Name: a neurosphere assay to evaluate endogenous neural stem cell activation in a mouse model of minimal spinal cord injury
Uploaded: 2018-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
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この作品は Krembil 財団 (営業許可 CMM) によって資金を供給します。WX はカールトン マルグリット スミス学生賞の受信者です。NL は、オンタリオ州大学院奨学金を受け取った。

「ガイド ケアと使用の実験動物」に従い、トロント大学で動物ケア委員会によって承認されたこのプロトコル (2ndエディション動物の世話、カナダ評議会 2017).
1. 最小限の脊髄傷害手術
注: 手術前にすべての手術器具と材料が (図 1 a) 適切な方法で滅菌されていることを確認してください。
<ol><li>4-5 正方形のガーゼを重ね、ガーゼの固定ロールを取得する途中でそれらを一緒にテーピングして呼吸器サポート アーチを構築します。</li>
	<li>誘導チャンバーにマウスを置きし、5% イソフルレンで麻酔を開始します。プロシージャ全体だけでなく、前に、つま先ピンチ反射の有無を確認します。手術は、完了に 30 分以上かかることが、として最小限のイソフルラン暴露 (5% で 5 分) や 2-3% で残り時間を最適化します。</li>
	<li>2-3% イソフルラン維持投与量で麻酔器に接続されている鼻の円錐形にマウスを転送します。バリカンを使用して、手術のため皮膚の広い長方形領域を公開する首/耳まで半ば後ろから動物の背から毛皮を削除します。</li>
	<li>脳定位固定装置に添付のノーズコーンにその鼻を置き、イヤバーと頭蓋骨を安定させるマウスを転送します。マウスの脳定位固定装置で保護されて一度耳バーと 2-3% に戻って下の配置中にイソフルラン 5% を維持します。</li>
	<li>術前鎮痛薬を腹腔内管理 — メロキシカム (2.0 mg/kg)。気前よく潤滑目麻酔と角膜の乾燥を防ぐためにオープン マウスの目に。</li>
	<li>尾のベースを軽く引いてマウス体内と背骨を矯正しながらマウスの腹部の下に胸部サポート アーチを配置します。尾および星のような位置にすべての拡張の手足を保護するのにテープにラベル付け室を使用します。セキュリティで保護された、一度押して上部胸郭に向かってマウスの腹部からの呼吸器サポート アーチ吻方、-胸椎 (図 1 b) を支えるために。</li>
	<li>70% エタノール、ポビドン ヨードに続いて手順 1.3 の準備毛皮クリップ皮膚領域を消毒して滅菌手術野を準備します。2 回繰り返します。広い滅菌フィールドを維持する滅菌手術用ドレープを適用します。</li>
	<li>#10 メス刃を使用して、縦切開は、胸椎の曲率を両方の肩甲骨の中間点から動物の長手方向の軸線に平行ください。軟部組織と脊柱輪郭線 (図 1) を公開するために皮膚を撤回します。</li>
	<li>(これは T4/5 椎体レベルを設定) 甲の脂肪パッドの下の境界を識別します。同じ #10 刃で慎重に、力、列から裏筋腱をデタッチする椎体骨 T5-T8/9 の両側に沿ってカットします。</li>
	<li>背骨の両側に切開サイトにリトラクターの歯を挿入します。露出を調整するには、十分に収縮の筋層 (図 1) にあまり負担をかけることがなく背骨を昇格するリトラクターを拡大します。</li>
	<li>手術顕微鏡下で注意深く洗浄残留筋肉や他の軟部組織 (図 1E) の椎体の骨を公開する脊椎を覆います。脊椎が上下の歯の鉗子で椎骨の棘突起を握りしめると、わずかに移動することによって削除されますを識別します。 注: これは椎間関節を識別できるようにする必要があります、興味の脊椎骨の下に小さな開口部 (椎間孔) を公開します。</li>
	<li>露出椎間孔を摘出する椎弓板に尾の両側に鈍化デカールバサミの 1 つのヘッドを挿入して、二国間接続椎間関節を切りなさい。</li>
	<li>板を上方に持ち上げるし、分離し、骨を取り除くラミナの上部アタッチメントを断ちます。 注: これは、脊髄 (図 1 f) を含む無傷の硬膜嚢が公開されます。過剰な可能性があります影響を受ける領域の上に 1 cm × 1 cm のガーゼをプレカットや滅菌 PBS で洗浄出血を配置することによって制御できます。</li>
	<li>ランドマークとして背側正中静脈、正中線の両側に約 0.5 mm 外側で脊髄 (約 1 mm 深い) の背側表面に (針ベベルが上向き) で 30 G の針の先端の 45 ° 曲がったシャフトを挿入します。</li>
	<li>針 〜 2 mm の尾側から吻側 (正中線に平行) に移動、針の傾斜面の全体の長さがコードに挿入されます。エントリ (図 1) のパスを介してが針を抜きます。 注: 必要があります出血、脊髄組織の腫脹は、この段階で見られるかもしれない。</li>
	<li>傷を閉じるため、リトラクターを削除し、6-0 吸収性縫合糸を用いた正中線で一緒に傷害のいずれかの側に背中の筋肉を縫合します。その後穿刺部位の皮膚を閉じます 4-0 滅菌絹縫合糸を使用します。</li>
	<li>綿棒の先端を用いた術後感染症を防ぐために表面的な縫合皮膚の上部に抗生物質軟膏を適用されます。0.1 mg/kg 皮下流体 (リンゲル液の 1 mL) と共にブプレノルフィンの術後鎮痛を管理します。</li>
	<li>イソフルラン気化器と酸素をオフにします。脳定位固定装置とない寝具で清潔なケージの場所から、マウスを削除します。</li>
	<li>次の覚醒麻酔とモニターの動作から回復のための熱ランプから約 30 cm のケージにマウスを配置します。マウスは 5-10 分でウェイク アップさせる、可能な麻痺や覚醒時に尻尾の弱点と後肢の機能を持つ必要があります。</li>
	<li>次の数日間マウスの動作を監視し、適切な術後ケアと鎮痛剤 (リンゲル液ソリューション液皮下、0.1 mg/kg ブプレノルフィン 2すなわちマッシュ、一日 2-3 日間で、適切な重量の監視のために皮下に毎日 x) 回復としてに従ってローカル動物施設規制し、個別に異なる場合があります。</li>
</ol>2. Neurosphere アッセイ郭清
注: 全体で適切な無菌培養手順に従います。
<ol><li>酵素液調製法
	<ol>
<li>アルブミン オボムコイド阻害剤含有ガラス瓶と優しく渦溶解するまでに 32 mL のアールのバランスの取れた塩ソリューション (EBSS) を追加します。</li>
		<li>プリポーション パパインのバイアルに EBSS 5 mL を追加し、溶解する 37 ° C の水浴中に置きます。ソリューションになる (ソリューション 1) をオフにします。</li>
		<li>EBSS の 500 μ L を取るし、濃度が 1 mg/mL (ソリューション 2) のバイアル ガラス プリポーション DNase を追加します。前後のバイアルを傾けることによってとてもやさしく混ぜるし、ソリューション 1 にこの混合物を 250 μ L を追加します。 注: 作られたすべてのソリューション (ソリューション 1 と 2) は、組織の 2 つの部分の処理のために十分です。組織のより多くの部分を処理している場合は、詳細のソリューションの準備と対応します。</li>
	</ol></li>
	<li>ティッシュの準備と郭清
	<ol>
<li>場所研究室ワイプはマウス ケージにイソフルランに浸し、完全にマウスを麻酔する蒸気の 2 〜 3 分を許可します。次のノックアウト マウスをケージから取り外し、つま先ピンチ反射の有無を確認します。</li>
		<li>(すなわち、金属ケージのカード) に動物を安楽死させる金属鈍器で頚部転位を実行します。スプレー 70% エタノールをたっぷりと半ばにその首から euthanized 動物。</li>
		<li>頭蓋底で頭を切断し、破棄バイオの袋にはさみを使用します。正中切開は、皮膚筋や椎体骨の輪郭線 (図 2 a) を公開する背中の全体の長さに沿って。</li>
		<li>各肩甲骨の内側面を持ち上げる (すなわち。、肩甲骨-脂肪質のパッドを覆うによって識別される) (肩甲骨・椎体間の軟部組織をカットするはさみを使用。基になる脊柱を公開する完全に独立した.</li>
		<li>以下の脊柱の湾曲、上胸部開口部にはさみのペアを挿入し、リブ、筋肉、臓器 (図 2 b) を切り取ることで、脊柱を分離します。</li>
		<li>尾椎孔・開口部にはさみを挿入し、ラミナ (背側表面) の両側に椎間関節をカットします。そのままケーブルを損傷しないように注意します。続きを所望のレベルおよび/またはコードの長さまで、このプロセスが公開されます。</li>
		<li>通常人工髄液をシャーレに脊髄組織を転送する前にコードから横方向に伸びる spinal nerve(s) を慎重にカットします。(図 2) の氷のサンプルを保ちます。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で ~ 2 mm 吻側と尾側に損傷部位を含むように脊髄組織を切断します。そっと背側と腹側の亀裂に沿って縦 2 等分にコードを分離する鉗子の 2 つのペアを使用して (図 2')。</li>
		<li>刀、負傷した背白質をカットします。15 mL の円錐管に作品を配置します。</li>
		<li>1 つを保持鉗子、ダウン脊髄の半分はいじめるし、白質の脊髄の rostrocaudal 範囲に沿って必要な脳室周囲領域を分離する微細鉗子の別のペアを使用してを削除します。脊髄の他の半分に繰り返します。</li>
		<li>別の 15 mL の円錐管に脳室周囲組織の作品を配置します。刀を使用し、軽く円錐管の壁にティッシュをミンチします。 注: 組織解離変更、パパイン解離システム プロトコル23前述の組織準備手順24です。</li>
		<li>組織サンプルに新ソリューション 1 (ステップ 2.1.3) の 2.5 mL を追加し、30 分の 37 ° C でロッカーに配置。</li>
		<li>そっとカップ刻んだ 1,000 μ L ピペット チップ ソリューションで組織。300 x g 5 分間室温で曇り細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>アールの平衡塩類溶液, オボムコイド阻害剤ソリューション (ステップ 2.1.1) の 300 μ L 2.7 ml ソリューション 3 を準備と DNase の 150 μ L 私ソリューション (ステップ 2.1.3)。</li>
		<li>ステップ (ステップ 2.2.13) から上澄みを廃棄し、前の手順 (手順 2.2.14) からソリューション 3 の 1.5 mL で再懸濁します。</li>
		<li>レイヤーの ovoimucoid 阻害剤溶液 (ステップ 2.1.1) 不連続密度勾配を作成する新しい 15 mL の円錐管に 5 mL の上にこの新しいセル中断 (ステップ 2.2.15)。300 × gで遠心するルートで 5 分間</li>
		<li>上澄みを廃棄し、neurobasal メディアの 2 mL で再懸濁します。300 × gで遠心する室温 3 分</li>
		<li>上澄みを廃棄し、neurobasal メディアの 1 つの mL で再懸濁します。5 mL の容量のためのメディアの 4 mL に続いて 20 μ m の細胞ストレーナーを使用して懸濁液をフィルター処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>めっき
	<ol>
<li>表皮の成長因子 (20 ng/mL) と neurobasal メディアを補完 neurosphere 成長培地を準備/線維芽細胞増殖因子 (20 ng/mL)/ヘパリン (2 μ g/mL) [の決定的な NSCs] または [プリミティブ NSCs] の leukemina 抑制的な要因 (10 ng/mL)。25 mL の培養フラスコにいずれかのメディアの 10 mL を追加します。</li>
		<li>検定とトリパン ブルー色素を使用して25(ステップ 2.2.18) から懸濁液中の細胞数を計算します。計算された、(ステップ 2.3.1) で作製した培養フラスコにセルを追加 24 h (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) のためのインキュベーターに追加されたセル 10 細胞/μ L と場所組織培養フラスコの栄養密度。 注: カウント手法の例のとおりです: 10 μ L トリパン ブルー色素の細胞懸濁液とミックスの取る 10 μ L。診断にこの混合物の 10 μ L を追加します。光学顕微鏡 X 10、[生きているセルの数をカウントし、内 4 x 4 象限の 4 カウントのすべてのセルを合計します。数式を使用して: 2 x 10 x 1,000 x 100,000/[(X cells/4)] クローン密度 (10 細胞/μ L) を確保するため各 25 mL の培養フラスコにめっきされる細胞を懸濁液の量を与える。</li>
		<li>24 h 後優しくフラスコを旋回し、15 mL の円錐管に内容を注ぐ。300 × gで遠心するルートで 5 分間</li>
		<li>上澄みを廃棄し、新鮮な neurobasal メディアの 1-2 mL のセルを再度中断します。</li>
		<li>2.3.2 補われるそれぞれのマイトジェン メディア (決定的な NSC 成長 EFH) と原始的な NSC 成長の LIF の 500 μ を含む 24 ウェル培養プレートのクローンの密度で懸濁液とプレートのセルのセルの数をカウントする手順を繰り返します。 注: 2 x 10 x 1,000 x 適応式 (5,000/[セル/4 X) を使用して) よく 500 μ L のメディアを含む各メッキに細胞懸濁液の体積を計算します。</li>
		<li>7 日間 (37 ° C、湿度 95%、5% CO2) 成長するインキュベーター内のセルを含んでいる版を配置します。</li>
	</ol></li>
	<li>カウント
	<ol>
<li>次の 7 日間培養プレートを削除し、光学顕微鏡で見る。球状のコロニーをカウントすることによって神経幹細胞を定量化する > dNSCs 文化の直径約 80 μ m と > 50 μ m 径 pNSCs 文化。 注: 必要な場合、神経幹細胞は継代26さらにすることができます。 または差別化します。セルが必要なくなった場合は、培地の色が黄色に変わり、20 分間 (約 1 mL) の井戸に加速の過酸化水素を追加することによって処分します。破棄します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Johansson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+neural+stem+cell+in+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system.</a> Cell. 96 (1), 25-34 (1999).</li><li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+central+nervous+system.">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276 (5309), 66-71 (1997).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).</li><li>Temple, S., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Stem cells in the adult mammalian central nervous system.</a> Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+neural+stem+cells+contribute+to+stroke-induced+neurogenesis+and+neuroblast+migration+toward+the+infarct+boundary+in+adult+rats.">Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats.</a> Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).</li><li>Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+environment+increases+neural+stem/progenitor+cell+proliferation+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone+of+stroke-lesioned+adult+rats.">Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats.</a> Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).</li><li>Faiz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+stem+cells+from+the+subventricular+zone+give+rise+to+reactive+astrocytes+in+the+cortex+after+stroke.">Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ependymal+cell+contribution+to+scar+formation+after+spinal+cord+injury+is+minimal,+local+and+dependent+on+direct+ependymal+injury.">Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury.</a> Science Reports - UK. 7, (2017).</li><li>Mothe, A. J., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+migration,+and+differentiation+of+endogenous+ependymal+region+stem/progenitor+cells+following+minimal+spinal+cord+injury+in+the+adult+rat.">Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat.</a> Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).</li><li>Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+interventions+after+spinal+cord+injury.">Therapeutic interventions after spinal cord injury.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).</li><li>Bethea, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemically+administered+interleukin-10+reduces+tumor+necrosis+factor-alpha+production+and+significantly+improves+functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+in+rats.">Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats.</a> Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).</li><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection,+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).</li><li>Cummings, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+stem+cells+differentiate+and+promote+locomotor+recovery+in+spinal+cord-injured+mice.">Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).</li><li>Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+models+of+spinal+cord+injury.">Cell death in models of spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).</li><li>Metz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+weight-drop+contusion+model+in+rats:+a+comparative+study+of+human+spinal+cord+injury.">Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).</li><li>Faulkner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+astrocytes+protect+tissue+and+preserve+function+after+spinal+cord+injury.">Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury.</a> Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).</li><li>Cheriyan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+models:+a+review.">Spinal cord injury models: a review.</a> Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).</li><li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nature Methods. 3 (10), (2006).</li><li>Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+and+progenitor+cells+in+nestin-GFP+transgenic+mice.">Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+regulates+primitive+and+definitive+neural+stem+cell+proliferation+from+the+adult+spinal+cord.">Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord.</a> Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).</li><li>Sachewsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain+give+rise+to+GFAP-expressing+neural+stem+cells.">Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).</li><li>Mothe, A., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem/progenitor+cells+from+the+periventricular+region+of+the+adult+rat+and+human+spinal+cord.">Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li><li>Absher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocytometer+counting.">Hemocytometer counting.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconditioning+with+isoflurane+produces+dose-dependent+neuroprotection+via+activation+of+adenosine+triphosphate-regulated+potassium+channels+after+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).</li><li>Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+testing+of+motor+function+in+spinal+cord+injured+rats.">Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats.</a> Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).</li><li>Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CatWalk-assisted+gait+analysis+in+the+assessment+of+spinal+cord+injury.">CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

手術中に、研究者が最適な結果を取得し、動物間のばらつきを最小限に抑えるのために特に注意を払う必要がありますいくつかの重要なステップがあります。注意が必要 (イソフルラン) 吸入麻酔と手術中に麻酔が長時間27神経保護効果が示されていると。したがって、損傷脊髄の再生能力を学習の際の努力として迅速かつ効率的に交絡変数を防ぐために可能な限り手術を行?...

中枢神経系には、すべて異なる成熟した神経細胞の種類1,2,3,4に上昇を与える能力を持っている自己更新多能性幹細胞の集団が含まれています。これらの神経の幹細胞 (NSCs) は、脳や脊髄の専門にされたニッチに存在し、増殖、移行、および成熟神経細胞に分化する損傷アクティブすることができます。NSCs と彼らの子孫は、大脳皮質損傷モデル5,6傷害のサイトに移行する示されています。脳の側脳室から、グリア瘢痕形成7に貢献しているアストロ サイトに分化し、損傷部位に移行する NSCs を示されています。脊髄、ただし、いくつかの研究の脊髄損傷回復を促進するためこれらの同じ内因性 NSCs に利用できるかどうかを求めるに行われています。確かに、現在、脊髄における幹細胞のプールの活性化が中心管8を並べる脳室周囲ニッチの直接の物理的損傷を必要かどうかまたは脊髄へのダメージ コード (茎を残して実質のかどうかに議論は細胞ニッチそのまま) で内因性 NSCs9を有効にするに十分です。
脊髄損傷 (SCI) モデルの数は、急性および慢性の傷害の病態生理を研究に使用されています。これらのモデルは、神経保護、抗炎症、および開発細胞移植/交換戦略10、11,13SCI を治療するために潜在的な療法をテストする使用されています。現在のモデルには、コード14,15で大規模な機能障害と同様に広範な病変とキャビテーションが発生する圧縮および/または挫傷の傷害が含まれます。結果グリア瘢痕脊髄16の幅/円周の大半と共にいくつかの脊髄セグメントをまたがることができます。したがって、これらのモデルは臨床的に関連性の高い、彼らは損傷内因性 NSCs の応答を勉強する重要な課題を与えます。中央運河17を割くことができる傷害の穏やかな形態をさせるために適応することができます損傷の化学モデルがあります。しかし、これらのタイプの損傷の SCI に関連付けられている脱髄に焦点を当てるし、外傷性理に関連付けられている物理的および/または機械的損傷の臨床的に関連するモデルではないです。
現在の損傷モデルの制限に対処するため、我々 は針トラック最小限 SCI モデル、もともと、ラット9、成体マウス モデルのアプリケーションのために開発を適応しています。適応傷害モデルはマウスの脊髄の背外側領域の一貫した病変を作成でき、予備の損傷のレベルで中心街にある運河。このモデルの利点は、NSC の速度論の研究を許可する損傷部位への損傷とその潜在的な放射状の移住、次します。マウス モデルの使用は、内因性 NSCs と傷害に続く彼らの子孫の系譜追跡を許可するトランスジェニック マウスの使用もできます。NSCs のプロパティは、このプロトコルで導入された体外neurosphere アッセイの変更フォームを使用してさらに評価できます。
Neurosphere アッセイは、生体外でコロニー形成試金マイトジェン存在 NSCs の隔離を可能にします。クローン メッキ密度個々 NSCs は NSCs の小さな個体の前駆細胞18,19の大半で構成される細胞の浮遊球コロニーを生じさせるのに増殖します。我々 のプロトコルで脊髄の脳室周囲の地域から 2 つの異なる、後月関連 NSCs の分離を示す — 基準条件と私たちの最小限の SCI のモデル。決定的な神経幹細胞 (dNSCs) 特急ネスチンとグリア線維性酸性蛋白 (GFAP) と上皮成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 (FGF) やヘパリン (EFH と呼ばれる一緒に)20存在下で栽培されています。これらの dNSCs は生体外で非常に少ない神経幹細胞に上昇を与える素朴な脊髄にまれです。ただし、次の脳室周囲地域21由来神経幹細胞の数を拡大して、最小限の SCI dNSCs をアクティブ化を示します。原始的な神経幹細胞 (pNSCs) は、神経幹細胞系列の dNSCs の上流。pNSCs 多能性マーカー Oct4、という極めてまれな、特急の低水準で、白血病の抑制的な要因 (LiF) 応答22。pNSCs は、成体マウス脊髄初代培養; ミエリン塩基性タンパク質 (MBP) の存在のためにから分離したときの神経幹細胞を形成しません。pNSC 神経幹細胞は、MBP 欠損マウスから分離することができ、その数は拡大続く傷害-dNSCs21に似ています。最後に、我々 は dNSC 由来の神経幹細胞を早く次の最小限の大回で損傷部位から分離することができます表示これらの結果は示して私たち損傷モデルと試金が増殖して損傷に応答を移行する能力などの脳室周囲 NSCs の活性化特性を評価できます。

<table><tbody><tr><td>Agricola Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-50</td><td>Customize when ordering to get blunted tips</td></tr><tr><td>Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Or any other forceps for suturing</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats (Straight)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td>Or any other appropriate for suturing</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Or any other appropriate</td></tr><tr><td>Hair clippers</td><td>amazon.ca</td><td>https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>Stoeling</td><td>51500</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td>or any appropirate sanctioned my animal care facility</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td>or any appropriate sanctioned by animal care facility</td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td>https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter International Inc</td><td>DIN 02225875</td><td>or any other appropriate for anesthesia</td></tr><tr><td>Q-tips Cottom Swabs</td><td>amazon.ca</td><td>https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&amp;amp;psc=1&amp;amp;refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>30 G Needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td>For Injury</td></tr><tr><td>25 G Needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>For Drug injections</td></tr><tr><td>1 mL Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>3090659</td><td>for drug injections</td></tr><tr><td>3 mL Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td>for fluid injections</td></tr><tr><td>4-0 Suture</td><td>uoftmedstore.com</td><td>2297-VS881</td><td>for skin suturing</td></tr><tr><td>6-0 Suture</td><td>uoftmedstore.com</td><td>VS889</td><td>for muscle suturing</td></tr><tr><td>Polysporin ointment</td><td>amazon.ca</td><td>102051</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Vaporizer</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>any appropriate</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Standard Dissection Tools</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Counting Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Neural Basal-A Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17404-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin- Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>L- Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Invitrogen</td><td>12700075</td><td></td></tr><tr><td>30% Glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>1 M, 9.01 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M Glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>155 mM, 1.30 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>155 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>23.83 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3188-AT</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td>1 vial of papain can be used for 2 samples</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td>Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0226</td><td>Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 &amp;mu;L vials to be stored in freezer</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 well Plates</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>11.69 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M KCL</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>7.46 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>20.33 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>108 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C7902</td><td>1.59 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr></tbody></table>

a neurosphere assay to evaluate endogenous neural stem cell activation in a mouse model of minimal spinal cord injury

大人の哺乳類の脊髄における神経幹細胞 (NSCs) は、勉強できる体外neurosphere アッセイを用いた脳室周囲細胞の有糸分裂比較的静止人口です。このコロニー形成アッセイは NSCs の料理で外因性の要因に対する反応を研究するための強力なツールしかし、これも使える強みの適切な理解と分析の限界と生体内での操作の影響を検討します。臨床的関心の 1 つの操作は、活性化 NSC 内因性傷害の効果です。脊髄損傷の現在のモデルは、挫傷、圧縮、および断裂の一般的なモデルの重大度は、幹細胞が存在する傷害のサイトで NSC ニッチの破壊を引き起こすこの研究への挑戦を提供します。ここでは、成体マウスの脊髄 (T7/8) の下位胸椎レベルの表面的な背側表面でローカライズされた損傷を引き起こす最小損傷モデルをについて説明します。この損傷モデルは傷害のレベルで中心部の運河をスペアし、傷害に続く様々 な時点で病変のレベルで存在する NSCs の解析が可能します。ここで、NSCs プリミティブと決定的な NSCs 脊髄脳室周囲地域内に存在する 2 つの異なる、後月関連集団の活性化を研究する neurosphere アッセイを利用できる方法を紹介 (pNSCs と dNSCs、それぞれ)。我々 は分離し、傷害および白質傷害のサイトのレベルで脳室周囲領域からこれらの NSCs を文化をデモンストレーションします。私たち手術後脊髄の解剖は、pNSC とコントロール、けがを介して、活性化に話すと比較して負傷したコードの脳室周囲の地域から dNSC 由来神経幹細胞の数の増加を示します。さらに、外傷後に、dNSC 由来の神経幹細胞分離できます傷害のサイトから-彼らの脳室周囲のニッチから傷害のサイトに移行する NSCs の能力を示します。

術後では、マウス尾と 24 h までの可能な限りの後肢麻痺を含む最小限の運動障害を体験してください。この後、マウスを体験する後肢麻痺麻痺や歩行の変化は最小限。
図 3は、最小限の脊髄損傷後 5 日 neurosphere アッセイから代表的な結果を示しています。(EFH 産) dNSC 由来神経幹細胞の絶対数が傷害?...

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A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

ここでは、我々 は、スペアの中央運河ニッチ住宅内因性神経幹細胞 (NSCs) 大人のマウスの最小限の脊髄損傷モデルの性能を発揮します。Neurosphere アッセイを使用してアクティブ化および傷害に続く決定的な原始的な NSCs の移行を定量化する方法を紹介します。

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K ビュー.  University of Toronto. ここでは、我々 は、スペアの中央運河ニッチ住宅内因性神経幹細胞 (NSCs) 大人のマウスの最小限の脊髄損傷モデルの性能を発揮します。Neurosphere アッセイを使用してアクティブ化および傷害に続く決定的な原始的な NSCs の移行を定量化する方法を紹介します。

ビデオ: A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

発生生物学

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

神経科学

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

医学

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

NPC Neurosphere Assay: An In Vitro Assay to Assess the Migratory Response of Neural Precursor Cells from the Neurosphere

Source: Williams, M. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56628/rapid-detection-neurodevelopmental-phenotypes-human-neural-precursor">Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs).</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the neural precursor cell neurosphere migration assay&#8212;an in vitro assay to study the migratory response of neural precursor cells from the neurosphere&#8212;via microscopic analysis.

NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

Source: Williams, M. et al. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs).&#160;J. Vis. Exp. (2018)
This video ...

最小限の脊髄損傷のマウスモデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

要約

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この動画の章

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

要約

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成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

最小限の脊髄損傷のマウスモデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ