Este estudo é totalmente suportado pela divisão de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de enfermagem pesquisas de NIH, Bethesda, Maryland.

O estudo atual (NCT00852111) foi aprovado por institucional Review Board (IRB) do National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Os participantes inscritos no presente estudo foram homens euthymic, 18 anos de idade ou mais velhos, que foram diagnosticados com câncer de próstata não-metastático, com ou sem prévia prostatectomia e estava programado para receber a terapia de radiação de feixe externo (RT). Potenciais participantes foram excluídos se eles tinham uma doença progressiva que pode causar fadiga significativa, doença psiquiátrica dentro dos últimos cinco anos, tive hipotireoidismo não corrigido ou anemia, ou tinha uma segunda malignidade. Indivíduos que usavam sedativos, esteroides ou agentes anti-inflamatórios não-esteroides também foram excluídos. Amostras de sangue de controle saudáveis foram obtidas na medicina NIH departamento de transfusão de doadores saudáveis sob um protocolo aprovado IRB (NCT00001846). Todos os participantes são recrutados no Magnuson Clinical Research Center no NIH. Escrito assinados informado consentimentos foram obtidos antes da participação do estudo.
1. preparação de medição de função mitocondrial (1º dia do experimento)
<ol><li>Hidratar o cartucho do Sensor (ver Tabela de materiais; aproximada duração: 5 min).<ol>
<li>Retire o cartucho do Sensor da embalagem. Adicionar a solução de Calibrant 200 μL em cada poço da placa de utilidade e, em seguida, encha cada fosso com solução de Calibrant 400 μL.</li>
		<li>Placa de Sensor retorno para a placa de utilitário, que agora tem a solução de Calibrant nele. Hidrate o cartucho numa incubadora não-CO2 37 ° C durante a noite. Nota: O Sensor cartucho precisa ser hidratado por um mínimo de 4 h e máximo de 72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação da amostra clínico (2º dia do experimento)
<ol><li>Fadiga de medida usando o item de 13 funcional avaliação de doença terapêutica crónica - fadiga (FACIT-F)2,23,24 na linha de base (antes da iniciação de RT), ponto médio e conclusão de RT e 1 ano pós-RT.<ol>
<li>Use um 0 - 4 escala para cada resposta a um item, onde 0 representa "nada" e um 4 indica que o entrevistado refere-se à instrução correspondente "muito obrigado". Escores totais devem variar de 16-53, com menor pontuação refletindo fadiga de alta intensidade.</li>
		<li>Defina fadiga como uma contagem de FACIT-F inferior a 43, com uma pontuação de FACIT-F de ≥43, indicando ausência de ou de fadiga não clinicamente significativo2. Nota: O placar de 43 melhores FACIT-F divide escores de fadiga de pacientes com câncer e a população em geral2.</li>
		<li>Incluem os seguintes 13 itens da escala de fadiga FACIT: 1) sinto-me cansado; 2) Sinto-me fraco tudo acabado; 3) eu me sinto apático ("desbotada"); 4) Sinto-me cansado; 5) eu tenho dificuldade para iniciar as coisas, porque estou cansada; 6) eu tenho dificuldade para terminar as coisas, porque estou cansada; 7) tenho energia; 8) eu sou capaz de fazer minhas atividades habituais; 9) preciso dormir durante o dia; 10) eu estou cansado demais para comer; 11) preciso de ajuda para fazer minhas atividades habituais; 12) estou frustrado por estar muito cansado para fazer as coisas que quero fazer; e 13) tenho que limitar minha atividade social, porque estou cansado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolar o PBMC de amostras de sangue coletadas recentemente (aproximado de duração: 1h).<ol>
<li>Coletar 8 mL de sangue em um tubo de preparação de células mononucleares (ver Tabela de materiais). Nota: Amostras de sangue devem ser processadas até 2 horas após a coleta. A qualidade de PBMC pode ser comprometida se as amostras de sangue são processadas mais de 2h após a coleta da amostra.</li>
		<li>Centrifugar a 1.750 x g, durante 30 min à temperatura ambiente (18-25 ° C). Transferi a camada nublada para um tubo cônico de 15 mL. Adicionar até 15 mL de PBS e inverter 5 vezes.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Retire cuidadosamente e desprezar o sobrenadante sem perturbador da pelota. Ressuspender o sedimento com a adição de 10 mL de PBS e inverter 5 vezes.</li>
		<li>Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o líquido sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS. Transferi os PBMCs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 610 x g durante 10 minutos. Cuidadosamente Retire o sobrenadante e ressuspender em RPMI-1640 completo (RPMI-1640, suplementado com 10% FBS, 10mm penicilina/estreptomicina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revestimento de placas de célula para células não-aderente (aproximado de duração: 30 min).<ol>
<li>Preparar a solução adesiva de células e tecidos (ver Tabela de materiais) diluindo a solução estoque em bicarbonato de sódio de 0,1 M pH 8,0. A solução deve ser em 3,5 μg/cm2 de área de superfície. Nota: Esta solução contém proteínas de polifenólicos extraídas do marinho mexilhão, Mytilus edulis. Estas proteínas são componentes-chave da colagem secretada pelo mexilhão para ancorar-se às superfícies. Achamos que a célula-Tak funciona melhor com PBMC.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de solução diluída adesiva a cada poço e incubar durante pelo menos 20 min em temperatura ambiente. Lavar três vezes com água Desionizada e ar seco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mitocondrial função medição
<ol><li>Preparação de meios de ensaio (aproximado de duração: 10 min). Nota: Mídia de ensaio deve ser preparadas no dia do experimento.<ol>
<li>Adicione L-glutamina, piruvato e glicose à base de mídia (mesmos componentes como modificado águia de Dulbecco médio (DMEM), mas sem bicarbonato de sódio, glicose, glutamina ou piruvato de sódio) para fazer o ensaio de mídia. Aquecer a mídia a 37 ° C, então ajuste o pH para 7,4. Nota: As concentrações de glicose, piruvato e L-glutamina são geralmente as mesmas concentrações em meios de crescimento normal, mas podem ser ajustadas baseadas no ensaio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se para o teste de estresse de Mito PBMCs (aproximado de duração: 2h).<ol>
<li>Placa suficiente PBMCs do passo 2 para cada poço para alcançar a confluência de 80-90%. Em nossa experiência, de 1,5 x 105 células/poço produziu os resultados mais consistentes. Nota: Poços A e H são poços de fundo e devem conter apenas meios de ensaio com nenhuma célula. Em poços B a G, recomendamos chapeamento poços de pelo menos 3-6 por amostra do paciente para dar conta valores atípicos.</li>
		<li>Gire os pratos para baixo a 200 x g por 2 min permitir que as células aderir ao fundo dos poços. Lave as células uma vez com mídia de ensaio. Nesta etapa remove soro e bicarbonato de sódio a mídia de crescimento. Nota: Na nossa experiência, a etapa de lavagem remove tipicamente 20-30% das células.</li>
		<li>Adicione mídia de ensaio 180 µ l em cada poço, incluindo poços de fundo A e H. Incubar em uma incubadora de 37 ° C não-CO2 por 45-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executando o teste de Stress do Mito<ol>
<li>Reconstitua drogas no Mito Stress Kit com mídia de ensaio da seguinte forma:<ol>
<li>Oligomicina: Adicione mídia de ensaio μL 252 dentro do frasco para gerar uma solução stock de 50 μM.</li>
			<li>FCCP: Adicione 288 μL de mídia de ensaio dentro do frasco para gerar uma solução stock de 50 μM.</li>
			<li>Antimycin A / rotenona: Adicionar 216 μL de mídia de ensaio dentro do frasco para gerar uma solução stock de 25 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vórtice reconstituído drogas durante aproximadamente 1 minuto. Dilua em soluções de trabalho. Nota: As concentrações das soluções de trabalho devem ser tituladas e pre-determinadas antes do experimento, dependendo do tipo de célula. Por PBMC, encontramos que 1 μM de oligomicina, 1 μM Compararia e 0,5 μM antimycin A / o melhor trabalho de rotenona.</li>
		<li>Pipete as drogas para cada porta no cartucho sensor sequencialmente:<ol>
<li>R: Porto pipeta 20 μL de 10 μM oligomicina, para uma concentração final de 1 μM em cada poço.</li>
			<li>Porta b: pipeta 22 μL de 10 μM Compararia, para uma concentração final de 1 μM em cada poço.</li>
			<li>C Porto: Pipeta 25 μL de 5 μM antimycin A / rotenona para uma concentração final em cada poço de 0,5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione "teste de estresse do Mito" um instrumento de fluxo extracelular. Siga o prompt de instrumento e insira o cartucho de sensor. O aparelho executará automaticamente a calibração do sensor. Insira a placa de células após a calibração do sensor e o instrumento vão terminar o resto do ensaio. Dinâmica de oxigênio é medida a 530 nm (excitação) / 650nm (emissão), e a concentração de prótons é medida a 470 nm (excitação) / 530 nm (emissão).</li>
</ol>4. normalização de dados função mitocondrial
<ol><li>Preparar a solução de ensaio de proliferação de células (aproximado de duração: 5 min).<ol>
<li>Adicionar 48 mancha de ácido nucleico μL (500 x) e supressor de fundo 240 μL a 11,7 mL de PBS (2x). A mancha de ácido nucleico é um corante de ligação a DNA a célula-permeant, e o supressor de fundo é um corante de mascaramento que bloqueia as células mortas ou células com integridade comprometida da membrana celular de ser manchado. A combinação entre o corante de ligação a DNA e o supressor de fundo garante que as células só ao vivo estão manchadas.</li>
		<li>Adicione igual volume de solução de trabalho (180 μL) de 2x diretamente no meio de cada poço após o teste de estresse do Mito foi concluída.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar as células na presença de solução de ensaio de proliferação de célula em uma incubadora de 37 ° C por 45-60 min Quantify o número de células vivas (fluorescente) em um leitor de placa no 508 nm (excitação) / 527 nm (emissão) e normalizar dados OCR (aproximado de duração: 10 min) . Nota: além da números células vivas, os usuários podem também optar normalizar seus dados com o número total de células, a quantidade de ácido nucleico, as concentrações de proteína, etc.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+determination+of+cell+number+using+the+CyQUANT&#174;+cell+proliferation+assay.">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT&#174; cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li><li>Hartman, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus.">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Fadiga em pacientes com câncer é uma condição debilitante que não está bem definida ou caracterizada1. Diagnóstico da fadiga depende inteiramente subjetivo relatórios e não há nenhum padrão atual de diagnóstico ou tratamento para essa condição, em grande parte devido à falta de entendimento em sua Patobiológico2. Dos propostos mecanismos subjacentes fadiga em pacientes com câncer, deficiência na função mitocondrial é uma das vias mais terapeuticamente t...

A fadiga é uma condição prevalente e angustiante que tem um impacto negativo sobre a qualidade de vida dos pacientes de câncer1. Até esta data, fadiga de câncer permanece mal definida e depende apenas de comunicação subjetiva pelos pacientes2. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar um teste de laboratório de diagnóstico facilmente adaptável para caracterizar objectivamente fadiga no ambiente clínico3,4.
Vários mecanismos subjacentes, incluindo disfunção da mitocôndria, têm sido propostos para causar fadiga5. As mitocôndrias são as organelas de potência, fornecendo a 95% das necessidades de energia celular através da fosforilação oxidativa e desempenham um papel importante na sinalização de cálcio, apoptose, sinalização imune e regulamento de outros de eventos de sinalização intracelular6 . Da mesma forma, prejudicada bioenergética mitocondrial e defeitos na produção de energia podem contribuir para fadiga. Apoiam esta hipótese, estudos anteriores observaram mutações no DNA mitocondrial em pacientes com síndrome de fadiga crônica7. Enquanto isso ainda não está claro se a origem fisiopatológico da fadiga encontra-se dentro do sistema nervoso central ou periféricos tecidos, como músculos esqueléticos8,9, não existe actualmente nenhum método directo para avaliar com precisão disfunção mitocondrial relacionada à fadiga em células vivas, desoxigenadas.
Usando células mononucleares de sangue periférico (PBMC) para estudar a função mitocondrial oferece várias vantagens. Primeiro, PBMCs estão prontamente disponíveis na prática clínica usando flebotomia padrão e podem ser isolados rapidamente utilizando técnicas básicas de laboratório. Em segundo lugar, coleta de sangue é menos invasiva do que a coleta de outros tecidos como uma biópsia muscular. Assim, amostras de sangue podem ser coletadas do paciente mesmo várias vezes ao longo do tempo, o que facilita a avaliação longitudinal dos efeitos do tratamento. Curiosamente, função mitocondrial em PBMCs aparenta ser bem correlacionados com status mitocondrial de rim em um modelo animal de10. Além disso, mitocôndrias de células imunes tem sido usadas como um proxy para detecção de alterações sistêmicas sob condições de diferentes doenças11,12. Mitocôndrias nas células do sistema imunológico de circulação são particularmente sensíveis a mudanças nas funções imunes e imune de sinalização moléculas tais como citocinas13,14,15. Por exemplo, tem sido observado que PBMC de pacientes com doenças inflamatórias reumáticas agudas apresentam alta de base de consumo de oxigênio14. Em contraste, o consumo de oxigênio foi reduzido em PBMCs isoladas de pacientes com condições inflamatórias sistémicas, incluindo sepse16. Sob condições inflamatórias, radicais livres produzidos por mitocôndrias disfuncionais pode contribuir mais elevado estresse oxidativo e inflamação prolongada17. O papel central da mitocôndria na produção de energia, bem como em estresse oxidativo sugere o potencial utilitário de usando a função mitocondrial como um proxy para o estudo de fadiga em pacientes de câncer 13.
Estudos anteriores, examinando a função mitocondrial utilizaram técnicas bioquímicas, medição do potencial de membrana mitocondrial ou isolamento de populações de células específicas que não podem ser facilmente adaptável ao ambiente clínico5, 14,18. Nos últimos anos, o desenvolvimento de ensaios de fluxo extracelular permitiu aos pesquisadores facilmente e com precisão, examinar as mudanças na taxa de consumo de oxigênio (OCR) em resposta às injeções automatizadas de inibidores respiratória19,20 , 21 , 22. no entanto, a maioria desses estudos é projetada para tipos específicos de células e o grande formato de alto rendimento pode não ser aplicável em um ambiente clínico. Este manuscrito, descrevemos um protocolo otimizado para examinar a função mitocondrial para uso clínico.

<table><tbody><tr><td>CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>For isolating PBMCs following phlebotomy</td></tr><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>For hydrating cartridges</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td></tr><tr><td>XF base media</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>For measuring mitochondrial function in live cells</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr></tbody></table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

A fadiga é um comum e debilitante condição que afeta a maioria dos pacientes com câncer. Até à data, restos de fadiga mal caracterizados com nenhum diagnóstico teste para medir objetivamente a gravidade dessa condição. Aqui nós descrevemos um método otimizado para avaliar a função mitocondrial de PBMC coletadas de pacientes com câncer fatigados. Usando um sistema compacto fluxo extracelular e injeção sequencial de inibidores respiratórias, examinamos estado funcional mitocondrial de PBMC medindo basal respiração mitocondrial, capacidade respiratória e fenótipo de energia, que descreve a via preferencial de energia para responder ao estresse. PBMCs frescos estão prontamente disponíveis na prática clínica usando padrão flebotomia. O ensaio todo descrito neste protocolo pode ser concluído em menos de 4 horas sem o envolvimento de técnicas bioquímicas complexas. Além disso, descrevemos um método de normalização que é necessário para a obtenção de dados podem ser reproduzidos. Os métodos de procedimento e normalização simples apresentados permitem para coleta de amostra repetida do mesmo paciente e geração de dados reprodutíveis que podem ser comparados entre os pontos de tempo para avaliar os efeitos potenciais do tratamento.

O teste de estresse de Mito baseia-se em medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) após injeção sequencial de vários inibidores respiratórias para mapear um perfil mitocondrial completo. Medições de OCR após cada injecção de droga pode ser usada para calcular os seguintes parâmetros relacionados com a saúde mitocondrial: OCR Basal mede-se primeiro antes de qualquer injeção de drogas para avaliar o consumo de oxigênio necessário para atender a demanda de A...

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Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.

Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K visualizações.  National Institutes of Health. Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.

Vídeo: Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Pesquisa do câncer

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of current interventions to adequately treat fatigue in all patients leaves a need for new treatment options. Despite the therapeutic need and importance of preclinical research in helping identify promising novel treatments, few preclinical assays of fatigue are available. Moreover, the most common preclinical assay used to assess fatigue-like behavior, voluntary wheel running, is not suitable for use with some strains of mice, may not be sensitive to drugs that reduce fatigue, and has relatively low throughput. The current protocol describes a novel, non-voluntary preclinical assay of fatigue-like behavior, the treadmill fatigue test, and provides evidence of its efficacy in detecting fatigue-like behavior in mice treated with a chemotherapy drug known to cause fatigue in humans and fatigue-like behavior in animals. This assay may be a beneficial alternative to wheel running, as fatigue-like behavior and potential interventions can be assessed in a greater number of mice over a shorter time frame, thus permitting faster discovery of new therapeutic options.

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

A esteira de fadiga de teste: Um ensaio simples, de alta taxa de transferência de Fadiga-like Comportamento para o Mouse

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

Comportamento

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule synthesis. Genetic and functional adaptations of mitochondria to the tumor environment drive proliferative and metastatic potential. The advent of DNA and RNA sequencing removed critical barriers to the evaluation of genetic mediators of tumorigenesis. However, to date, methodological approaches to evaluate tumor mitochondrial function remain elusive and require technical proficiency limiting the feasibility, ultimately diminishing diagnostic and prognostic value in both experimental and clinical settings. Here, we&#160;outline a simple and rapid method to quantify rates of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and electron transfer (ET) capacity in freshly excised solid tumor homogenates using high-resolution respirometry. The protocol can be reproducibly applied across species and tumor types as well as adapted to evaluate a diversity of mitochondrial ET pathways. Using this protocol, we demonstrate that mice bearing a luminal B mammary cancer exhibit defective nicotinamide adenine dinucleotide-linked respiration and reliance on succinate to generate adenosine triphosphate via OXPHOS.

We developed a practical protocol and analytical approach to evaluate mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transfer capacity in fresh tumor homogenates. This protocol can be easily adapted to survey various mitochondrial functions that contribute to cancer initiation, progression, and treatment response.

Determinação Analítica da Função Mitocondrial de Homogeneiza tumor sólido excisado

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Geração de cíbridos transmitocondriais a partir de células cancerígenas em suspensão

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

Autor em destaque: Geração de cíbridos transmitocondriais usando linhas de células cancerígenas  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Bioquímica

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Medicina

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Imunologia e Infecção

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic disease. Although the etiology of age-related physical disability is complex and multifactorial, the decline in mitochondrial function appears to coincide with the progression of functional decline in many older adults. The reason why there is a decrease in mitochondrial function with aging remains elusive, but emerging science indicates that both fuel metabolism and circadian rhythms can influence mitochondrial function.
Recent studies have established that circadian rhythms become disturbed with aging, and that disrupted circadian rhythms have pathological consequences that impact mitochondrial function and overlap with many age-associated chronic diseases. Current quantitative methods for direct assessment of mitochondrial function are invasive and typically require a muscle biopsy, which can pose difficulties with participant recruitment and study adherence, given the perceived levels of potential pain and risk. Thus, an innovative and relatively noninvasive protocol to assess changes in mitochondrial function at the cellular level and circadian patterns in older adults was adapted. Specifically, a real-time metabolic flux analyzer is used to assess the mitochondrial bioenergetic function of white blood cells under differential substrate availability.
The expression of circadian clock genes in white blood cells to cross-correlate with the mitochondrial bioenergetics and circadian rhythm outcomes are also analyzed. It is believed that these innovative methodological approaches will aid future clinical trials by providing minimally invasive methods for studying mitochondrial substrate preference and circadian rhythms in older adults.

A novel and minimally invasive protocol is presented to evaluate the synergistic impact of fuel utilization and circadian rhythms on aging individuals, utilizing peripheral blood mononuclear cells.

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic ...

Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

Resumo

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Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária

A esteira de fadiga de teste: Um ensaio simples, de alta taxa de transferência de Fadiga-like Comportamento para o Mouse

Determinação Analítica da Função Mitocondrial de Homogeneiza tumor sólido excisado

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults