本研究は、学内研究部門の国立看護学研究所 NIH は、ベテスダ、メリーランド州のによって完全にサポートされます。

(NCT00852111) の現在の研究は、制度レビュー委員会 (IRB) の国立研究所の健康 (NIH)、ベテスダ、メリーランド州で承認されました。参加者が本研究に登録された euthymic 男性 18 歳以上年齢の人は非転移性前立腺がん以前前立腺摘除術の有無と診断され、された外部ビーム放射線療法 (照射線量) を受信する予定します。彼らは大きな疲労を引き起こす可能性のある進行性の病気を持っていた場合、潜在的な参加者が除外された過去 5 年以内に精神疾患があった、あった裸眼甲状腺機能低下症や貧血、または 2 番目の悪性腫瘍があった。非ステロイド系抗炎症剤やステロイド、鎮静剤を使用される方はまた除かれました。健常者の血液サンプルは、IRB 承認プロトコル (NCT00001846) の下で健康なドナーから NIH 輸血科で得られました。すべての参加者は、NIH のマグナソン臨床研究センターで募集しています。研究への参加前に署名された書面によるインフォームド同意が得られました。
1. ミトコンドリア機能測定準備 (実験の 1 日)
<ol><li>センサー カートリッジを水和物 (テーブルの材料のおおよその時間を参照してください: 5 分)。<ol>
<li>センサー カートリッジをパッケージから削除します。ユーティリティ プレートの各ウェルに 200 μ L Calibrant ソリューションを追加し、400 μ L Calibrant ソリューションで各堀を埋めます。</li>
		<li>センサー プレートを Calibrant のソリューションは、それ今ユーティリティ板に戻ります。非 CO2の 37 ° C の定温器でカートリッジを一晩メタンハイド レートします。 注: センサー カートリッジは 4 h の最小値と最大 72 h の水和を受ける必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 臨床試料 (実験 2 日目)
<ol><li>13 項目機能評価の慢性的な病気の治療 - 疲労 (FACIT F)2,23,24 (気管支腔内照射の開始) の前にベースライン、中点、気管支腔内照射、および 1 年間ポスト気管支腔内照射を用いた疲労を測定します。<ol>
<li>0 - を使用して各項目の応答、どこ 0「全然」を表し、4 は、申立人に関連している対応するステートメント「非常にします」を示します 4 スケール。合計スコアは、高疲労強度を反映して低いスコアを持つ範囲 16-53 でなければなりません。</li>
		<li>FACIT F スコアがなく臨床的に有意義な疲労2の有無を示す ≥43 の 43 より低い FACIT F スコアとして疲労を定義します。 注: FACIT F スコア 43 最高の疲労度ががん患者の一般的な人口2で除算します。</li>
		<li>FACIT 疲労尺度で以下の 13 項目が含まれます: 1) 私は疲れがある;2) 気が弱い一面。3) 私は脱力感を覚える、(「洗浄」);4) 私は疲れた。5) 問題; 疲れたから始めることがあります。6) 仕上げ; 疲れたから問題があります。7) 私はエネルギーがあります。8) 私は私の通常の活動を行うことができます。9) 私は一日中にスリープする必要10) 私は疲れていたので食べる。11) 私は私の通常の活動をやって助けを必要12) 私のやりたい事をして疲れすぎていてイライラします。13) 私は疲れたため社会的活動を制限する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>新鮮血液サンプルから PBMC を分離 (おおよその期間: 1 h)。<ol>
<li>単核細胞調製管に 8 mL の血液を収集 (材料の表を参照してください)。 注: コレクションの 2 時間以内の血液サンプルに処理されます。血液サンプル サンプル採取後 2 h 以上で処理される場合、PBMCs の質が妥協されることがあります。</li>
		<li>部屋の温度 (18-25 ° C) で 30 分間 1,750 × g で遠心分離機します。曇りの層を 15 mL の円錐管に転送します。最大 15 mL の PBS を追加し、5 回を反転します。</li>
		<li>4 ° C で 15 分間 300 × g で遠心します。慎重に削除し、不穏なペレットなし上澄みを廃棄します。再 10 mL、PBS を追加することでペレットを中断し、5 回を反転します。</li>
		<li>300 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上澄み液を破棄し、再 1 mL の PBS のセルを中断します。1.5 mL および microfuge の管に、PBMCs を転送します。</li>
		<li>610 x g で 10 分間遠心します。慎重に上清を除去し、完全な RPMI 1640 でペレットを再懸濁します (10% 添加 RPMI 1640 10 mM ペニシリン/ストレプトマイシン FBS)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>非付着性のセルのセル板をコート (おおよその時間: 30 分)。<ol>
<li>細胞・組織の接着ソリューションを準備 (材料表参照) 0.1 M 炭酸水素ナトリウム pH 8.0 で原液を希釈することによって。作業ソリューションは、表面積の 3.5 μ g/cm2をする必要があります。 注: このソリューションには、ムラサキイガイ、イガイから抽出されたポリフェノールのタンパク質が含まれています。これらのタンパク質は、表面に自分自身を固定するムール貝によって分泌される接着剤のキー コンポーネントです。我々 は、セル徳 PBMCs の最高の作品を見つけます。</li>
		<li>各ウェルに希釈した接着剤溶液 100 μ L を追加し、室温で 20 分間インキュベートします。・ ディ ・水と空気で 3 回洗って乾燥。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ミトコンドリア機能測定
<ol><li>アッセイ媒体の作製 (おおよその時間: 10 分)。 注: 分析メディアは、新鮮な実験の日に準備されなければなりません。<ol>
<li>L-グルタミン、ピルビン酸、およびブドウ糖メディア (同じ成分ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) が、重炭酸ナトリウム、ブドウ糖、グルタミン、やピルビン酸ナトリウム) をベースにしてアッセイのメディアを追加します。メディアをウォーム アップ 37 ° c、7.4 に pH を調整します。 メモ: グルコース、ピルビン酸、L-グルタミンの濃度は、通常、通常成長媒体中の濃度と同じが分析に基づいて調整することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>水戸ストレス テストに備えて PBMCs (おおよその時間: 2 時間)。<ol>
<li>80-90% の confluency に到達する各ウェルにステップ 2 から十分な PBMCs をプレートします。我々 の経験では、105細胞/ウェル x 1.5 は、最も一貫性のある結果を得られました。 注: 井戸 A と H は、背景井戸しかない細胞アッセイ メディアを含める必要があります。井戸 B G、外れ値を考慮するために患者のサンプルあたりの少なくとも 3-6 ウェルズをめっきすることをお勧めします。</li>
		<li>井戸の底に付着する細胞を許可するように 2 分間 200 x g でプレートをスピンダウンします。アッセイのメディアで一度セルを洗浄します。この手順では、血清と炭酸水素ナトリウムが成長媒体から削除します。 注: 我々 の経験で洗浄のステップ、通常細胞の 20-30% に削除します。</li>
		<li>45-60 分の非 CO2の 37 ° C 定温器で背景井戸 A および h. 加温を含む、各ウェルに 180 μ L 測定メディアを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>水戸のストレス テストを実行します。<ol>
<li>アッセイ メディアで水戸ストレス キットで薬をとおり再構築します。<ol>
<li>オリゴマイシン: 50 μ M で原液を生成するバイアルに 252 μ アッセイ メディアを追加します。</li>
			<li>FCCP: 50 μ M で原液を生成するバイアルにアッセイ メディアの 288 μ L を追加します。</li>
			<li>アンチマイシン A/ロテノン: 25 μ M で原液を生成するバイアルにアッセイ メディアの追加 216 μ L。</li>
		</ol>
</li>
		<li>渦は、約 1 分の薬を再構成しました。作業ソリューションに希釈します。 注: 作業ソリューションの濃度を滴定、細胞の種類に応じて実験前にあらかじめ決められました。PBMCs、我々 は見つけるのオリゴマイシンその 1 μ M、FCCP、1 μ M、0.5 μ M アンチマイシン A/ロテノンは最高の作品します。</li>
		<li>センサー カートリッジの各ポートに順番に薬をピペットします。<ol>
<li>ポート a: ピペット 20 μ 10 μ M の 1 μ M の各ウェルに最終濃度のオリゴマイシン。</li>
			<li>1 μ M の各ウェルに最終濃度 10 μ M、FCCP のポート b: ピペット 22 μ L。</li>
			<li>ポート c: 5 μ M アンチマイシン A のピペット 25 μ L/0.5 μ M の各ウェルに最終濃度のロテノン。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞外フラックス計測器で「水戸ストレス テスト」を選択します。楽器のガイダンスに従うし、センサー カートリッジを挿入します。楽器は、センサーのキャリブレーションを自動的に実行されます。センサーの校正や計測器は、アッセイの残りの部分を終了後、セル板を挿入します。530 での酸素動態を測定 nm (励起)/650 nm (排出), 470 でプロトン濃度の測定と nm (励起)/530 nm (排出) します。</li>
</ol>4 ミトコンドリアの機能データの正規化
<ol><li>細胞増殖試験ソリューションを準備 (おおよその時間: 5 分)。<ol>
<li>11.7 mL PBS に 48 μ 核酸染色 (500 x) および 240 μ L 背景抑制を追加 (2 x)。核酸染色は細胞側の透過物 DNA 結合色素と背景抑制は死んだ細胞や染色されてから整合性が危険にさらされた細胞膜細胞をブロックするマスキング染料。DNA 結合色素と背景サプレッサーの組み合わせにより細胞のみが染色になります。</li>
		<li>水戸のストレス テストが完了した後、各ウェル内の媒体に直接作業ソリューション (180 μ L) x 2 の等量を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>45-60 分生きているセル (蛍光) 508 でプレート リーダーの数を定量化するための 37 ° C の定温器で細胞増殖アッセイ液の存在下で細胞をインキュベート nm (励起)/527 nm (排出) して OCR データを正規化する (おおよその時間: 10 分). 注: 数の生きているセルに加えてユーザーことができますセルの合計数、核酸、タンパク質濃度などの量を使用してデータを正規化します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy.">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li><li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy.">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li><li>Myhill, S., Booth, N. 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K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).</li><li>Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characterization+of+polarized+M1+and+M2+bone+marrow-derived+macrophages+using+real-time+extracellular+flux+analysis.">Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).</li><li>Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fatigue+and+other+anemia-related+symptoms+with+the+Functional+Assessment+of+Cancer+Therapy+(FACT)+measurement+system.">Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).</li><li>Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+important+differences+were+estimated+for+six+Patient-Reported+Outcomes+Measurement+Information+System-Cancer+scales+in+advanced-stage+cancer+patients.">Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).</li><li>Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).</li><li>Chacko, B. 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著者が明らかに何もありません。

がん患者における倦怠は、正しく定義されていませんまたは1を特徴と衰弱状態です。疲労の診断は全く主観的な報告に依存している、現在の診断基準や主にその競走2理解の欠如のため、この条件のための治療がないです。がん患者における倦怠の提案されたメカニズム、ミトコンドリアの機能障害が最も治療対象の経路の 1 つ。したがって、積極的に開?...

疲労は、1がん患者の生活の質にマイナスの影響は、普及していると悲惨な状態です。これまで、ガン疲労定義が不十分なまま、患者2で主観的な報告だけに依存しています。したがって、臨床設定3,4で疲労を客観的に特徴付けるため簡単に適応可能な診断検査を識別するために緊急の必要性があります。
疲労5を原因とするミトコンドリアの機能不全を含む複数の基になるメカニズムを提案されています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化を介した細胞のエネルギー需要の 95% を提供する発電所器官し、カルシウム シグナル伝達、アポトーシス、免疫シグナル伝達、他は細胞内のシグナル伝達イベント6の規制に重要な役割を果たす.したがって、障害ミトコンドリア生体エネルギーとエネルギー生産の欠陥に貢献するかもしれない疲労。この仮説をサポートするには、以前の研究は、慢性疲労症候群7患者におけるミトコンドリア DNA の変異を観察しています。疲労の病態生理学的起源は、中枢神経系や骨格筋8,9などの末梢組織内であるかどうかは不明のままがない現在を正確に評価する直接法ライブ、respiring 細胞の疲労に関連するミトコンドリアの機能障害。
末梢血単核球 (PBMCs) を使用して、ミトコンドリアの機能を研究するいくつかの利点を提供しています。まず、PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用してすぐに利用できる、基本的な実験技術を使用して迅速に分離することができます。第二に、採血は、筋生検等の組織を収集するよりも低侵襲です。したがって、血液サンプルを収集できます同じ患者から繰り返し治療効果の縦断的評価を容易にする時間をかけて。興味深いことに、PBMCs のミトコンドリアの機能は動物モデル10腎ミトコンドリアの状態とよく相関しているように見えた。さらに、免疫細胞のミトコンドリアは異なった病気の条件11,12の下での制度の変更を検出するためのプロキシとして使用されています。循環免疫細胞内のミトコンドリアは、特に免疫機能の変化に敏感と免疫シグナル分子サイトカイン13,14,15などです。たとえば、急性のリウマチ性の炎症性疾患患者から PBMCs が高いベースライン酸素消費量14を示すことが観察されています。対照的に、敗血症16を含む全身の炎症性疾患を持つ患者から分離された PBMCs の酸素消費量が減った。炎症性の条件の下で高い酸化ストレスと炎症17ミトコンドリアの機能不全によって生成されるフリーラジカルを貢献することかもしれないさらに。ミトコンドリア酸化ストレスと同様、エネルギー生産の中心的な役割は、がん患者13で疲労を勉強するためのプロキシとしてミトコンドリアの機能を使用しての潜在的な有用性を示唆しています。
ミトコンドリアの機能を調べる研究活用生化学的手法、ミトコンドリアの膜電位測定、または臨床設定5,に容易に適応できない可能性があります特定の細胞集団の分離14,18。近年、細胞外のフラックスの試金の開発研究者を簡単に許可しているし、正確に呼吸阻害剤19,20の自動注射に対する酸素消費量 (OCR) の変化を調べる,21,22します。 しかし、これらの研究のほとんどは、特定の細胞型の設計されています、高スループット大判を臨床場面に適用できない場合があります。本稿では臨床使用のためのミトコンドリアの機能を検査するための最適化されたプロトコルについて述べる。

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	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:331px;">CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">362761</td>
			<td style="width:257px;">For isolating PBMCs following phlebotomy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XF Calibrant Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103059-000</td>
			<td>For hydrating cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XF base media</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103335-100</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-037-CI</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103010-100</td>
			<td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C35011</td>
			<td>For quantification of live cells and data normalization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S7802AEA</td>
			<td>For measuring mitochondrial function in live cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTCYT5PV</td>
			<td>For quantification of live cells and data normalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

疲労は共通、ほとんどの患者に影響を与える条件を衰弱させます。これまで疲労残る悪い特徴ないの診断を客観的に測定するこの条件の重大度をテストします。ここで疲れのがん患者から採取した PBMCs のミトコンドリアの機能を評価するための最適化手法について述べる.基底のミトコンドリア呼吸、呼吸の余力を記述するエネルギーの表現型を測定することによって PBMC ミトコンドリア機能状態を検討した小型細胞フラックス システムと呼吸阻害剤の連続注入を使用して、ストレスに反応する最寄りのエネルギー経路。新鮮な PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用して容易に利用できます。このプロトコルで記述されている全体の分析は、複雑な生化学的手法の関与なし 4 時間未満で完了ことができます。さらに、再現性のあるデータを取得する必要がある正規化手法について述べる。同じ患者および潜在的な治療効果を評価する時のポイント間で比較することができる再現性のあるデータの生成から繰り返しサンプル収集できる簡単な手順と正規化方法を提示します。

水戸のストレス テストは、完全なミトコンドリア プロファイルにマップする様々 な呼吸阻害剤の逐次投与後酸素消費量 (OCR) の測定に依存します。ミトコンドリアの健康に関連する各注入剤は、次のパラメーターを計算する使用ことができます後の OCR 測定:基底 OCRはまず安静時レベルの ATP 需要を満たすために必要な酸素消費量を評価するために任意の?...

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Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。

がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K ビュー.  National Institutes of Health. 私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。

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Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

乳がん関連リンパ浮腫の超音波評価

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

がん研究

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

周辺照射による疲労のマウスモデル

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

オルガノイド培養を用いたマウス前立腺上皮細胞の分化能力の評価

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to interference with proper development and may even result in initiation or progression of cancers in certain cases. Because this pathway serves complex and versatile functions, it can be studied extensively through many different approaches. Of these, bioinformatics provides an undeniably cost-efficient, approachable, and user-friendly method of study. Bioinformatics is a useful way to extract smaller pieces of information from large-scale datasets. Through the implementation of various bioinformatics approaches, researchers can quickly, reliably, and efficiently interpret these large datasets, yielding insightful applications and scientific discoveries. Here, a protocol is presented for integration of bioinformatics approaches to investigate the role of Notch signaling in ovarian cancer. Furthermore, bioinformatics findings are validated through experimentation.

Bioinformatics is a useful way to process large-scale datasets. Through the implementation of bioinformatics approaches, researchers can quickly, reliably, and efficiently obtain insightful applications and scientific discoveries. This article demonstrates the utilization of bioinformatics in ovarian cancer research. It also successfully validates bioinformatics findings through experimentation.

卵巣癌におけるノッチシグナル伝達の役割を理解するためのバイオインフォマティクスアプローチと実験的検証の統合

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Measuring the Motor Aspect of Cancer-Related Fatigue using a Handheld Dynamometer

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on self-report questionnaires which are subject to report and recall biases. Objective measurements using a handheld dynamometer, or handgrip device, have been shown in recent studies to correlate significantly with subjective self-reported fatigue scores. However, variations of both the handgrip fatigue test and fatigue index calculations exist in the literature. The lack of standardized methods limits the utilization of the handgrip fatigue test in the clinical and research settings. In this study, we provide detailed methods for administering the physical fatigue test and calculating the fatigue index. These methods should supplement existing self-reported fatigue questionnaires and help clinicians assess fatigue symptom severity in an objective and quantitative manner.

Simple and accessible methods were developed to measure the motor aspect of cancer-related fatigue objectively and quantitatively. We describe, in detail, ways to administer the physical fatigue test using a simple handgrip device as well as methods to calculate fatigue indices.

ハンドヘルドダイナモメーターを用いた癌関連疲労の運動面の測定

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...