Основным преимуществом этой техники является то, что перед стимуляцией клетки равномерно рассеиваются, а затем равномерно стимулируются в тандеме клеточной адгезии. Демонстрацией процедуры будет Азума Кимура, аспирант нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, перенесите шесть миллилитров RPMI 1640 в трубку, охлаждаемую до четырех градусов по Цельсию на льду.
Используя охлажденные один миллилитр пипетки советы, добавить два миллиграмма мембранной матрицы подвала. Хорошо смешайте с помощью нежной трубы, чтобы сделать ее матрицей мембраны подвала с концентрацией 0,33 миллиграмма на миллилитр. Далее, используйте пипетку для передачи двух миллилитров разбавленной мембранной матрицы подвала в каждый колодец шести-хорошо пластины клеточной культуры.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 60-90 минут. После этого держите тарелку при комнатной температуре до трех часов, пока она не будет готова к использованию. Во-первых, аспирировать используемую среду и использовать пипетку, чтобы добавить два миллилитров 0,5 миллимолярной EDTA к каждому хорошо мыть hPCSs культурных в шесть хорошо пластины.
Затем, аспирировать EDTA из скважин и добавить два миллилитров свежих 0,5 миллимолярной EDTA к каждой скважине. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. После этого, аспирировать EDTA из каждой хорошо.
Добавьте один миллилитр среднего обслуживания hPSC при комнатной температуре, дополненный 10 микромолярной Y27632 к каждой хорошо. Pipette мягко, но быстро, чтобы сдуть прикрепленные клетки на пластине и разобщить любые слипшиеся клетки в одиночные клетки. Передача клеточной подвески в 50-миллилитровую центрифугу, содержащую четыре миллилитров среды обслуживания HPSC, дополненную 10 микромолярной Y27632 на колодец и перемешать с помощью труб.
Далее смешайте 15 микролитров клеточной подвески с 15 микролитров трипан-голубого цвета в трубке. Используйте 10 микролитровых пипеток для передачи 10 микролитров разбавленной клеточной подвески в слайды подсчета клеток в дубликате. Используя автоматизированный счетчик ячеек, подсчитайте номер ячейки и вычислите плотность ячейки в подвеске ячейки.
Выделите подвеску клетки в 50 миллилитровую трубку при плотности от одного до полутора миллионов клеток для каждого хорошо, который будет использоваться. Центрифуга трубки в 200 раз G и при комнатной температуре в течение пяти минут. После этого используйте пипетку, чтобы аспирировать супернатант и повторно приостановить клетки, используя один миллилитр стадии 1A среды на колодец.
Аккуратно пипетка клеточной подвески, а затем добавить еще один миллилитр стадии 1A среды на колодец. Используя 1000 микролитровую пипетку, аспирировать разбавленную мембранную матрицу подвала из колодцев ранее подготовленной пластины клеточной культуры. Немедленно пипетка подвески в трубке осторожно и передачи двух миллилитров в каждый колодец из шести хорошо пластины.
Обложка пластины с алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света и поместить пластину на чистую скамейку при комнатной температуре в течение 10 до 15 минут. После этого тщательно перенесите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом и увлажненной атмосферой в течение 24 часов. Во-первых, осторожно встряхните пластину и используйте пипетку, чтобы аспирировать используемую среду.
Затем добавьте два миллилитров DPBS к каждому хорошо. Аккуратно встряхните тарелку снова и аспирировать используемый DPBS. Добавьте четыре миллилитров среднего этапа 1B, предварительно разогретые до 37 градусов по Цельсию, к каждому хорошо.
Тщательно перенесите пластину в инкубатор при 37 градусах по Цельсию с 5%-ным углекислым газом и увлажненной атмосферой в культуру в течение 48 часов. После этого аккуратно встряхните тарелку и аспирировать использованную среду. Добавьте два миллилитров DPBS к каждому хорошо.
Повторите это стремление и добавление DPBS еще раз. Аккуратно встряхните тарелку и аспирировать используемый DPBS. Добавьте четыре миллилитров среднего этапа 1B, предварительно разогретые до 37 градусов по Цельсию, к каждому хорошо.
Тщательно перенесите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом и увлажненной атмосферой в культуру в течение 24 часов. Во-первых, осторожно встряхните пластину и аспирировать используемую среду. Добавьте два миллилитров DPBS к каждому колодец из шести хорошо пластины.
Затем аккуратно встряхните тарелку и аспирировать используемый DPBS. Добавьте четыре миллилитров второй стадии среды, предварительно разогретой до 37 градусов по Цельсию, к каждому хорошо. Тщательно перенесите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом и увлажненной атмосферой в культуру в течение четырех дней.
Аккуратно встряхните тарелку и оспирировать использованную среду. Добавьте два миллилитров DPBS к каждому хорошо. Повторите этот процесс аспирации и добавления DPPS еще раз.
После этого аккуратно встряхните тарелку и аспирировать использованный DPBS. Добавьте четыре миллилитров среднего этапа 3, предварительно разогретые до 37 градусов по Цельсию, к каждому хорошо. Тщательно перенесите пластину в инкубатор при 37 градусах по Цельсию с 5%-ным углекислым газом и увлажненной атмосферой в культуру в течение трех дней.
В этом исследовании, распространение hIPSEs конденсируются и образуют однородный монослой, который подходит для дифференциации. Недифференцированные hIPSEs разобщены и reseeded как одиночные клетки на низких плотностях клетки. В течение одного часа клетки прикрепляются к пластине и начинают проявлять выступ.
В первый день клетки размножаются и хорошо распределены, чтобы покрыть от 80 до 90% площади поверхности. В три и четыре дня клетки образуют однородный монослойный лист, который можно охарактеризовать как мощеный вид. На данный момент, большинство клеток перестают выражать SOX2, который является маркером для недифференцированных клеток, и вместо этого выразить окончательный маркер эндодерма, SOX17, на более чем 90%Большинство SOX17-положительных клеток выразить FOXA2.
Затем клетки начинают выражать примитивные маркеры гоптупе, HNF1-бета и HNF4-альфа, и в конечном итоге выражают задний маркер прогродителя поджелудочной железы, PDX1, на более чем 90%Положительная индукция клеток PDX1 воспроизводится в другой линии hIPSE, 1231A3, и линии HESE, KhES-3. Результаты MRNA выражения маркеров стадии MRNA согласуются с иммуностимулятором, и выражение MRNA PDX1 очевидно на этапе 3 и существенно увеличивается впоследствии. Так как недифференцированные клетки ESIPS выращиваются как колонии, отдельные клетки локально находятся в другом состоянии.
Этот протокол обеспечивает способ равномерного стимулирования клеток для избранной дифференциации.
