我々 は役に立つ議論のコーラのラボのメンバーと原稿の重要なレビューをありがとうございます。本研究は、NIH/NIEHS R44ES023521-02 でサポートされていたし、CIRM DISC2-10110 博士コーラに付与します。

1. Id1 ウイルス作製と感染症
<ol><li>PCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR、pMD2.G、pCMVDR8.74 の共同株 Id1 過剰発現レンチ ウイルスを生成 (Addgene: プラスミッド #107735) HEK293T 細胞に。ウイルス粒子を収集、濾液、上清から浄化、北村らのように-80 ° C で保存(2003 年)19します。 また、pCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR をレンチ製造ベンダーに送信することによって商業 Id1 レンチ ウイルスを生産。 注意: は、レンチ ウイルスに関する安全規制および標準的な操作のプロトコルに従ってください。 注: 重要: 最適なウイルス価は少なくとも 10 をする必要があります 108 9 Transducing 単位/ml (TU/mL)。</li>
	<li>感染前にコートのコーティング剤、Engelbreth ・ ホルム群マウス肉腫細胞 (材料の表を参照) によって分泌されるゼラチンのタンパク質混合物通常の 50 μ l で 96 well プレートの 1 つの井戸を実行します。</li>
	<li>1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA を追加することによって 6 ウェル プレートで育った多能性幹細胞の 1 つの井戸を切り離して考えます。 注: 解離時間は 3-10 分から異なります。プレートの底から細胞の 80% 以上を取り外したら、次のステップに進みます。</li>
	<li>滅菌ピペットで細胞を懸濁液を 15 mL プラスチック遠心管にまとめます。</li>
	<li>5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。</li>
	<li>遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。</li>
	<li>上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。</li>
	<li>幹細胞培地 1 ml を再停止します。</li>
	<li>ベンダーの指示に従って自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>あたり 20,000 実行可能な細胞は幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤の 50 μ L でよく (96 ウェル プレート) をコーティング (表 1 と 2を参照)。</li>
	<li>24 h 後セル添付ファイルを監視し、2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 ng/mL hexadimethrine ブロマイドを添加した 100 μ l 幹細胞メディアでメディアを交換して (表 1および2を参照)、レンチ ウイルス感染前に 1 h。 注: の細胞は、プレートの底にしっかりと固定する必要があります。</li>
	<li>氷上 Id1 レンチ ウイルスを解凍します。</li>
	<li>3 μ L/ウェル精製レンチ ウイルスを追加 (ウイルス価は 10 の間にする必要があります8 ~ 109 TU/mL)、し、プレートを携帯文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO220% O2) に転送。</li>
	<li>24 時間後のウイルス感染、感染した細胞に新鮮な幹細胞培地の 100 μ L を追加。</li>
	<li>48 時間後にレンチ ウイルス感染、新鮮な幹細胞培地 1 μ G/ml ピューロマイシンの 200 μ L でメディアを含む置換ウイルス。</li>
	<li>幹細胞培地 1 μ G/ml ピューロマイシンの 200 μ L で毎日メディアを更新します。</li>
	<li>文化が 80% の confluency に達したら、Ca2 +と Mg2 + + 0.5 mM EDTA なし 200 μ L の PBS (96 ウェル プレートのウェル 1 個) を使用してセルを切り離して考えます。</li>
	<li>細胞懸濁液を遠心管にまとめます。</li>
	<li>5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。</li>
	<li>遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。</li>
	<li>上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。</li>
	<li>再幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 1 ml を中断します。</li>
	<li>12 ウェル プレートのコーティング (1 mL) のすべてのセルに転送します。</li>
	<li>24 h 後幹細胞培地の 1 mL でよくと置換メディアに付着のためのモニターは 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 ng/mL hexadimethrine 臭化物、伝達の前に 1 つの h を補充しました。</li>
	<li>氷上 Id1 レンチ ウイルスを解凍します。</li>
	<li>ウェル (12 ウェル プレート) あたり純化ウイルスの 5 μ L を追加します。</li>
	<li>24 h 後レンチ ウイルス感染、1 ml の新鮮な幹細胞培地 3 μ G/ml ピューロマイシンのメディアを含む置換ウイルス。</li>
	<li>48 h レンチ ウイルス感染ウイルス含有 1 ml の新鮮な幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンのメディアを交換してください。</li>
	<li>文化が 80% の confluency に達したら、500 μ L の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA (12 ウェル プレートのウェル 1 個) を使用してセルを切り離して考えます。</li>
	<li>半分を転送 (250 μ L) コーティング剤の 1 つの井戸に細胞懸濁液のコーティング幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 2 mL を含む 6 ウェル プレート。</li>
	<li>その他の半分を使用 (250 μ L) RNA の抽出およびレンチウイルスベクターを介したId1表現のレベル、コーラらのようにを定めるために qRT PCR のサンプルの(2012 年)4。 注: 重要な: Id1 mRNA 発現レベルよりも低い場合 (qRT PCR のプライマーの表 3を参照) GAPDH発現レベルの 0.005 倍、Id1 表現のレベルを超過するまで、上記のように感染プロセスを繰り返す、しきい値。</li>
</ol>2. hPSCsId1メンテナンス
<ol><li>文化の hPSCsId1コーティング 6 ウェル プレートで、幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンの井戸あたり 3 mL で育ちます。</li>
	<li>HPSCsId1が 80% の confluency に達したら、通路のベンダーのガイドラインに従う酵素無料解離試薬を用いた集計値 (1:6 分割比) と細胞、幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンの井戸あたり 3 mL で育ちます。</li>
</ol>3. 差別化の hPSCsId1の準備
<ol><li>コーティング剤の井戸あたり 500 μ L で 12 ウェル プレートをコートします。</li>
	<li>5-10 分チェック解離過程、毎分Id1に達する 90% の confluency hPSCs 1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +とよく当り 0.5 mM EDTA を追加することによって細胞を分離するとき、80% の細胞をプレートから解離する一度、次の手順に進みます。</li>
	<li>細胞懸濁液を遠心管にまとめます。</li>
	<li>5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。</li>
	<li>遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。</li>
	<li>上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。</li>
	<li>再幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 2 ml を中断します。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>井戸幹細胞培地培養孵卵器に 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 μ G/ml ピューロマイシン転送プレートと補足の 1 mL あたりプレート 300,000 セルです。</li>
	<li>幹細胞培 6 μ G/ml ピューロマイシン文化まで 90% の confluency 地 2 mL を毎日メディアを更新します。この時点で、心臓の分化を開始 (次の手順)。</li>
</ol>4. hPSCsId1の最初のハート フィールドのような心臓前駆細胞 (CPs について L) への分化
<ol><li>12 ウェル プレート形式の幹細胞培地を 1.5 mL の誘導培 (表 1) に置き換えることによって開始分化 (0 日目) はアクチビンと補足 (100 ng/mL) (表 2の推奨されるボリュームとアクチビン A の濃度を参照してください。異なるプレート フォーマット)。</li>
	<li>(24 h 分化開始後) 1 日に 2 ml (/12 ウェル プレートのウェル) アクチビン A せず誘導メディアのメディアを交換します。</li>
	<li>3 日目、アクチビン A なし (/12 ウェル プレートのウェル) 誘導メディアの 2 mL でメディアを置き換えます。</li>
	<li>5 日目、凍結保存用について L CPs を収集 (次の手順)。 注: 重要な: 凍結をお勧めこの時点で心臓前駆細胞の後心筋細胞生産とバイオバンク大きなバッチから世代を切り離すことが可能。メモ、または、5 日目について L CPs は、分化を続行し、手順 5.1-5.5 passFHF L の CPs を参照してくださいステップ 6.5 に差別化のために進みますたてコーティング プレートに渡すことができます。</li>
</ol>5. 急性肝不全-L CPs の凍結保存
<ol><li>5 日目を含む井戸からすべてのメディアを吸引について L CPs とすぐに暖かい (37 ° C) 1 x の酵素を含む解離試薬 1 mL を追加 (材料の表を参照してください)。組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。</li>
	<li>1 分後プレートをインキュベーターを左右に振る。</li>
	<li>2 分 (合計時間) 後インキュベーターからプレートを削除し、10 %fbs メディアの 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>優しくピペットでのセルを上下プレートから細胞の剥離を容易にするために 5 mL をピペットで移しなさい。</li>
	<li>3 分間 200 × g で遠心分離遠心チューブ、ペレット細胞を細胞懸濁液を収集します。</li>
	<li>再凍結保存試薬の 2 mL の細胞ペレットを中断します。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>凍結保存試薬を追加 (材料の表を参照) を目的濃度 (通常 5-10 x 106セル/mL) で細胞を凍結保存するための十分なボリュームで。</li>
	<li>凍結保存バイアルにセルを転送し冷却装置 (1 ° C/分) でバイアルに、一晩-80 ° C のフリーザーで冷却装置を置きます。</li>
	<li>24 h 後に、長期保存用液体窒素に凍結バイアルを転送します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>6. 急性肝不全-L CP のような心室心筋細胞分化
<ol><li>ドライアイスの容器に液体窒素から 5 日目凍結について L CPs バイアルを転送します。</li>
	<li>細胞懸濁液は、完全に解凍するまで 2 〜 3 分の 37 ° C の水浴のバイアルを配置します。 注: 重要な: 解凍処理は一刻を争う。時間の過剰な量の細胞凍結保存メディアを公開する (すなわち、 10 分) 細胞生存率が低下します。</li>
	<li>解凍バイアル数に応じて、15 または 50 の mL の遠心管にセルを転送します。</li>
	<li>滴 (5 滴 30 秒ごと) に予め温めておいた (37 ° C) 心原性メディア (表 1) 携帯ソリューションを調剤します。1:3 凍結保存メディアまでこのプロセスを続行: 心原性メディア比に達する。この時点で、1:10 まで心原性メディアの添加率を高める凍結保存メディア: 心原性メディア比に達する。 注: 重要な: 急速な浸透圧の変化が、解凍処理中に細胞死を増加したがって、心原性メディアの滴下前述のよう強くお勧めします。</li>
	<li>細胞懸濁液とペレットを遠心分離機、遠心分離 (3 分 200 g x) によって。</li>
	<li>上清を除去し、やさしく細胞ペレットを取り除くため遠心管をフリックします。</li>
	<li>再 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤を添加した心原性のメディアでセルを中断します。 注: セル実行可能性は、雪解けから解凍して、一般に変わることができる、> 65% 生存率が良いめっき効率を予測します。</li>
	<li>希釈濃縮細胞懸濁液めっき用目的のセルの濃度を取得する 2 μ M ・ ロー/ロック経路の阻害剤を添加した心原性のメディア (異なるプレート形式の表 2を参照)。 注: 重要な: 細胞はまばらすぎる播かれる場合心筋分化効率が低下することに注意してください。</li>
	<li>プレート上の種子のセル。</li>
	<li>組織文化のインキュベーターに転送する前に 20 分のティッシュ文化フード プレートをしてください。</li>
	<li>6 日目に分化、細胞接着を監視します。 注: 心臓前駆細胞は分化の 5 日目に凍結しました。細胞を解凍後 24 h は分化の 6 日目になります。 注: 浮動 (死んだ) 細胞の存在は、一般的です。</li>
	<li>7 日にメディアの 50% を吸引し、新鮮な心原性メディアの等しい量に置き換えます。 注: 心原性メディアにロー/ロック経路阻害剤の追加はこのポイントの後必要ありません。</li>
	<li>その他毎日心原性メディアでメディアの 50% を置き換えます。</li>
	<li>11 日目と 13 日目の間に自発的な鼓動するメモが表示されます。</li>
	<li>15 日に DAPI (核染色) と ACTC1 を用いた蛍光抗体法による心筋分化効率の定量化 (パン心臓マーカー)。</li>
</ol>7. 渡す、のような心室心筋細胞のメンテナンス
注: 日 14-16 のような心室心筋細胞を自発的に契約の単分子膜を得られなければならない.この時点で、切り離して、再度文化を均質化し、セルがプレートからデタッチすることを防ぐために心筋細胞をプレートすることをお勧めします。
<ol><li>井戸からすべてのメディアを吸引し、迅速に予め温めておいた (37 ° C) 1 x の酵素を含む解離試薬 1 mL を追加します。 メモ: 酵素を含む解離試薬ボリューム x 1 プレート形式によって異なりますが完全によく画面の下部をカバーする必要があります。</li>
	<li>組織文化のインキュベーターにプレートを転送します。</li>
	<li>軽く板側に剥離プロセスを加速するインキュベーター内 2 分ごとを振る。</li>
	<li>5-15 分後にプレートの底から細胞の 80% 〜 100% を取り外したら、インキュベーターからプレートを取り外し、10 %fbs メディアの等しい量を追加することによって酵素含有解離試薬活性 x 1 を阻害します。 注: このプロセスの 1 x 酵素を含む解離でインキュベーション時間もバッチごとに変わります。</li>
	<li>細胞懸濁液を遠心管に収集します。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターを使用してカウントのピペットで移しなさい細胞と細胞懸濁液を混ぜます。</li>
	<li>目的のセルの濃度に細胞懸濁液を希釈 (異なるプレート形式の表 2を参照) 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤を添加した保守メディアで。</li>
	<li>プレート上に心筋細胞を播種後セルを均等にして細胞は、組織文化のインキュベーターにプレートを転送する前に 10-20 分を添付します。</li>
	<li>24 h 再メッキ後は、細胞接着と回復を監視します。 注: 浮動 (死んだ) 細胞の存在は、一般的です。48-72 時間後再メッキ、心筋細胞は自発的な収縮を再開しなければなりません。</li>
	<li>心筋細胞培養を維持するために保守メディアでその後の実験のような心室の心筋細胞が使用されるまで、その他の毎日メディアの 50% を置き換えます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510, 273-277 (2014).</li><li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+cardiomyocytes+reveal+abnormal+TGF-beta+signalling+in+left+ventricular+non-compaction+cardiomyopathy.">iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy.</a> Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li><li>Colas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+microRNA+screening+identifies+let-7+and+mir-18+as+regulators+of+germ+layer+formation+during+early+embryogenesis.">Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis.</a> Genes &amp; development. 26, 2567-2579 (2012).</li><li>Cunningham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+genes+are+essential+for+early+heart+formation.">Id genes are essential for early heart formation.</a> Genes &amp; development. , (2017).</li><li>McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. 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著者が明らかに何もありません。

正常な分化、密接に上記の指示に従うことを確認してください。さらに、ここで我々 は強く分化の結果に影響を与える重要なパラメーターを強調表示します。分化を開始する前に次の 3 つの形態学的パラメーターを観察する必要があります: hPSCsId1、高細胞密度および高い合流の幹の形態 (> 90%) 0 日目で文化。その点で最適な分化条件が単一セルとして解離メッキの hPSCsId1に?...

ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の大規模な生産-派生心臓前駆細胞と心筋細胞は幹細胞ベースの治療1、病モデル2,3との迅速な評価の前提新規経路心筋分化4,の5,6と生理7,の8を規制します。,15が非常に効率的な前述した研究9,10、11,12,13,14の数hPSCs から心筋分化誘導方法、どれもが対処にもかかわらず左違いの重要な分子の同定の結果心筋細胞の心臓領域の原点 (最初ハート フィールド) と右の (2 番目のハート フィールド)心室心筋細胞16と心フィールド固有の先天性心疾患の存在すなわち、左心低形成症候群17または不整脈原性右室異形成症18。したがって、心臓前駆細胞の生成と定義されたハート フィールド hPSCs 由来の心筋細胞は治療としての妥当性を高めるために必要になっていると疾患モデリング ツール。
このプロトコルは、Id1、最近同定された5最初ハート フィールドを指定するキュー アクチビン A との組み合わせでは必要であり、hPSCs での心臓を開始するための十分な学会の構成に依存します。特に、カニンガムら(2017)5を示して、Id1 誘起前駆細胞具体的表現 (HCN4、 TBX5) 最初のハート フィールドが 2 番目のないハート フィールド マーカー (SIX2、 ISL1) 心筋分化を遂げる。さらに、著者はまたしたトランスジェニック マウス胚の遺伝子 (Id1-4)、家族Idを欠けている開発最初心臓フィールド心臓前駆細胞より内側と後部の心臓前駆細胞 (間を形成することがなく、表示します。2 つ目のハート フィールド) はそれにより Id 蛋白質初めてハート フィールドの心臓生体内での開始に必須を示唆、まだ形成できます。便利な Id1 誘起前駆細胞凍結保存することができ、自発的に心室固有マーカー (IRX4, MYL2) 式を含め、心室のような特性を表示する心筋細胞に分化し、ような心室の活動電位。
ここで Id1 過剰 hPSCs から最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するシンプルかつスケーラブルな手法について述べる。このプロトコルの重要な機能は、便利な冷凍保存の手順を使用してその後心筋細胞生産から心臓前駆細胞生成を切り離すことです。要約すると、このプロトコルは (1) Id1 過剰発現の hPSCs を生成する、(2) hPSCs から急性肝不全-L 心臓前駆細胞を生成する、(3) 結果前駆細胞の凍結、(4) 再開について L 心臓前駆細胞の分化に必要な手順の詳細し、を生成高濃縮 (> 70-90%) のような心室心筋細胞を打ちます。

<table><tbody><tr><td>ACTC1 antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Hu Recom Activin A</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement w/o - insulin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement w/o - vitamin A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>CDH5 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7930</td><td>Cryopreservation reagent</td></tr><tr><td>DMEM high Glucose</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/ Ca &amp;amp; Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt membrane potential kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td>For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Coating reagent</td></tr><tr><td>mTeSR1 media kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca &amp;amp; Mg</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycin&amp;nbsp;</td><td>Acros</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td>Enzyme-free dissociation reagent</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TAGLN antibody</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72254</td><td>RHO/ROCK pathway inhibitor</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605 -010</td><td>1X enzyme-containing dissociation reagent</td></tr><tr><td>Tyrodes solution mix packets&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td><td>(For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)</td></tr></tbody></table>

generation of first heart field-like cardiac progenitors and ventricular-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells

機能的ひと多能性幹細胞由来心筋前駆細胞の大量および定義された中心領域の原点の心筋細胞の生成は、セルベースの心臓治療法や疾患モデリングの前提です。我々 は最近、Id 遺伝子が必要と脊椎動物の開発中に最初の心臓フィールドの前駆細胞を指定するのに十分なことを示しています。この分化プロトコルは、これらの知見を活用し、最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 前駆細胞を生成する強力な指定する手がかりとしてアクチビン A との組み合わせで Id1 の過剰発現を使用します。重要なは、結果前駆細胞のような心室心筋細胞 (〜 70-90%) を効率的に区別します。ここで我々 は 1) Id1 過剰発現 hPSCs を生成し、2) 前駆細胞について-L cryopreservable のような心室心筋細胞のスケーラブルな量を区別するための詳細な方法をについて説明します。

HPSCs の生成Id1ライン hPSCs は、Id1 過剰発現 (図 1A) を仲介するレンチ ウイルスに感染しています。HPSCId1が生成される遺伝子発現は qRT PCR (図 1B) によって定量化されます。GAPDHの 0.005 倍を超えるレベルでId1 mRNA を表現する hPSCId...

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Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1 を高発現、単純な組み合わせを使用して、ひと多能性幹細胞から最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するスケーラブルな方法をについて説明します。

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

generation-first-heart-field-like-cardiac-progenitors-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K ビュー.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1 を高発現、単純な組み合わせを使用して、ひと多能性幹細胞から最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するスケーラブルな方法をについて説明します。

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

発生生物学

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) are increasingly recognized as having great value for modeling cardiovascular diseases in humans, especially arrhythmia syndromes. They have also demonstrated relevance as in vitro systems for predicting drug responses, which makes them potentially useful for drug-screening and discovery, safety pharmacology and perhaps eventually for personalized medicine. This would be facilitated by deriving hPSC-CMs from patients or susceptible individuals as hiPSCs. For all applications, however, precise measurement and analysis of hPSC-CM electrical properties are essential for identifying changes due to cardiac ion channel mutations and/or drugs that target ion channels and can cause sudden cardiac death. Compared with manual patch-clamp, multi-electrode array (MEA) devices offer the advantage of allowing medium- to high-throughput recordings. This protocol describes how to dissociate 2D cell cultures of hPSC-CMs to small aggregates and single cells and plate them on MEAs to record their spontaneous electrical activity as field potential. Methods for analyzing the recorded data to extract specific parameters, such as the QT and the RR intervals, are also described here. Changes in these parameters would be expected in hPSC-CMs carrying mutations responsible for cardiac arrhythmias and following addition of specific drugs, allowing detection of those that carry a cardiotoxic risk.

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Electrophysiological characterization of cardiomyocytes derived from human Pluripotent Stem Cells (hPSC-CMs) is crucial for cardiac disease modeling and for determining drug responses. This protocol provides the necessary information to dissociate and plate hPSC-CMs on multi-electrode arrays, measure their field potential, and a method for analyzing QT and RR intervals.

多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in vitro. Developing more efficient organ-like platforms that can model complex in vivo phenotypes, such as organoids and organs-on-a-chip, will enhance the ability to study human heart development and disease. This paper describes a protocol to generate highly complex human heart organoids (hHOs) by self-organization using human pluripotent stem cells and stepwise developmental pathway activation using small molecule inhibitors. Embryoid bodies (EBs) are generated in a 96-well plate with round-bottom, ultra-low attachment wells, facilitating suspension culture of individualized constructs.
The EBs undergo differentiation into hHOs by a three-step Wnt signaling modulation strategy, which involves an initial Wnt pathway activation to induce cardiac mesoderm fate, a second step of Wnt inhibition to create definitive cardiac lineages, and a third Wnt activation step to induce proepicardial organ tissues. These steps, carried out in a 96-well format, are highly efficient, reproducible, and produce large amounts of organoids per run. Analysis by immunofluorescence imaging from day 3 to day 11 of differentiation reveals first and second heart field specifications and highly complex tissues inside hHOs at day 15, including myocardial tissue with regions of atrial and ventricular cardiomyocytes, as well as internal chambers lined with endocardial tissue. The organoids also exhibit an intricate vascular network throughout the structure and an external lining of epicardial tissue. From a functional standpoint, hHOs beat robustly and present normal calcium activity as determined by Fluo-4 live imaging. Overall, this protocol constitutes a solid platform for in vitro studies in human organ-like cardiac tissues.

Here, we describe a protocol to create developmentally relevant human heart organoids (hHOs) efficiently using human pluripotent stem cells by self-organization. The protocol relies on the sequential activation of developmental cues and produces highly complex, functionally relevant human heart tissues.

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

生化学

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. Cardiac differentiation from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is modulated by defined signaling pathways that are essential for embryonic heart development. Numerous cardiac differentiation methods on 2-D and 3-D platforms have been developed with various efficiencies and cardiomyocyte yield. This has puzzled investigators outside the field as the variety of these methods can be difficult to follow. Here we present a comprehensive protocol that elaborates robust generation and expansion of patient-specific cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We first describe a high-efficiency iPSC reprogramming protocol from a patient&#39;s blood sample using non-integration Sendai virus vectors. We then detail a small molecule-mediated monolayer differentiation method that can robustly produce beating cardiomyocytes from most human iPSC lines. In addition, a scalable cardiomyocyte expansion protocol is introduced using a small molecule (CHIR99021) that could rapidly expand patient-derived cardiomyocytes for industrial- and clinical-grade applications. At the end, detailed protocols for molecular identification and electrophysiological characterization of these iPSC-CMs are depicted. We expect this protocol to be pragmatic for beginners with limited knowledge on cardiovascular development and stem cell biology.

Here, we present a protocol to robustly generate and expand human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells.

患者末梢血単核細胞からのヒト心筋細胞の発生と拡大

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

生物学

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

生物工学

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) handling and signaling pathways as well as high-throughput drug screening and toxicity assays. Herein, we provide a detailed description of the methodologies used to generate high-quality iPSC-CMs that can consistently reproduce molecular and functional characteristics across different cell lines. Additionally, a method is described to reliably assess their functional characterization through the evaluation of Ca2+ handling properties. Low oxygen (O2) conditions, lactate selection, and prolonged time in culture produce high-purity and high-quality ventricular-like cardiomyocytes. Similar to isolated adult rat cardiomyocytes (ARCMs), 3-month-old iPSC-CMs exhibit higher Ca2+ amplitude, faster rate of Ca2+ reuptake (decay-tau), and a positive lusitropic response to &#946;-adrenergic stimulation compared to day 30 iPSC-CMs. The strategy is technically simple, cost-effective, and reproducible. It provides a robust platform to model cardiac disease and for the large-scale drug screening to target Ca2+ handling proteins.

Here we describe and validate a method to consistently generate robust human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and characterize their function. These techniques may help in developing mechanistic insight into signaling pathways, provide a platform for large-scale drug screening, and reliably model cardiac diseases.

カルシウム処理特性評価のための心室様HiPSC由来心筋細胞と高品質細胞製剤の生成

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...