A principal vantagem dessa técnica é que antes da estimulação, as células são dispersas uniformemente e depois estimuladas uniformemente na adesão celular em conjunto. Demonstrando o procedimento será Azuma Kimura, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, transfira seis mililitros de RPMI 1640 em um tubo resfriado a quatro graus Celsius no gelo.
Usando pontas de pipeta de um mililitro resfriado, adicione dois miligramas de matriz de membrana do porão. Misture bem por tubulação suave para torná-lo uma matriz de membrana de porão com uma concentração de 0,33 miligramas por mililitro. Em seguida, use uma pipeta para transferir dois mililitros da matriz de membrana diluída do porão em cada poço de uma placa de cultura celular de seis poços.
Incubar a placa a 37 graus Celsius por 60 a 90 minutos. Depois disso, mantenha a placa em temperatura ambiente por até três horas, até estar pronta para uso. Primeiro, aspire o meio usado e use uma pipeta para adicionar dois mililitros de 0,5 mililitros EDTA a cada poço para lavar o hPCSs cultivado na placa de seis poços.
Em seguida, aspire o EDTA dos poços e adicione dois mililitros de 0,5 mililitros frescos EDTA a cada poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, aspire o EDTA de cada poço.
Adicione um mililitro de meio de manutenção hPSC à temperatura ambiente, suplementado com 10 micromolar Y27632 para cada poço. Pipeta suavemente, mas rapidamente para soprar as células presas na placa e dissociar quaisquer células desajeitadas em células únicas. Transfira a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo quatro mililitros de meio de manutenção hPSC suplementados com 10 micromolar Y27632 por poço e misture por pipetação.
Em seguida, misture 15 microliters de suspensão celular com 15 microliters de azul tripano no tubo. Use uma pipeta de 10 microliteres para transferir 10 microliters da suspensão celular diluída para lâminas de contagem de células em duplicata. Usando um contador celular automatizado, conte o número do celular e calcule a densidade celular na suspensão celular.
Aloque a suspensão celular em um tubo de 50 mililitros a uma densidade de um a um milhão e meio de células para cada poço a ser usado. Centrifugar o tubo a 200 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Depois disso, use uma pipeta para aspirar o supernasce e suspender as células usando um mililitro de meio estágio 1A por poço.
Pipete suavemente a suspensão celular e, em seguida, adicione outro mililitro do estágio 1A médio por poço. Usando uma pipeta de 1000 microliter, aspire a matriz de membrana diluída do porão dos poços da placa de cultura celular previamente preparada. Imediatamente pipete a suspensão no tubo suavemente e transfira dois mililitros em cada poço de uma placa de seis poços.
Cubra a placa com papel alumínio para protegê-la da luz e coloque a placa em um banco limpo à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Depois disso, transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e uma atmosfera umidificada por 24 horas. Primeiro, agite suavemente a placa e use uma pipeta para aspirar o meio usado.
Em seguida, adicione dois mililitros de DPBS a cada poço. Agite suavemente a placa novamente e aspire o DPBS usado. Adicione quatro mililitros de estágio 1B médio, pré-aquecido a 37 graus Celsius, a cada poço.
Transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e uma atmosfera umidificada para a cultura por 48 horas. Depois disso, agite suavemente a placa e aspire o meio usado. Adicione dois mililitros de DPBS a cada poço.
Repita esta aspiração e adição de DPBS uma vez adicional. Agite suavemente a placa e aspire o DPBS usado. Adicione quatro mililitros de estágio 1B médio, pré-aquecido a 37 graus Celsius, a cada poço.
Transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora, a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e uma atmosfera umidificada para a cultura por 24 horas. Primeiro, agite suavemente a placa e aspire o meio usado. Adicione dois mililitros de DPBS a cada poço da placa de seis poços.
Em seguida, agite suavemente a placa e aspire o DPBS usado. Adicione quatro mililitros do estágio dois médios, pré-aquecidos a 37 graus Celsius, a cada poço. Transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e uma atmosfera umidificada para a cultura por quatro dias.
Agite suavemente a placa e aspire o meio usado. Adicione dois mililitros de DPBS a cada poço. Repita este processo de aspiração e adição de DPPS mais uma vez.
Depois disso, agite suavemente a placa e aspire o DPBS usado. Adicione quatro mililitros do estágio três médio, pré-aquecido a 37 graus Celsius, a cada poço. Transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e uma atmosfera umidificada para a cultura por três dias.
Neste estudo, a propagação de hIPSEs é condensada e forma uma monocamada homogênea adequada para diferenciação. HIPSEs indiferenciados são dissociados e ressecidos como células únicas em baixas densidades celulares. Dentro de uma hora, as células são anexadas à placa e começam a mostrar saliência.
No primeiro dia, as células são proliferadas e bem distribuídas para cobrir 80 a 90% da área da superfície. Nos dias três e quatro, as células formam uma folha homogênea de monocamadas que pode ser descrita como uma aparência de paralelepípedo. Neste ponto, a maioria das células param de expressar SOX2, que é um marcador para células indiferenciadas, e em vez disso expressam um marcador de endoderme definitivo, SOX17, a mais de 90%A maioria das células positivas sox17 expressam FOXA2.
Em seguida, as células começam a expressar os marcadores primitivos goptupe, HNF1-beta e HNF4-alpha, e eventualmente expressam um marcador progenitor pancreático posterior, PDX1, a mais de 90%A indução celular PDX1-positiva é reproduzível em outra linha hIPSE, 1231A3, e uma linha hESE, KhES-3. Os resultados do QRTPCR da expressão MRNA dos marcadores de estágio são consistentes com a imunossuagem e a expressão MRNA do PDX1 é evidente na fase três e aumenta substancialmente depois. Uma vez que as células ESIPS indiferenciadas são cultivadas como colônias, as células individuais estão localmente em um estado diferente.
Este protocolo fornece uma maneira de estimular as células uniformemente para a diferenciação eleita.
