Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass vor der Stimulation, Zellen gleichmäßig verteilt und dann gleichmäßig in Tandem-Zell-Adhäsion stimuliert werden. Demonstriert wird das Verfahren von Azuma Kimura, einer Doktorandin unseres Labors. Um dieses Verfahren zu beginnen, übertragen Sie sechs Milliliter RPMI 1640 in eine auf vier Grad Celsius gekühlte Röhre auf Eis.
Mit gekühlten ein Milliliter Pipettenspitzen, fügen Sie zwei Milligramm Keller Membran Matrix. Mischen Sie gut durch sanfte Pipettierung, um es eine Kellermembran-Matrix mit einer Konzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter zu machen. Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um zwei Milliliter der verdünnten Kellermembranmatrix in jeden Brunnen einer Sechs-Well-Zell-Kulturplatte zu übertragen.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 60 bis 90 Minuten. Danach halten Sie die Platte bis zu drei Stunden bei Raumtemperatur, bis sie einsatzbereit ist. Zuerst aspirieren Sie das verwendete Medium und verwenden Sie eine Pipette, um zwei Milliliter 0,5 Millimolar EDTA zu jedem Brunnen hinzuzufügen, um die in der Sechs-Brunnen-Platte kultivierten hPCSs zu waschen.
Dann die EDTA aus den Brunnen aspirieren und zwei Milliliter frische 0,5 Millimolar EDTA zu jedem Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Danach, aspirieren Sie die EDTA aus jedem Brunnen.
Fügen Sie einen Milliliter hPSC Wartungsmedium bei Raumtemperatur, ergänzt mit 10 Mikromolar Y27632 zu jedem Brunnen. Pipette sanft, aber schnell, um die angeschlossenen Zellen auf der Platte abzublasen und alle verklumpten Zellen in einzelne Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit vier MilliliterhPS-Wartungsmedium, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y27632 pro Brunnen, und mischen Sie sie durch Pipetten.
Als nächstes mischen Sie 15 Mikroliter Zellsuspension mit 15 Mikroliter Trypanblau in der Röhre. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um 10 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension in doppelter Ausführung simperbar in zellzählige Dias zu übertragen. Zählen Sie mithilfe eines automatisierten Zellzählers die Zellenzahl, und berechnen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension.
Ordnen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr mit einer Dichte von ein bis eineinhalb Millionen Zellen für jeden zu verwendenden Brunnen zu. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Danach verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu aspirieren und die Zellen mit einem Milliliter Stufe 1A Medium pro Brunnen wieder aufzuhängen.
Die Zellsuspension vorsichtig pipette und dann einen weiteren Milliliter Stufe 1A Medium pro Brunnen hinzufügen. Mit einer 1000-Mikroliter-Pipette die verdünnte Kellermembranmatrix aus den Brunnen der zuvor vorbereiteten Zellkulturplatte ansaugen. Sofort die Aufhängung im Rohr sanft abpfeifen und zwei Milliliter in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte übertragen.
Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen, und legen Sie die Platte 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur auf eine saubere Bank. Danach die Platte vorsichtig 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in einen Inkubator geben. Zuerst schütteln Sie die Platte vorsichtig und verwenden Sie eine Pipette, um das verwendete Medium zu aspirieren.
Fügen Sie dann zwei Milliliter DPBS zu jedem Brunnen hinzu. Schütteln Sie die Platte vorsichtig wieder und aspirieren Sie die verwendete DPBS. Fügen Sie vier Milliliter Stufe 1B Medium, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zu jedem Brunnen.
Übertragen Sie die Platte vorsichtig 48 Stunden lang auf einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in kultur. Danach die Platte vorsichtig schütteln und das verwendete Medium ansaugen. Fügen Sie zwei Milliliter DPBS zu jedem Brunnen hinzu.
Wiederholen Sie diese Aspiration und Ergänzung von DPBS ein weiteres Mal. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und aspirieren Sie die verwendete DPBS. Fügen Sie vier Milliliter Stufe 1B Medium, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zu jedem Brunnen.
Übertragen Sie die Platte vorsichtig auf einen Inkubator, bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in kultur für 24 Stunden. Zuerst schütteln Sie die Platte vorsichtig und aspirieren Sie das verwendete Medium. Fügen Sie zwei Milliliter DPBS zu jedem Brunnen der Sechs-Well-Platte hinzu.
Dann schütteln Sie die Platte vorsichtig und aspirieren Sie die verwendeten DPBS. Fügen Sie vier Milliliter Stufe zwei Medium, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zu jedem Brunnen. Übertragen Sie die Platte vorsichtig vier Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in die Kultur.
Schütteln Sie die Platte vorsichtig und aspirieren Sie das verwendete Medium. Fügen Sie zwei Milliliter DPBS zu jedem Brunnen hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang des Ansamittentenunds und Hinzufügens von DPPS erneut.
Danach die Platte vorsichtig schütteln und die verwendete DPBS ansaugen. Fügen Sie vier Milliliter Stufe drei Medium, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zu jedem Brunnen. Übertragen Sie die Platte vorsichtig auf einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in kultur für drei Tage.
In dieser Studie werden propagierende hIPSEs kondensiert und bilden eine homogene Monoschicht, die für die Differenzierung geeignet ist. Undifferenzierte hIPSEs werden dissoziiert und als Einzelzellen bei geringer Zelldichte neu gesetzt. Innerhalb einer Stunde werden die Zellen an der Platte befestigt und beginnen, Vorsprung zu zeigen.
Am ersten Tag werden die Zellen vermehrt und gut verteilt, um 80 bis 90% der Oberfläche zu bedecken. An den Tagen drei und vier bilden die Zellen ein homogenes Monolayer-Blatt, das als Kopfsteinpflaster-Erscheinungsbild beschrieben werden kann. An diesem Punkt beenden die meisten Zellen die Exprimion von SOX2, einem Marker für undifferenzierte Zellen, und drücken stattdessen einen definitiven Endodermmarker, SOX17, bei mehr als 90% Ausdrücken von FOXA2 aus.
Dann beginnen die Zellen, die primitiven Goptupe-Marker, HNF1-beta und HNF4-alpha auszudrücken, und schließlich drücken sie einen hinteren Foregrate Pankreas-Vorläufermarker, PDX1, bei mehr als 90%Die PDX1-positive Zellinduktion ist reproduzierbar in einer anderen hIPSE-Linie, 1231A3, und einer hESE-Linie, KhES-3. DIE QRTPCR-Ergebnisse der MRNA-Expression von Stufenmarkern stimmen mit der Immunfärbung überein und die MRNA-Expression von PDX1 ist auf Stufe drei offensichtlich und nimmt danach erheblich zu. Da undifferenzierte ESIPS-Zellen als Kolonien angebaut werden, befinden sich einzelne Zellen lokal in einem anderen Zustand.
Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, Zellen gleichmäßig für die gewählte Differenzierung zu stimulieren.
