このプロトコルは、細胞株を越えて再現可能な、簡単な費用対効果の高い方法で発達中の人間の心臓に近い複雑な3D構造を作成することを可能にします。これは、チャンバーや血管ネットワークを含む心臓のすべての細胞タイプを生じさせる分化の3つのステップを持つ単一のプロトコルで構成されています。この技術は、広範囲のヒト心血管疾患をモデル化し、効果的な薬理学的治療法をスクリーニングすることを可能にする。
その設計の高いスループットの性質のおかげで。この方法は、発達中のヒト心臓およびそれに一般的に関連する疾患を調査するのに有用である。そのうちの一つは先天性心不全です。
このプロトコルには、基本的な細胞培養能力が必要です。オルガノイドの取り扱いだけでなく、気配りや繊細なピペットをお勧めします。最初に、分化の2日前に胚体またはEJBを作成します。
DBPS を使用してサブコンフルエント HPCs を少なくとも 10 秒間洗浄します。その後、DPBSを吸引します。室温ACUTAを1ミリリットル加え、顕微鏡下でチェックしながら、剥離を誘発するために3〜5分間、毎分約5回プレートを軽くタップします。
その後、PSC培地とチアス・アビンまたはティアスを1ミリリットル加えて反応を止めます。ウェル内のメディアを上下にピペットし、2〜3回、単一の細胞懸濁液を生成し、細胞を収集する。その後、単一細胞懸濁液を遠心分離管に移し、上清を吸引し、PSC培地とチアスの1ミリリットルで細胞を再使用して300倍G.吸引して5分間回転させます。
DPBSで細胞を希釈します。細胞カウンターまたはヘモシストメーターを使用して細胞を数え、PSC培地中の細胞をチアスで1ミリリットル当たり100,000細胞の濃度に希釈する。希釈した細胞の100マイクロリットルを、丸底超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに懸濁液を加える。
プレートを100倍Gで3分間遠心し、摂氏37度と炭酸ガス5%で24時間インキュベートする。24時間後、慎重に各井戸から媒体の50マイクロリットルを除去し、新鮮なPSC媒体の200コアのごみを追加し、井戸あたり250マイクロリットルの体積のために摂氏37度に暖めます。セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で24時間インキュベートします。
各ウェルの片側から166マイクロリットルまたは2分の2の培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントを含むRPMI 1640の166マイクロリットル、6マイクロモルモルチア990211、骨モルモジェネティックタンパク質4の1ミリリットル当たり0.875ナノグラム、ActivA.Incubateあたり1ミリリットル当たり1.5ナノグラムを37°Cで24時間取り出します。24時間後、各ウェルの片側から166マイクロリットルの培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で24時間インキュベートします。
2日目に心臓中皮の仕様を誘導するには、各ウェルから166マイクロリットルの培地を取り除き、166マイクロリットルのRPMI 1640を加え、インスリンフリーB27サプリメントと3つのマイクロモルWnt-C59を含み、48時間インキュベートを続けます。4日目には、各井戸から166マイクロリットルの培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加し、さらに48時間インキュベートします。6日目には、各井戸から166マイクロリットルの培地を取り除き、B27サプリメントでRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。
これとすべてのその後のメディアの変更のために、 インスリンで B27 サプリメントを使用して、さらに 24 時間インキュベート.7日目に、細胞培養は、プロ心筋分化の準備ができている。各井戸から166マイクロリットルの培地を取り出し、B27サプリメントと3つのマイクロモルチア99021を含む新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。
その後、1時間インキュベートで、インキュベーターからプレートを1時間取り出した後、各ウェルの片側から166マイクロリットルの培地を取り除き、B27サプリメントを含む新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加し、さらに48時間インキュベートを続けます。収集まで48時間ごとにこのプロセスを繰り返します。オルガノイドは15日目に分析と実験の準備ができているオルガノイド全体を移送し、P200ピペットの先端を切り取り、直径約2〜3ミリメートルの開口部から5〜10ミリメートル。
ピペットプランジャーを押し、オルガノイドと一緒に丸底ウェルに垂直にチップを挿入します。オルガノイドを収集し、ターゲット先に転送するのに十分な媒体の約100〜200マイクロリットルを取ります。分化 EBS が黒球形の質量として出現する前に、分化プロセスは、ちょうど 24 時間の Wnt 経路活性化と成長因子の追加でゼロ日目に開始されます。
さらに2日目にWnt C59を編集すると、オルガノイドは約200マイクロメートルから最大1ミリメートルに拡大されます。ヒト心臓オルガノイドは早ければ6日目に鼓動を始め、オルガノイドの100%は10日目までに目に見える拍動を示した。7日目のオルガノイドの高倍率画像は、ほとんどの手1発現細胞が起源の心筋細胞であり、手2が第2のハートフィールド、前駆細胞からの非筋細胞であることを明らかにした。
手1と手の両方のRNA転写物は、RNAシーケンシングデータで3日目以降に発現した。FHFマーカーは3日目と11日目に高く発現し、SFマーカーは13日目以降より高く発現した。免疫蛍光染色は、ヒトの心臓を構成する様々なヒト心臓細胞型系統の存在を明らかにした。
心筋および心外膜組織、心筋細胞、内皮細胞、および心臓線維芽細胞など。上記の細胞系統を発現するマーカーは、RNA SAC遺伝子発現プロファイルにおいても観察された。オルガノイドの個々の細胞の生きたカルシウムイメージングは、オルガノイドの電気生理学的機能を測定するために使用された。
Fluo-4蛍光強度は、定期的な作用電位を明らかにする細胞からのカルシウム入り口出口のために時間の経過とともに変化した。オルガノイドの高倍率領域にわたってカルシウム強度を示すヒートマップは、カルシウム過渡量および個々の細胞による強度の増加を示す。このプロトコルを試みるとき、EBおよびそれに続くオルガノイドはプレートの底に取り付けられていないことを覚えておいてください、そして我々は注意深い媒体の変更を必要とする媒体の他に取り外しと動き回る。
オルガノイドは、成熟技術に導入された長期間培養したり、機械的または電気的コンディショニングなどの外部刺激にさらされたり、毒素などのストレッサーにさらされたりすることさえできます。この技術は、研究ではアクセスできないヒト胎児心臓発達の段階へのアクセスを可能にし、心臓の発達と病因に関する新しい洞察への道を開く。
