Name: evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
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本研究は、学内研究部門の国立看護学研究所 NIH は、ベテスダ、メリーランド州のによって完全にサポートされます。

(NCT00852111) の現在の研究は、制度レビュー委員会 (IRB) の国立研究所の健康 (NIH)、ベテスダ、メリーランド州で承認されました。参加者が本研究に登録された euthymic 男性 18 歳以上年齢の人は非転移性前立腺がん以前前立腺摘除術の有無と診断され、された外部ビーム放射線療法 (照射線量) を受信する予定します。彼らは大きな疲労を引き起こす可能性のある進行性の病気を持っていた場合、潜在的な参加者が除外された過去 5 年以内に精神疾患があった、あった裸眼甲状腺機能低下症や貧血、または 2 番目の悪性腫瘍があった。非ステロイド系抗炎症剤やステロイド、鎮静剤を使用される方はまた除かれました。健常者の血液サンプルは、IRB 承認プロトコル (NCT00001846) の下で健康なドナーから NIH 輸血科で得られました。すべての参加者は、NIH のマグナソン臨床研究センターで募集しています。研究への参加前に署名された書面によるインフォームド同意が得られました。
1. ミトコンドリア機能測定準備 (実験の 1 日)
<ol><li>センサー カートリッジを水和物 (テーブルの材料のおおよその時間を参照してください: 5 分)。<ol>
<li>センサー カートリッジをパッケージから削除します。ユーティリティ プレートの各ウェルに 200 μ L Calibrant ソリューションを追加し、400 μ L Calibrant ソリューションで各堀を埋めます。</li>
		<li>センサー プレートを Calibrant のソリューションは、それ今ユーティリティ板に戻ります。非 CO2の 37 ° C の定温器でカートリッジを一晩メタンハイド レートします。 注: センサー カートリッジは 4 h の最小値と最大 72 h の水和を受ける必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 臨床試料 (実験 2 日目)
<ol><li>13 項目機能評価の慢性的な病気の治療 - 疲労 (FACIT F)2,23,24 (気管支腔内照射の開始) の前にベースライン、中点、気管支腔内照射、および 1 年間ポスト気管支腔内照射を用いた疲労を測定します。<ol>
<li>0 - を使用して各項目の応答、どこ 0「全然」を表し、4 は、申立人に関連している対応するステートメント「非常にします」を示します 4 スケール。合計スコアは、高疲労強度を反映して低いスコアを持つ範囲 16-53 でなければなりません。</li>
		<li>FACIT F スコアがなく臨床的に有意義な疲労2の有無を示す ≥43 の 43 より低い FACIT F スコアとして疲労を定義します。 注: FACIT F スコア 43 最高の疲労度ががん患者の一般的な人口2で除算します。</li>
		<li>FACIT 疲労尺度で以下の 13 項目が含まれます: 1) 私は疲れがある;2) 気が弱い一面。3) 私は脱力感を覚える、(「洗浄」);4) 私は疲れた。5) 問題; 疲れたから始めることがあります。6) 仕上げ; 疲れたから問題があります。7) 私はエネルギーがあります。8) 私は私の通常の活動を行うことができます。9) 私は一日中にスリープする必要10) 私は疲れていたので食べる。11) 私は私の通常の活動をやって助けを必要12) 私のやりたい事をして疲れすぎていてイライラします。13) 私は疲れたため社会的活動を制限する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>新鮮血液サンプルから PBMC を分離 (おおよその期間: 1 h)。<ol>
<li>単核細胞調製管に 8 mL の血液を収集 (材料の表を参照してください)。 注: コレクションの 2 時間以内の血液サンプルに処理されます。血液サンプル サンプル採取後 2 h 以上で処理される場合、PBMCs の質が妥協されることがあります。</li>
		<li>部屋の温度 (18-25 ° C) で 30 分間 1,750 × g で遠心分離機します。曇りの層を 15 mL の円錐管に転送します。最大 15 mL の PBS を追加し、5 回を反転します。</li>
		<li>4 ° C で 15 分間 300 × g で遠心します。慎重に削除し、不穏なペレットなし上澄みを廃棄します。再 10 mL、PBS を追加することでペレットを中断し、5 回を反転します。</li>
		<li>300 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上澄み液を破棄し、再 1 mL の PBS のセルを中断します。1.5 mL および microfuge の管に、PBMCs を転送します。</li>
		<li>610 x g で 10 分間遠心します。慎重に上清を除去し、完全な RPMI 1640 でペレットを再懸濁します (10% 添加 RPMI 1640 10 mM ペニシリン/ストレプトマイシン FBS)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>非付着性のセルのセル板をコート (おおよその時間: 30 分)。<ol>
<li>細胞・組織の接着ソリューションを準備 (材料表参照) 0.1 M 炭酸水素ナトリウム pH 8.0 で原液を希釈することによって。作業ソリューションは、表面積の 3.5 μ g/cm2をする必要があります。 注: このソリューションには、ムラサキイガイ、イガイから抽出されたポリフェノールのタンパク質が含まれています。これらのタンパク質は、表面に自分自身を固定するムール貝によって分泌される接着剤のキー コンポーネントです。我々 は、セル徳 PBMCs の最高の作品を見つけます。</li>
		<li>各ウェルに希釈した接着剤溶液 100 μ L を追加し、室温で 20 分間インキュベートします。・ ディ ・水と空気で 3 回洗って乾燥。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ミトコンドリア機能測定
<ol><li>アッセイ媒体の作製 (おおよその時間: 10 分)。 注: 分析メディアは、新鮮な実験の日に準備されなければなりません。<ol>
<li>L-グルタミン、ピルビン酸、およびブドウ糖メディア (同じ成分ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) が、重炭酸ナトリウム、ブドウ糖、グルタミン、やピルビン酸ナトリウム) をベースにしてアッセイのメディアを追加します。メディアをウォーム アップ 37 ° c、7.4 に pH を調整します。 メモ: グルコース、ピルビン酸、L-グルタミンの濃度は、通常、通常成長媒体中の濃度と同じが分析に基づいて調整することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>水戸ストレス テストに備えて PBMCs (おおよその時間: 2 時間)。<ol>
<li>80-90% の confluency に到達する各ウェルにステップ 2 から十分な PBMCs をプレートします。我々 の経験では、105細胞/ウェル x 1.5 は、最も一貫性のある結果を得られました。 注: 井戸 A と H は、背景井戸しかない細胞アッセイ メディアを含める必要があります。井戸 B G、外れ値を考慮するために患者のサンプルあたりの少なくとも 3-6 ウェルズをめっきすることをお勧めします。</li>
		<li>井戸の底に付着する細胞を許可するように 2 分間 200 x g でプレートをスピンダウンします。アッセイのメディアで一度セルを洗浄します。この手順では、血清と炭酸水素ナトリウムが成長媒体から削除します。 注: 我々 の経験で洗浄のステップ、通常細胞の 20-30% に削除します。</li>
		<li>45-60 分の非 CO2の 37 ° C 定温器で背景井戸 A および h. 加温を含む、各ウェルに 180 μ L 測定メディアを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>水戸のストレス テストを実行します。<ol>
<li>アッセイ メディアで水戸ストレス キットで薬をとおり再構築します。<ol>
<li>オリゴマイシン: 50 μ M で原液を生成するバイアルに 252 μ アッセイ メディアを追加します。</li>
			<li>FCCP: 50 μ M で原液を生成するバイアルにアッセイ メディアの 288 μ L を追加します。</li>
			<li>アンチマイシン A/ロテノン: 25 μ M で原液を生成するバイアルにアッセイ メディアの追加 216 μ L。</li>
		</ol>
</li>
		<li>渦は、約 1 分の薬を再構成しました。作業ソリューションに希釈します。 注: 作業ソリューションの濃度を滴定、細胞の種類に応じて実験前にあらかじめ決められました。PBMCs、我々 は見つけるのオリゴマイシンその 1 μ M、FCCP、1 μ M、0.5 μ M アンチマイシン A/ロテノンは最高の作品します。</li>
		<li>センサー カートリッジの各ポートに順番に薬をピペットします。<ol>
<li>ポート a: ピペット 20 μ 10 μ M の 1 μ M の各ウェルに最終濃度のオリゴマイシン。</li>
			<li>1 μ M の各ウェルに最終濃度 10 μ M、FCCP のポート b: ピペット 22 μ L。</li>
			<li>ポート c: 5 μ M アンチマイシン A のピペット 25 μ L/0.5 μ M の各ウェルに最終濃度のロテノン。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞外フラックス計測器で「水戸ストレス テスト」を選択します。楽器のガイダンスに従うし、センサー カートリッジを挿入します。楽器は、センサーのキャリブレーションを自動的に実行されます。センサーの校正や計測器は、アッセイの残りの部分を終了後、セル板を挿入します。530 での酸素動態を測定 nm (励起)/650 nm (排出), 470 でプロトン濃度の測定と nm (励起)/530 nm (排出) します。</li>
</ol>4 ミトコンドリアの機能データの正規化
<ol><li>細胞増殖試験ソリューションを準備 (おおよその時間: 5 分)。<ol>
<li>11.7 mL PBS に 48 μ 核酸染色 (500 x) および 240 μ L 背景抑制を追加 (2 x)。核酸染色は細胞側の透過物 DNA 結合色素と背景抑制は死んだ細胞や染色されてから整合性が危険にさらされた細胞膜細胞をブロックするマスキング染料。DNA 結合色素と背景サプレッサーの組み合わせにより細胞のみが染色になります。</li>
		<li>水戸のストレス テストが完了した後、各ウェル内の媒体に直接作業ソリューション (180 μ L) x 2 の等量を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>45-60 分生きているセル (蛍光) 508 でプレート リーダーの数を定量化するための 37 ° C の定温器で細胞増殖アッセイ液の存在下で細胞をインキュベート nm (励起)/527 nm (排出) して OCR データを正規化する (おおよその時間: 10 分). 注: 数の生きているセルに加えてユーザーことができますセルの合計数、核酸、タンパク質濃度などの量を使用してデータを正規化します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy.">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li><li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy.">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li><li>Myhill, S., Booth, N. 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著者が明らかに何もありません。

がん患者における倦怠は、正しく定義されていませんまたは1を特徴と衰弱状態です。疲労の診断は全く主観的な報告に依存している、現在の診断基準や主にその競走2理解の欠如のため、この条件のための治療がないです。がん患者における倦怠の提案されたメカニズム、ミトコンドリアの機能障害が最も治療対象の経路の 1 つ。したがって、積極的に開?...

疲労は、1がん患者の生活の質にマイナスの影響は、普及していると悲惨な状態です。これまで、ガン疲労定義が不十分なまま、患者2で主観的な報告だけに依存しています。したがって、臨床設定3,4で疲労を客観的に特徴付けるため簡単に適応可能な診断検査を識別するために緊急の必要性があります。
疲労5を原因とするミトコンドリアの機能不全を含む複数の基になるメカニズムを提案されています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化を介した細胞のエネルギー需要の 95% を提供する発電所器官し、カルシウム シグナル伝達、アポトーシス、免疫シグナル伝達、他は細胞内のシグナル伝達イベント6の規制に重要な役割を果たす.したがって、障害ミトコンドリア生体エネルギーとエネルギー生産の欠陥に貢献するかもしれない疲労。この仮説をサポートするには、以前の研究は、慢性疲労症候群7患者におけるミトコンドリア DNA の変異を観察しています。疲労の病態生理学的起源は、中枢神経系や骨格筋8,9などの末梢組織内であるかどうかは不明のままがない現在を正確に評価する直接法ライブ、respiring 細胞の疲労に関連するミトコンドリアの機能障害。
末梢血単核球 (PBMCs) を使用して、ミトコンドリアの機能を研究するいくつかの利点を提供しています。まず、PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用してすぐに利用できる、基本的な実験技術を使用して迅速に分離することができます。第二に、採血は、筋生検等の組織を収集するよりも低侵襲です。したがって、血液サンプルを収集できます同じ患者から繰り返し治療効果の縦断的評価を容易にする時間をかけて。興味深いことに、PBMCs のミトコンドリアの機能は動物モデル10腎ミトコンドリアの状態とよく相関しているように見えた。さらに、免疫細胞のミトコンドリアは異なった病気の条件11,12の下での制度の変更を検出するためのプロキシとして使用されています。循環免疫細胞内のミトコンドリアは、特に免疫機能の変化に敏感と免疫シグナル分子サイトカイン13,14,15などです。たとえば、急性のリウマチ性の炎症性疾患患者から PBMCs が高いベースライン酸素消費量14を示すことが観察されています。対照的に、敗血症16を含む全身の炎症性疾患を持つ患者から分離された PBMCs の酸素消費量が減った。炎症性の条件の下で高い酸化ストレスと炎症17ミトコンドリアの機能不全によって生成されるフリーラジカルを貢献することかもしれないさらに。ミトコンドリア酸化ストレスと同様、エネルギー生産の中心的な役割は、がん患者13で疲労を勉強するためのプロキシとしてミトコンドリアの機能を使用しての潜在的な有用性を示唆しています。
ミトコンドリアの機能を調べる研究活用生化学的手法、ミトコンドリアの膜電位測定、または臨床設定5,に容易に適応できない可能性があります特定の細胞集団の分離14,18。近年、細胞外のフラックスの試金の開発研究者を簡単に許可しているし、正確に呼吸阻害剤19,20の自動注射に対する酸素消費量 (OCR) の変化を調べる,21,22します。 しかし、これらの研究のほとんどは、特定の細胞型の設計されています、高スループット大判を臨床場面に適用できない場合があります。本稿では臨床使用のためのミトコンドリアの機能を検査するための最適化されたプロトコルについて述べる。

<table><tbody><tr><td>CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>For isolating PBMCs following phlebotomy</td></tr><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>For hydrating cartridges</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td></tr><tr><td>XF base media</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>For measuring mitochondrial function in live cells</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr></tbody></table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

疲労は共通、ほとんどの患者に影響を与える条件を衰弱させます。これまで疲労残る悪い特徴ないの診断を客観的に測定するこの条件の重大度をテストします。ここで疲れのがん患者から採取した PBMCs のミトコンドリアの機能を評価するための最適化手法について述べる.基底のミトコンドリア呼吸、呼吸の余力を記述するエネルギーの表現型を測定することによって PBMC ミトコンドリア機能状態を検討した小型細胞フラックス システムと呼吸阻害剤の連続注入を使用して、ストレスに反応する最寄りのエネルギー経路。新鮮な PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用して容易に利用できます。このプロトコルで記述されている全体の分析は、複雑な生化学的手法の関与なし 4 時間未満で完了ことができます。さらに、再現性のあるデータを取得する必要がある正規化手法について述べる。同じ患者および潜在的な治療効果を評価する時のポイント間で比較することができる再現性のあるデータの生成から繰り返しサンプル収集できる簡単な手順と正規化方法を提示します。

水戸のストレス テストは、完全なミトコンドリア プロファイルにマップする様々 な呼吸阻害剤の逐次投与後酸素消費量 (OCR) の測定に依存します。ミトコンドリアの健康に関連する各注入剤は、次のパラメーターを計算する使用ことができます後の OCR 測定:基底 OCRはまず安静時レベルの ATP 需要を満たすために必要な酸素消費量を評価するために任意の?...

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Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。

がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K ビュー.  National Institutes of Health. 私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。

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Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

がん研究

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of current interventions to adequately treat fatigue in all patients leaves a need for new treatment options. Despite the therapeutic need and importance of preclinical research in helping identify promising novel treatments, few preclinical assays of fatigue are available. Moreover, the most common preclinical assay used to assess fatigue-like behavior, voluntary wheel running, is not suitable for use with some strains of mice, may not be sensitive to drugs that reduce fatigue, and has relatively low throughput. The current protocol describes a novel, non-voluntary preclinical assay of fatigue-like behavior, the treadmill fatigue test, and provides evidence of its efficacy in detecting fatigue-like behavior in mice treated with a chemotherapy drug known to cause fatigue in humans and fatigue-like behavior in animals. This assay may be a beneficial alternative to wheel running, as fatigue-like behavior and potential interventions can be assessed in a greater number of mice over a shorter time frame, thus permitting faster discovery of new therapeutic options.

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

トレッドミル疲労試験：マウスの​​疲労のような挙動のシンプルな、ハイスループットアッセイ

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

行動学

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule synthesis. Genetic and functional adaptations of mitochondria to the tumor environment drive proliferative and metastatic potential. The advent of DNA and RNA sequencing removed critical barriers to the evaluation of genetic mediators of tumorigenesis. However, to date, methodological approaches to evaluate tumor mitochondrial function remain elusive and require technical proficiency limiting the feasibility, ultimately diminishing diagnostic and prognostic value in both experimental and clinical settings. Here, we&#160;outline a simple and rapid method to quantify rates of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and electron transfer (ET) capacity in freshly excised solid tumor homogenates using high-resolution respirometry. The protocol can be reproducibly applied across species and tumor types as well as adapted to evaluate a diversity of mitochondrial ET pathways. Using this protocol, we demonstrate that mice bearing a luminal B mammary cancer exhibit defective nicotinamide adenine dinucleotide-linked respiration and reliance on succinate to generate adenosine triphosphate via OXPHOS.

We developed a practical protocol and analytical approach to evaluate mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transfer capacity in fresh tumor homogenates. This protocol can be easily adapted to survey various mitochondrial functions that contribute to cancer initiation, progression, and treatment response.

切除された固形腫瘍均質物のミトコンドリア機能の分析的決定

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

懸濁増殖がん細胞からのトランスフォコンドリアサイブリッドの作製

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

著者スポットライト:がん細胞株を使用したトランスミトコンドリアサイブリッドの生成  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

生化学

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール<em&gt;インビボ</emヒト骨格筋における&gt;ミトコンドリア酸化的リン酸化能力

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

医学

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

免疫・感染学

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic disease. Although the etiology of age-related physical disability is complex and multifactorial, the decline in mitochondrial function appears to coincide with the progression of functional decline in many older adults. The reason why there is a decrease in mitochondrial function with aging remains elusive, but emerging science indicates that both fuel metabolism and circadian rhythms can influence mitochondrial function.
Recent studies have established that circadian rhythms become disturbed with aging, and that disrupted circadian rhythms have pathological consequences that impact mitochondrial function and overlap with many age-associated chronic diseases. Current quantitative methods for direct assessment of mitochondrial function are invasive and typically require a muscle biopsy, which can pose difficulties with participant recruitment and study adherence, given the perceived levels of potential pain and risk. Thus, an innovative and relatively noninvasive protocol to assess changes in mitochondrial function at the cellular level and circadian patterns in older adults was adapted. Specifically, a real-time metabolic flux analyzer is used to assess the mitochondrial bioenergetic function of white blood cells under differential substrate availability.
The expression of circadian clock genes in white blood cells to cross-correlate with the mitochondrial bioenergetics and circadian rhythm outcomes are also analyzed. It is believed that these innovative methodological approaches will aid future clinical trials by providing minimally invasive methods for studying mitochondrial substrate preference and circadian rhythms in older adults.

A novel and minimally invasive protocol is presented to evaluate the synergistic impact of fuel utilization and circadian rhythms on aging individuals, utilizing peripheral blood mononuclear cells.

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic ...

がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価

要約

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主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

トレッドミル疲労試験：マウスの疲労のような挙動のシンプルな、ハイスループットアッセイ

切除された固形腫瘍均質物のミトコンドリア機能の分析的決定

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価

要約

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主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

トレッドミル疲労試験：マウスの​​疲労のような挙動のシンプルな、ハイスループットアッセイ

切除された固形腫瘍均質物のミトコンドリア機能の分析的決定

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

トレッドミル疲労試験：マウスの疲労のような挙動のシンプルな、ハイスループットアッセイ