Name: stiffness measurement of soft silicone substrates for mechanobiology studies using a widefield fluorescence microscope
Uploaded: 2018-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope at JoVE.com

マーガレット ・ ガルデルにありがとう寛大、レオメータの使用を許可します。我々 はこの作業を有効に NIH (1R15GM116082) からの支援を認めます。

1. 柔らかいシリコーン基板の作製
<ol><li>A コンポーネントの B コンポーネントの 1.75 g 1.75 g を量り (A:B = 1:1) (ポリスチレン) を使用して柔らかいシリコーンのエラストマー キットからトレーの重量を量るします。</li>
	<li>A コンポーネントを計量トレイ内の B コンポーネントに追加し、適切なアプリケータのスティックを使用して 5 分間一緒にそれらをミックスします。</li>
	<li>35 mm のペトリ皿に上記の混合物を追加します。分のカップルのためのペトリ皿で均等に混合物を許可します。 注: シャーレの直径と柔らかいシリコーンの量の選択は柔らかいシリコーンの厚さを決定します。ここでは、厚さ約 3.5 mm になりますディスカッションセクションでエラストマーの厚さを選択することについての詳細。</li>
	<li>空気の泡を削除に 15 分間、真空チャンバー内で、ふた付きのシリコーンの混合物でシャーレを配置します。この時間の間に 70 ° C にホット プレートを予熱します。</li>
	<li>ホット プレートでは、70 ° C に達すると、上にスライド ガラスを置く、スライド ガラスにシリコーン混合物でシャーレを置きます。シリコーンを聞かせて 30 分 70 ° C で治療。ペトリ皿を溶かす可能性がありますと、ホット プレート上で直接ポリスチレンの皿を置かないでください。</li>
</ol>2. 柔らかいシリコーンを蛍光マイクロ ビーズの結合
<ol><li>深い UV 商工会議所 (185 および 254 nm の光の波長から deep UV ランプとエンクロージャ) に (明らかにペトリ皿) でなめされた柔らかいシリコーンを配置します。5 分間深い紫外線に柔らかいシリコーン サンプル (UV ランプから 5 ~ 10 cm) を公開します。<ol>
<li>シリコーンは、深い紫外線にさらされている、間 2.2 2.6、次の手順に進みます。深い紫外線照射後サンプルを取得する前に、少なくとも 5 分間深い UV 容器をドガします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一方で、19 mg 1.5 mL 遠心チューブに 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) の重量を量り、500 μ L の脱イオン水 (DI) を追加します。軽くチューブを揺することによって、EDC を溶解します。</li>
	<li>別 1.5 mL 遠心チューブに 11 mg Nhydroxysulfosuccinimide (スルホ-NHS) の重量を量り、DI 水の 500 μ L を追加し、チューブを優しく揺することによってスルホ NHS を解散します。単一微量遠心チューブの EDC とスルホ NHS のソリューションを結合します。</li>
	<li>この EDC/スルホ-NHS ソリューション (1 %w/v のストック濃度) と 30 μ L 0.44 μ m 径赤 (または蛍光顕微鏡で使用できるフィルター キューブに基づいて他の蛍光色) の変更されたカルボン酸蛍光ビーズを追加します。</li>
	<li>EDC/スルホ-NHS/ビーズの混合物に追加コラーゲンの 0.02 mg (ラット尾ストック濃度 0.02 M 酢酸溶液に 4 mg/mL) から約 0.02 mg/mL の濃度を取得します。</li>
	<li>渦 EDC/NHS/ビーズ/コラーゲン私混合物に簡単にビーズが結合する前に均等に、幅広く分散されてことを確認します。</li>
	<li>ピペット 1 mL EDC/NHS/ビーズ/コラーゲンの私 (小径) の別の浅い、フラット蓋の上に置かれたパラフィルムの部分に混合物。柔らかいシリコーン表面混合物の連絡先が以下より小さいシャーレの蓋の表面に直接触れないこの混合物で柔らかいシリコーンのペトリ皿を反転します。倒立のペトリ皿を高めるためには、倒立ペトリ皿スペーサーの両側の下で 1 つまたは 2 つのスライド ガラスを使用します。 注: は、2.7 の手順の実行方法を確認は、図 1を参照してください。</li>
	<li>アルミ箔でサンプルをカバーし、30 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>柔らかいシリコーンのペトリ皿を取り外して縦置きにセット (シリコン側を)。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) が付いている柔らかいシリコーン表面を洗って皿に 2 mL の PBS (pH 7.4) を追加することによって。分のカップルのために座ってみましょう。PBS を離れて吸い出しなさい、2 mL の PBS と再度シリコーンを洗ってください。シリコーンの治療法さらに約一日をしましょう。そのため、一晩柔らかいシリコーン サンプル PBS で 37 ° C で。</li>
</ol>3. 広視野蛍光顕微鏡を用いた球圧子押込みとシリコーン剛性の測定
<ol><li>柔らかいシリコーンのペトリ皿を取得し、少なくとも 1 mL の PBS シリコーン表面液体表面の下数 mm を持っているが含まれていることを確認します。</li>
	<li>柔らかいシリコーンの 5 1 mm ジルコニウム球体球面の曲率半径をドロップ先の尖ったピンセットを使用します。液体培地に球を浸すし、シリコン層と他の球面の曲率半径の場所から少なくとも 5 圧子直径の端から離れて、それらをドロップします。 注: 液体表面上にドロップ、球が失敗液体培地 (float) を入力する液体培地の表面張力に起因します。</li>
	<li>基本ペトリ皿をイメージすることが可能だ、顕微鏡ステージ上柔らかいシリコーンのシャーレを配置します。</li>
	<li>位相イメージングを用いた 10 × 対物 (乾燥 10 X など na 0.30 客観的)、検索、球圧子を焦点に持って来る。</li>
	<li>一部の位相画像または押しつけて全体を取る、このイメージを保存します。利用可能な場合は、タイル スキャンを使用します。決めに任意の目に見える欠陥がある場合は破棄し、別圧子を置き換えます。</li>
	<li>ライブ位相イメージングの下圧子のエッジの左にパンしてフレームの左端が少なくとも ~1.5 R 圧子センターからの距離。押しつけてセンターままイメージ フレームの右端に近い右側に表示を確認します。段階の画像を撮影し、それを保存します。</li>
	<li>顕微鏡光源を赤の蛍光チャンネルに照明に切り替えます。Xとy-球圧子の中心の下で赤の蛍光マイクロ ビーズまで (△ Z) をそのまま座標 ( x- 圧子センター内、フレームの右端近くのy位置)、フォーカスピントだけ行きます。</li>
	<li>(画像のフレームの左端) 近く決めからシリコンの最上層で、ミクロ粒子のニキビトリートメント行くピントまで 0.5 μ m のすべての z の増分のイメージで z を取る。</li>
	<li>他球面の曲率半径のサンプルと 3.4 3.8 の手順を繰り返します。</li>
</ol>4. シリコーンの剛性 (ヤング率) を計算します。
<ol><li>ImageJ、線ツールをクリックを使用して押しつけて位相画像を開き、ピクセルの圧子の直径を測定します。圧子エッジ上の点のクリックしてそして把握は端に正反対のポイントにカーソルを移動し、カーソルを解放する前に ImageJ のメイン ウィンドウのステータス バーに表示されるピクセル単位の長さに注意してください。<ol>
<li>分析をクリックして長さの単位がピクセルに設定されていることを確認 |縮尺を設定と長さの単位を確認します。</li>
		<li>対物レンズと CCD カメラのピクセル サイズを考慮した圧子の半径 (ピクセル単位) を μ m に変換 (μ m で R = R 画素 CCD カメラ μ m ピクセル サイズ ×/対物レンズの倍率)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ファイルをクリックして、ImageJ でビーズ画像の赤のチャネル z スタックを (場合、ミクロ粒子のニキビトリートメント赤色蛍光) 開く |インポート |シーケンス画像スタック内の任意の画像を選択し、スタックを開くには[ok]をクリックします。 注: F1 は圧子センターの下のマイクロ ビーズは、最高の可能なフォーカスと F2 はフレームの左端付近 (~1.5 R ビーズの所の地域) でのマイクロ ビーズが最高の可能なフォーカスにはフレーム番号、フレーム番号です。Z-2 つのフレームの違いは、インデントの深さ δ。<ol>
<li>ImageJ で [線] ツールを使用して、線を描くイメージで明確に定義されたビーズ。のクリックを分析 |プロファイルをプロットしながら別のフレームを選択するビーズの間で更新されたライン スキャン強度を取得するライブボタンをクリックします。フォーカスのフレームとしては、最大強度の高い値を与えるフレームを選択できます。</li>
		<li>Z スタックにフレーム間の z インクリメントは 0.5 μ m なので計算 δ として μ m でインデントの深さ = (F2 F1) × 0.5。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(マイナス相手浮力の力)、重量のため圧子によってはゲルに及ぼす力を計算、インデントは (押しつけて - 液体媒体の密度の密度) × 重力加速度 × 圧子のボリュームとして F を強制します。 式Fを使用します (4/3) x = (ρ圧子- ρ媒体) x (R3) x 3.142 g Rは、圧子の半径 x ρ圧子が決め、ρ媒体の密度液体媒体の密度、 gは重力 (9.81 m/s2) 加速度。(N) でFを取得する SI 単位の右側にある [すべての数量を表現します。</li>
	<li>変更された11ヘルツ モデル12方程式を用いたシリコンのヤング率 (E) を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq1.jpg"> どこ： c = の後に続く; ヘルツ モデル表現を変更する補正係数 v = (非圧縮性材料70.5 として取られる); シリコーンゲルのポアソン比 F = 押込み力; R = 圧子半径;そして Δ = インデントの深さ。 ペンシルバニア州のEを取得する SI 単位の右側にある [すべての数量を表現します。<ol>
<li>3次のように補正係数cを計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq2.jpg"> どこ： <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq4.jpg">;そして <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq5.jpg">. この補正因子は特に柔らかいシリコーン接着性良好ペトリ皿 (または硬いシリコン) (ここでは) それの下にある場合にのみ使用することに留意。</li>
		<li>H 追加シリコーンとシャーレの直径の量に基づく柔らかいシリコーン層の高さを計算します。または、直接位相イメージングによる吸着シリコン層の上部と下部のサーフェスの z 座標を決定して h を得る (マイナーな不純物はいずれかのサーフェスで焦点に来る)。大きい h の (h2 > Rδ)、補正係数cは 1 に近い。</li>
	</ol>
</li>
	<li>それぞれの圧子の 4.1 4.4 の手順を繰り返します。シリコン サンプル平均のヤング率を取得するそれぞれの圧子から得られるヤング率を平均します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+Substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering.">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).</li><li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology.">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+cytoplasmic+domain+of+N-cadherin+reduces,+but+does+not+eliminate,+traction+force-transmission.">Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).</li><li>Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+methods+for+measuring+the+elasticity+of+gel+substrates+for+cell+culture:+microspheres,+microindenters,+and+atomic+force+microscopy.">Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy.</a> Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).</li><li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement.">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li><li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope.">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).</li><li>Hertz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Beru&#776;hrung+fester+elastischer+Ko&#776;rper.">&#220;ber die Beru&#776;hrung fester elastischer Ko&#776;rper.</a> Journal f&#252;r die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+a+direct+printing+protocol+using+deep+UVs.">Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs.</a> Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).</li><li>Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-intrusive+measurement+of+wall+shear+stress+in+flow+channels.">Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).</li><li>Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+tools+to+study+cellular+mechanotransduction.">Biophysical tools to study cellular mechanotransduction.</a> Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).</li><li>Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+sheet-averaged+tension+within+a+large+epithelial+cell+colony.">Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

球圧子押込み法は簡単に実装できるは、圧子の選択と柔らかいシリコーン サンプルの厚さに注意を支払わなければなりません。ヤング率の計算に使用される式が条件11の下で有効で、圧子半径の > 10% シリコン サンプルの厚さは、通常これらが満たさと < ~ 圧子半径 x 13。圧子半径は前記試料の厚さが高すぎるではない、良い選択をされた 5-10 x のシリコーンの厚さがわかっ?...

マイクロ環境の剛性は kilopascal の範囲で1ティッシュの培養皿の剛性が高いいくつかの注文の大きさとは対照的に軟組織の細胞が存在します。細胞外マトリックス蛋白質コーティング ソフト基板上のセルと初期実験を示した基板剛性が影響どのセル移動し同様、2、3の下に細胞外マトリックスに付着しています。実際には、基板の剛性は根本的に広汎性の生化学的なシグナルと同様の方法で細胞機能4を影響します。ポリアクリルアミドゲル (細胞外基質タンパク質でコーティング)、(水浸透) 細胞培養基板のメカノバイオロジー研究5として広く使用されているゲル。ポリジメチルシロキサン (PDMS)、最も一般的なシリコーン (ポリシロキサン)、広くとして使用されています硬いシリコン megapascal 範囲剛性を有するミクロン スケール製作6。さらに最近、柔らかいシリコーン基板もっと生理学的に関連する kilopascal の範囲の剛性は、メカノバイオロジー研究7,8細胞培養基板として採用されています。
原子間力顕微鏡、ストレッチ、レオロジー、およびインデントの使用球、球 microindentors9 をひっくり返した時に全てのサンプルの巨視的変形を含む、フレキシブル基板の剛性を測定するいくつかの方法が使用されています。.各テクニックには、独自の長所と短所がありますが、球とインデントはだけ広視野蛍光顕微鏡へのアクセスを必要とする特にシンプルでありながらかなり正確な方法です。金属球とインデントは前の仕事3,9,10でゲルの硬さを測定するために使用されています。基板剛性細胞運動の重要性を示した初期の作品には、ハイドロゲル基材剛性3を決定するこの方法が利用されています。最近では、共焦点顕微鏡は、エレガントな評価10で使用されています。
ここで、蛍光ビーズを結合ソフト シリコン基板を準備するためのステップ バイ ステップ プロトコルは提示 (とコラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白私)、上面にだけ位相イメージング インデント球とトップの表面を使用、蛍光イメージングは、それぞれ、そして最後には、シリコン基板のヤング率を計算する画像を解析します。この方法で準備、柔らかいシリコーン基板は、牽引力顕微鏡実験のために容易に使用できます。柔らかいシリコーンのベースとして (シャーレ) の代わりに硬いシリコンの使用外部ストレッチを用いたメカノバイオロジー研究ができます。ここで保証、起こりうる合併症を回避するために必要な実用的な考慮事項が示されています。

<table><tbody><tr><td>CY 52-276 A/B silicone elastomer kit</td><td>&amp;nbsp;Dow Corning</td><td>CY 52-276</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI22980</td><td>Store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Pierce Sulfo-NHS crosslinker</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-24510</td><td>Store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 &amp;micro;m, 2 mL</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>CFP-0558-2</td><td>Store at 4&amp;deg;C, do not freeze</td></tr><tr><td>1.0 mm Acid washed Zirconium beads</td><td>OPS Diagnostics LLC</td><td>BAWZ 1000-250-33</td><td></td></tr><tr><td>Deep UV chamber with ozone evacuator</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td>PSD-UV4, OES-1000D</td><td></td></tr><tr><td>Wide field fluorescence microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, from rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ImageJ-NIH</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>public-domain software</td></tr></tbody></table>

stiffness measurement of soft silicone substrates for mechanobiology studies using a widefield fluorescence microscope

人体の軟部組織は通常 kilopascal (kPa) 範囲で剛性をあります。したがって、生体内での条件を部分的に模倣物理的な微小環境で細胞を培養用便利な基板にシリコーン ・ ハイドロゲルのフレキシブル基板を証明されています。ここでは、通常メカノバイオロジー研究用等方線形弾性基板のヤング係数を特徴付けるための単純なプロトコルを提案する.シャーレや硬いシリコンの柔らかいシリコーン基板を準備、蛍光ビーズを用いたシリコン基板の上面をコーティング、蛍光イメージング (重力) による上面をインデントするミリメートル単位球を用いたプロトコルの構成します。インデントされたシリコンの表面に蛍光顕微鏡を用いたシリコン基板のヤング率を計算する結果の画像解析にビーズ。(蛍光ビーズ) に加えて係数細胞外マトリックス蛋白質と基板の上面を結合セルめっきと牽引力顕微鏡実験を使用してその後の研究に使用する容易にシリコン基板をことができます。硬いシリコン、シャーレの代わりに柔らかいシリコーンのベースとして使用する外部ストレッチを含むメカノバイオロジー研究の使用。 にします。このプロトコルの特定の利点は、この手順で必要な主要機器である一般に利用できる多くのラボでは、広視野蛍光顕微鏡です。異なる弾性率の柔らかいシリコーン基板のヤング率を測定することによってこのプロトコルを示す.

上記プロトコルを使用して、我々 35 mm ペトリ皿の柔らかいシリコーンを用意、70 ° C、30 分で硬化、蛍光マイクロ ビーズの結合 (コラーゲンと私) 上面図 1に示しますように。深紫は基板13結合最終的な蛋白質のため以前使用されています。ここで使用される養生条件、この柔らかいシリコーンに固有の (I)、(II) 圧痕計測は次?...

Watch this Scientific Journal Video about Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope at JoVE.com

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Kilopascal 範囲内の剛性を有する基板は、生理学的に関連するマイクロ環境剛性に対する細胞の反応の研究に有用。ちょうど広視野の蛍光顕微鏡を用いた、柔らかいシリコーンのゲルのヤングは適切な球でインデントを使用して決定します。

広視野蛍光顕微鏡を用いたメカノバイオロジー研究の柔らかいシリコーン基板の剛性測定

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

stiffness-measurement-soft-silicone-substrates-for-mechanobiology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K ビュー.  Old Dominion University. Kilopascal 範囲内の剛性を有する基板は、生理学的に関連するマイクロ環境剛性に対する細胞の反応の研究に有用。ちょうど広視野の蛍光顕微鏡を用いた、柔らかいシリコーンのゲルのヤングは適切な球でインデントを使用して決定します。

ビデオ: Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

生物工学

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

発生生物学

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

相間細胞核の力学特性を探査する生物物理学的なアッセイ：基板の歪みのアプリケーションおよびマイクロニードル操作

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

生物学

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell behavior such as cell function, differentiation, and motility. However, as these processes are not homogeneous throughout the whole organ, it has become increasingly important to understand changes in the mechanical properties of tissues on the cellular level.
To be able to monitor the stiffening of collagen-rich areas within the liver lobes, this paper presents a protocol for measuring liver tissue elastic moduli with high spatial precision by atomic force microscopy (AFM). AFM is a sensitive method with the potential to characterize local mechanical properties, calculated as Young&#39;s (also referred to as elastic) modulus. AFM coupled with polarization microscopy can be used to specifically locate the areas of fibrosis development based on the birefringence of collagen fibers in tissues. Using the presented protocol, we characterized the stiffness of collagen-rich areas from fibrotic mouse livers and corresponding areas in the livers of control mice.
A prominent increase in the stiffness of collagen-positive areas was observed with fibrosis development. The presented protocol allows for a highly reproducible method of AFM measurement, due to the use of mildly fixed liver tissue, that can be used to further the understanding of disease-initiated changes in local tissue mechanical properties and their effect on the fate of neighboring cells.

We present a protocol to measure the elastic moduli of collagen-rich areas in normal and diseased liver using atomic force microscopy. The simultaneous use of polarization microscopy provides high spatial precision for localizing collagen-rich areas in the liver sections.

原子間力顕微鏡と偏光顕微鏡を組み合わせた肝臓のこわばり測定

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

広視野蛍光顕微鏡を用いたメカノバイオロジー研究の柔らかいシリコーン基板の剛性測定

要約

さらに動画を探す

この動画の章

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

相間細胞核の力学特性を探査する生物物理学的なアッセイ：基板の歪みのアプリケーションおよびマイクロニードル操作

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

の剛性を測定します

原子間力顕微鏡と偏光顕微鏡を組み合わせた肝臓のこわばり測定

広視野蛍光顕微鏡を用いたメカノバイオロジー研究の柔らかいシリコーン基板の剛性測定

要約

さらに動画を探す

この動画の章

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

相間細胞核の力学特性を探査する生物物理学的なアッセイ：基板の歪みのアプリケーションおよびマイクロニードル操作

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

の剛性を測定します

原子間力顕微鏡と偏光顕微鏡を組み合わせた肝臓のこわばり測定

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化