この技術の主な利点は、刺激の前に、細胞が均等に分散され、次いでタンデム細胞接着で均等に刺激されるということです。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生である木村吾美です。この手順を開始するには、RPMI 1640の6ミリリットルを氷の上で摂氏4度に冷却したチューブに移します。
冷却された1ミリリットルのピペットチップを使用して、基質膜マトリックスの2ミリグラムを追加します。穏やかなピペットによってよく混ぜて、ミリリットル当たり0.33ミリグラムの濃度の基膜マトリックスにします。次に、ピペットを使用して、希釈した基膜マトリックスの2ミリリットルを6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに移す。
プレートを摂氏37度で60~90分間インキュベートします。この後、プレートを室温で最大3時間、使用できる状態になるまで保管してください。まず、使用培地を吸引し、ピペットを使用して各ウェルに0.5ミリモルEDTAの2ミリリットルを加え、6ウェルプレートで培養したhPCSを洗浄する。
次に、井戸からEDTAを吸引し、各ウェルに新鮮な0.5ミリモルEDTAの2ミリリットルを加えます。プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。この後、各ウェルからEDTAを吸引する。
室温で1ミリリットルのhPSC維持培地を加え、各ウェルに10マイクロモルY27632を加えます。ピペットは、プレート上に取り付けられた細胞を吹き飛ばし、塊状の細胞を単一の細胞に解離するために、優しく、しかし迅速に。ウェルあたり10マイクロモルY27632を補充し、ピペットによって混合する4ミリリットルのhPSC維持培地を含む50ミリリットル遠心分離チューブに細胞懸濁液を移す。
次に、15マイクロリットルのセル懸濁液を、チューブに15マイクロリットルのトリパンブルーを混ぜます。10マイクロリットルのピペットを使用して、希釈したセル懸濁液の10マイクロリットルを重複するセルカウントスライドに移します。自動セルカウンターを使用して、セル番号をカウントし、セルサスペンション内のセル密度を計算します。
使用する各ウェルの密度で50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を割り当てます。チューブをGの200倍、室温で5分間遠心する。この後、ピペットを使用して上清を吸引し、ウェルあたり1ミリリットルのステージ1A培地を使用して細胞を再中断します。
細胞懸濁液を軽くピペットし、さらに1ミリリットルのステージ1A培地をウェルごとに加えます。1000マイクロリットルピペットを用いて、以前に調製した細胞培養板のウェルから希釈された基質膜マトリックスを吸引する。すぐにチューブ内の懸濁液を穏やかにピペットし、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを移します。
プレートをアルミニウム箔で覆い、光から保護し、室温のクリーンベンチに10〜15分間置きます。その後、プレートを摂氏37度のインキュベーターに慎重に移し、24時間二酸化炭素と加湿雰囲気を加温します。まず、プレートを軽く振り、ピペットを使用して使用済みの培地を吸引します。
その後、各ウェルにDPBSの2ミリリットルを追加します。もう一度そっとプレートを振り、使用したDPBSを吸引します。ステージ1B培地の4ミリリットルを加え、摂氏37度に事前に温め、各井戸に加えます。
慎重に5%の二酸化炭素と加湿雰囲気で摂氏37度のインキュベーターにプレートを48時間培養します。この後、プレートを軽く振り、使用済みの培地を吸引します。各井戸にDPBSの2ミリリットルを追加します。
この吸引を繰り返し、DPBSを追加して1回繰り返します。プレートを軽く振り、使用済みのDPBSを吸引します。ステージ1B培地の4ミリリットルを加え、摂氏37度に事前に温め、各井戸に加えます。
慎重に培養器にプレートを移し、摂氏37度で5%の二酸化炭素と加湿雰囲気を24時間培養します。まず、プレートを軽く振り、使用済みの培地を吸引します。6ウェルプレートの各ウェルにDPBSの2ミリリットルを追加します。
その後、プレートを軽く振り、使用したDPBSを吸引します。ステージ2ミディアム4ミリリットルを加え、摂氏37度に事前に温め、各ウェルに加えます。慎重に5%の二酸化炭素と加湿雰囲気で摂氏37度のインキュベーターにプレートを4日間培養します。
プレートを軽く振り、使用済みの媒体を吸引します。各井戸にDPBSの2ミリリットルを追加します。DPPS をもう一度吸引し、追加するこのプロセスを繰り返します。
この後、プレートを軽く振り、使用したDPBSを吸引します。ステージ3ミディアム4ミリリットルを加え、摂氏37度に事前に温め、各井戸に加えます。慎重に3%の二酸化炭素と加湿雰囲気で摂氏37度のインキュベーターにプレートを3日間培養します。
本研究では、hIPを伝播させることは凝縮され、分化に適した均質な単層を形成する。未分化 hIPSE は、低細胞密度で解答し、単一細胞として再シードされます。1時間以内に、細胞はプレートに取り付けられ、突起を示し始める。
初日には、細胞が増殖し、表面積の80〜90%をカバーするようによく分布する。3日目および4日目に、細胞は石畳の外観として記述できる均質な単層シートを形成する。この時点で、ほとんどの細胞は未分化細胞のマーカーであるSOX2の発現を停止し、代わりに90%以上の大部分のSOX17陽性細胞で決定的な内胚葉マーカーSOX17を発現し、FOXA2を発現する。
その後、細胞は原始的なgoptupeマーカー、HNF1-βおよびHNF4-αを発現し始め、最終的には後部予知性膵臓前駆物質PDX1を90%以上で発現し、PDX1陽性細胞誘導は別のhIPSEライン、1231A3、およびhESEラインで再現可能である。ステージマーカーのMRNA発現のQRTPCR結果は免疫染色と一致しており、PDX1のMRNA発現はステージ3で明らかであり、その後実質的に増加する。未分化ESIPS細胞はコロニーとして増殖するため、個々の細胞は局所的に異なる状態にある。
このプロトコルは、選択された分化のために細胞を均等に刺激する方法を提供する。
