このプロトコルは、腫瘍ミトコンドリア機能を測定するための簡単かつ迅速な方法を記述する。このプロトコルは、臨床翻訳腫瘍学に広く適用され、癌の発症および進行におけるミトコンドリアの役割の診断および機械学的解釈を強化するのに役立ちます。この技術の主な利点は、組織均質化の適用が調製を簡素化し、拡散の限界を緩和しながらミトコンドリアの収量を最大化することです。
この技術は、新たに生検または切除された腫瘍組織を用いた腫瘍ミトコンドリア機能の定量的評価を伴う臨床および診断設定における潜在的な応用を提供する。まず、ミトコンドリア呼吸媒体(MiR05)を1ミリリットル含むガラスホモジナイザーを、湿った氷の上にしっかりとフィットしたガラス害虫に入れることから始めます。組織を1ミリリットルの生検保存溶液(BIOPS)に氷冷ペトリ皿に入れます。
腫瘍をそれぞれ約5〜10ミリグラムの小片に切り、残りの腫瘍片を氷の上に保たれたBIOPSの10ミリリットルに戻します。濾紙に慎重に組織切片を吸い込んだ後、小さなプラスチックタール計量ボートに置き、最初の湿式重量を記録します。未使用の部分をBIOPSの10ミリリットルの円錐管に戻し、継続的な保存を行います。
MiR05を含む氷冷ホモジナイザーに組織切片を水没させ、重量ボートに残りの重量を記録します。0.09〜0.16ミリメートルのクリアランス範囲を有するガラス害虫を使用して、5〜7回のダウンおよびアップストロークを完了することによって腫瘍組織を穏やかに破壊する。各ストロークについて、害虫を下に押しながら時計回り/反時計回りに3回回転させ、害虫を引き上げながらさらに3回回転させます。
組織がストロークの間にホモジナイザーの底に落ち着くようにしますが、泡立ちを防ぐために流体ボリュームの上に害虫を完全に持ち込むことは避けてください。ホモジュネートを15ミリリットルの円錐形チューブに注ぎ、氷の上に置きます。ピペットは、新鮮なMiR05を1〜3ミリリットルの新鮮なMiR05を害虫の上に、ホモジナイザーに入れ、残りの組織ホモゲネートを洗浄する。
ホモジネートを含む円錐管にMiR05洗浄を注ぎます。このステップを2~3回繰り返して、ホモジネートの完全な移動を確実に行います。組織ホモジネート濃度を正確に計算するには、ホモジナイザーとホモゲネートを注意深く検査し、結合組織を含む非ホモジナイズ材料を残します。
ピンセットで到達できないホモジナイザーから非ホモジナイザー材料を除去し、ホモジナイザーにMiR05を添加した後、組織を含む体積をピペットで吸引し、内容物をペトリ皿に移動させる。ホモゲン酸からホモジネートから円錐管の底に大きく落ち着いた非ホモジナイズ材料を取り除き、円錐管のキャップの上に置きます。ペトリ皿または円錐形のチューブキャップからピンセットで組織を取り出し、ろ過用紙にブロットします。
残りのホモジネートを円錐形のチューブキャップから円錐形チューブに追加します。チューブをキャップし、反転して混ぜます。ホモジナイザーを再検査し、任意の追加の非ホモジナイズ材料をホモゲネートし、必要に応じて非ホモジナイズ材料を除去する手順を繰り返します。
ホモジナイザーから回収した非ホモジナイズ材料の質量を計量して記録する。移された任意のひどく無傷の組織のためのホモゲネート調製物を検査し、非ホモジナイズされた部分を取り除き、必要に応じて重量を量る。重量のボート、ホモジナイザー、およびホモゲネートから回収した組織重量を最初の湿潤重量から引いて、最終的なサンプル重量を計算する。
最終的なサンプル重量を使用して、さらにMiR05を加えて、所望の濃度にホモゲネートを持ち込みます。ホモジネートを計量して調製したら、できるだけ早くアッセイに進みます。サンプルは、器具に移されるまで湿った氷の上に保管してください。
機器が較正され、サンプルが準備されたら、ねじれた動きでストッパーを取り外し、チャンバーからMiR05を吸引し、チャンバー内に露出した膜を避けます。ホモゲネートをよく混ぜ、ホモゲネートの2.25ミリリットルをチャンバに加えます。1つのホモジネートが複数のチャンバに加えられ、ホモゲネートのピペットが均一な組織分布を確保するためにホモゲネートを混合しながら各チャンバに一度に1ミリリットルを加えられていると仮定する。
F4 をクリックしてイベントの名前とタイムスタンプを指定し、[問題] をクリックします。鈍い18ゲージの針を使用して、酸素タンクからの酸素で50ミリリットルの注射器をレギュレータとガスチューブで満たします。酸素をチャンバーに直接注入し、約500マイクロモル酸素に過酸素化します。
緩くストッパーを挿入し、酸素が約480マイクロモルに達するまで閉じるのを待ちます。ねじれ運動で、チャンバーをゆっくりと閉じ、呼吸を約15〜20分間平衡させます。必要に応じて、ストッパーの中央キャピラリーをMiR05で充填します。
専用のマイクロシリンジを使用して、基質、アンカプラー、および阻害剤を完全に閉じたチャンバーに注入し、各チャンバのイベントにリアルタイムで名前を付けてタイムスタンプを付けます。F6 を選択して、酸素濃度と酸素勾配負のスケールを必要に応じて調整します。各注射後、水溶性化合物のシリンジを水で3回洗浄し、エタノール溶解化合物の場合は70%エタノールを洗浄します。
0.8モルのマルレートの5マイクロリットルを追加し、すぐに次の注入に進みます。注射注射器を水で3回洗います。すぐに5マイクロリットルの1モルピルビン酸を加え、呼吸が安定するのを待ちます。
注射器を洗浄した後、0.5モルADPの10マイクロリットルを加え、ADP応答が安定するのを待ちます。注射器を洗い、2モルグルタミン酸の5マイクロリットルを加え、呼吸が安定するのを待ちます。注射器を洗い、4ミリモルシトクロム-Cの5マイクロリットルを加え、呼吸が安定するのを待ちます。
注射器を洗浄した後、20マイクロリットルの1モルコハク酸を加え、呼吸が安定するのを待ちます。滴定は、1 ミリモルの FCCP の 0.5 ~1 マイクロリットル単位で、各注入後に呼吸が安定するまで待ちます。呼吸の増加がなくなるまで続けます。
注射注射器を70%エタノールで3回洗浄します。150マイクロモルロテロンの2マイクロリットルを追加し、呼吸が安定するのを待ちます。さらなる阻害がないことを確認するために、ロテノンの別の1マイクロリットルを追加します。
呼吸の減少がある場合は、呼吸の減少がなくなるまで追加の注射を続け、その後、70%エタノールで注射注射器を3回洗浄します。125マイクロモルアンチマイシンAの2マイクロリットルを加え、呼吸が安定するのを待ちます。さらに阻害されないように、もう1マイクロリットルのアンチマイシンAを加える。
呼吸の減少がある場合は、呼吸の減少がなくなるまで追加の注射を続けます。70%エタノールで注射器を3回洗います。チャンバーの酸素濃度を確認してください。
濃度が125マイクロモルを下回る場合は、室内の空気に再酸素化するか、酸素が呼吸束を制限しないことを確実にするために軽度の過酸素性を有する。0.8モルアスコルビンスの5マイクロリットルを追加します。70%エタノールで3回注射器を洗浄します。
0.2モルTMPDの10マイクロリットルをすぐに加え、呼吸の増加を待ちます。注射器をエタノールで洗浄した後、アスコルビン酸TMPDプラトウスの呼吸束が速いときに、直ちに25マイクロリットルの4モルナトリウムアジドを加える。ファイル、保存、切断をクリックして終了します。
ホモジネートの組織のミリリットル当たり40ミリグラムが急速な酸素枯渇をもたらしたことが観察された。酸素消費量は、組織ホモジネートのミリリットル当たり30ミリグラムと20ミリグラムで大幅に減速したが、基質またはADPが存在しない場合でも短時間で急速に減少した。組織ホモジネートのミリリットル濃度あたり10ミリグラムは、最適な酸素消費率をもたらした。
SUITプロトコルは、NADHとコハク酸結合酸化リン酸化および電子移動、ならびに複合体IV活性を評価するために使用された。シトクロムC放出は、ピルビン酸およびマレート、またはコハク酸塩およびロテノーンの存在下で評価され、両者はホモゲネート調製物がミトコンドリアに損傷を与えなかったことを明らかにした。また、EO771腫瘍ではNADH結合酸化リン酸化がごくわずかであることがわかった。
FCCPが最大電子流を駆動する滴定は、EO771腫瘍において、酸化ではなくリン酸化が呼吸に限定されていることを明らかにした。腫瘍ホモジネート呼吸プロファイルは、腫瘍内のNおよびS結合基質によって支持される減少した最大電子伝達を除いて、非移植されたジジコニン透過性EO771細胞のものと類似していた。コハク酸塩の呼吸運動は、最大速度が達成されるまでADPをサブサレーションする段階的な滴定によってさらに評価した。
コハク酸とロテノーンの存在下でのADPの半最大濃度は37.5マイクロモルであったのに対し、最大速度は1ミリグラム当たり約10.5ピコモール/秒であった。ルーチンケアで設置された機器や組織の取り扱いは、これらの実験の成功にとって非常に重要です。これらの手順に従って、レート正規化に対する他の質量またはマーカー固有のアプローチを、関心のある質問に基づいて適用できます。
一般的な対策としては、クエン酸合成酵素の総タンパク質定量と酵素活性が含まれますが、モデルシステム、統計設計、研究問題によって異なります。
