャバジです。初めてこの手順を実行する場合は、サルモネラ菌との作業には適切な安全対策と滅菌技術が必要であることを認識する必要があります。実験の前に、廃棄物や細菌の処分をすべて計画する必要があります。
この手順の視覚的なデモンストレーションは、特別な安全上の予防措置だけでなく、適切な滅菌技術を必要とするサルモネラ菌の取り扱いを含むので、非常に重要です。この手順を開始するには、1ミリリットル当たり100マイクログラムの濃度でストレプトマイシンを含むLB寒天を用いてプレートをセットします。滅菌接種ループを用いて、S型腸デルタ矢印aの凍結グリセロールストックを用いてプレートをストリークする。
摂氏37度で一晩インキュベート。ストリークプレートは、最大1週間摂氏4度で保存できます。感染の1日前に、ストレプトマイシン0.5グラムを2.5ミリリットルの水に溶解し、抗生物質を調製する。
フィルターはストレプトマイシン溶液を殺菌する。次に、球根先端22ゲージガベージ針に1ミリリットルの注射器を使用して、100マイクロリットルのストレプトマイシン溶液でマウスを経口的にガベージする。次に、ストレプトマイシンを含むLBスープを培養管に1ミリリットル当たり50マイクログラムの濃度で3ミリリットル添加する。
接種ループを使用して、単一コロニーでLBスープを接種する。200rpmで振ると摂氏37度で一晩好気的に培養します。感染の日に、滅菌PBSを有する一晩のサルモネラ培養物の2つの連続した1〜10の希釈を行い、最終的な感染用量を調製する。
これにより、約300万個のコロニー形成単位を含む100マイクロリットルの接種が生じます。この後、ミリリットルシリンジ付きの球根先端22ゲージガベージ針を使用して、調製したサルモネラ菌の100マイクロリットルで各マウスをガベージュします。まず、2つのミリリットルセーフロックラウンドボトムマイクロチューブをセットし、各チューブに滅菌PBSとオートクレーブステンレススチールビーズの1ミリリットルを追加します。
組織採取前にチューブの重量を事前に測定する。マウスを安楽死させた後、セカールと脾臓組織を切除し、個々の動物から組織を別々のチューブに収集することを確認します。各チューブの重量を量って組織の重さを決定します。
ミキサーミル装置を使用して、30ヘルツで組織を15分間均質化します。その後、900マイクロリットルのPBSを96ウェル2ミリリットルメガブロックの各ウェルに移します。ピペット100マイクロリットルの組織が第1ウェルに均質化し、よく混ぜる。
その後のウェルに100マイクロリットルを加えてシリアル希釈を行い、マイナスの6回目の希釈が得られるまで10を行う。ストレプトマイシンを含むLB寒天に三つ目で各希釈液のプレート10マイクロリットル。次に、平均コロニー形成単位を数え、テキストプロトコルに概説されているように、組織のグラム当たりのコロニー形成単位を決定する。
画像、調整、しきい値ツールを開きます。背景信号を除去するために、最小および最大の制限を調整します。希望のしきい値を設定したら、しきい値ツールを閉じて、[解析]、[測定の設定]、[面積]、[面積の割合]、[しきい値に制限]、[ラベルの表示]に移動します。
フリーハンド選択ツールまたはポリゴン選択ツールで組織選択を取得し、[解析]、[測定] の順にクリックして、コラーゲンの正のパーセント領域を測定します。次に、コラーゲン染色のための正の絶対領域を組織領域に正常化する。ストレプトマイシン治療に続いてS型腸筋の矢印による経口感染は、特に盲腸における強い腸炎症および線維症をもたらす。
典型的な病原体の負担は1億〜10億コロニー形成単位が感染した動物から1グラムのセカム1グラムにつき回復することができ、一方、10,000個のコロニー形成ユニットは通常脾臓の1グラムあたりに回収することができる。ピクロシリウス赤い染色されたcecalセクションにおける線維症の評価は、感染の21日後にピーク線維症を示し、病理の多くは感染後42日目までに解決される。この実験はセットアップに数日を要するため、材料の徹底的な準備が不可欠です。
LBプレートとサルモネラ菌およびストレプトマイシンの調製はすべて無菌で行われるべきである。実験の前に、実験者が動物のプロトコルと安全上の危険に精通していることを確認してください。コラーゲンの負担を評価する際に、実験者は、RNAシーケンシングなどの他の生物学的アッセイを行い、遺伝子発現プロファイルを評価するか、または細胞サブセットまたは組織ELISAを評価してサイトカインプロファイルを評価することを選択する。
だから、私たちのモデルは、あなたが腸の線維症を得るクローン病と呼ばれる人間の病気を模倣するのが特に得意であり、これは主に治療不可能であり、それを治療する唯一の方法は、腸のセクションを取り除き、それを一緒に縫い戻し、それが戻ってこないことを願っています。私たちのモデルは非常に堅牢であり、我々はすでに生来リンパ球細胞タイプ3、生アルファと呼ばれる転写因子、またはインターロイキン17を標的にして病気を改善し、線維症を予防することを示しました。私たちのモデルは、クローン病と腸線維症の病因に果たす要因を特定するのに特に優っており、炎症性腸疾患を軽減するために治療的に治療できる多くの標的を特定する道をすでに進んでいます。
我々のモデルは、すでに同じILC3またはαNIL17アクセスが他の線維性疾患で遊んでいる可能性があり、これらは乾癬、多発性硬化症、特発性肺線維症のようなものを含む。したがって、これらの同じ要因を標的にすることは、これらの疾患の線維症を軽減する可能性があります。変異型サルモネラストリームは毒性はありませんが、施設によって与えられた標準的なバイオハザード安全プロトコルに従うことが重要です。
また、ホルムアルデヒド蒸気は発がん性が知られているため、固定工程中にヒュームフードの後ろで作業することが重要です。
