Name: where you cut matters: a dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
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ブルターニュは、その技術支援のジェシカ Onyak、リュー親切に私たちは彼 epifluorescent 顕微鏡を使用させるために感謝したいと思います。サポートの確認: NIH R15EY026255-01 とカール ・ Kirchgessner 財団。

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著者が明らかに何もありません。

ない包括的な標準化されたプロトコルを確認し解剖学的スペースでマウス単離網膜の方向をラベリングされています。プロトコルの詳細ここで標準化することによって、この空白を埋めるしようと深い解剖学的ランドマークを使用する方法について詳しく説明するポイントを確実に参照として識別網膜の方向。このプロトコルの深い解剖学的ランドマークが角膜の火傷22など表面的なランドマークよりマウス網膜の方向付けのためのより正確で信頼性の高いメソッドを提供することが示されています。したがって、網膜の方向の角膜の火傷に頼ってきた研究にあったかもしれないより大きいエラー脈絡裂、腹直筋などのランドマークに頼ってきた研究よりも向き。この不一致は、結果を解釈し、正確な網膜の向きに依存する研究間で比較を行うこの標準化された議定書の意義と必要性を強調表示します。全体的にみて、ビジョン研究者に従うの一般的な方法を提供する標準化されたプロトコルがなくなり、網膜を識別するための標準メソッドを使用が発生するデータ集録の交絡変数の存在向きです。
紹介した方法は、簡単に再現性と実験的プロトコルの多くの種類に適用されます。実際には、このプロトコルの最大の利点の 1 つはその適応性です。データ集録 (テーブルを最適化する実験的パラメーターに最適なランドマークを選択ことができます脈絡裂、s オプシン式と直筋ランドマークすべて発見されている網膜方向22を確実に同定するため1). さらに、郭清の方法はさらに網膜の方向を明確にまとめることができます。網膜のすべての 4 本の棒を方向づけるために s オプシン免疫組織化学と脈絡裂カットを組み合わせることができますたとえば、: 脈絡裂カットによって鼻と一時的な半球を識別でき、s オプシン免疫組織化学を識別することができます腹側と背側の半球。まだ、このプロトコルの適応性は、生理学実験の時間に敏感な性質によって制限可能性があります。ランドマークを識別、角膜のやけど、緩和カットを実行にかかる時間は、体外実験で重要な組織死で起因できる、未満の最適なこれらの郭清の方法のいくつかあります。幸いなことに、深いランドマークを識別し、緩和、解剖に脈絡裂または上直筋解離法に精通するなるとカット迅速に郭清のルーチンの部分になるし、大幅追加しないでください。郭清の長さ。組織の生存率はもはや問題 (図 3 網膜向きのホックを投稿の s オプシン グラデーションを使用してお勧めただし、ここで説明されている手順非常に時間に敏感な実験の時間に追加できることを認識、).S オプシンは、すべての 4 本の棒を特定すること、網膜を方向づけるための効果的な方法のために網膜を染色: 背側と腹側の極に網膜を分割し、可能にするかどうかによって鼻と時間の同定が極 s オプシン染色網膜右または左の目 (図 3) からです。したがって、このプロトコルが実験的パラメーターを満たすことができる正確な網膜方向法の信頼性と再現性のあるセットを提供と考えています。
として、任意の変更された網膜の郭清を伴う、郭清法の有効性は切開と隔離されている組織の品質の精度によって制限されます。解剖時に任意の組織が失われた場合、正確な再建のため、網膜が破損するとあまりにも Retistruct と MATLAB プログラムされません確実に再構築および網膜の方向を設定することができます。したがって、実験データ収集のために使用前に郭清法を実践することが重要です。解剖の種類は、ここで困難ではありませんを説明しながら、特定のランドマークと網膜の方向を識別する再現性の確保に練習されなければなりません。さらに、正しいランドマークと確信させるのにデータ収集を開始する前に解剖学的ランドマークを視覚的に識別する解剖実習が使用されていることが不可欠です。特定の凝固切開装置の精度を確認する方法の 1 つはいずれかの脈絡裂にカットまたは上直筋を切り取って固定マーカーは、したがって、dissectio の精度に依存しないので s オプシン グラデーションにカットの位置を比較(名) 潜在的な dissectors は、カットは図 1に示すように正確なランドマークと再建された網膜の例に再建された網膜を比較することもと図 2。基本的には、潜在的な解剖特定解離型のこのプロトコルで説明されている手順を実行する必要があります、かどうかは上直筋または脈絡膜裂法と結果の妥当性を確立する s オプシン グラデーションを比較、特定のバイナリ。網膜の不正確な方向に切開がランドマークの場所について確認の場合がありますので、デフォルトに影響を与えるデータの収集と解釈。

網膜神経科学の重要なと時々 見落された側面は適切な方向と全体マウント網膜の分析記録の部屋に電気生理学や組織学的のスライドの網膜の方向かどうか。これは、哺乳類の視覚系の調査のための最も広く使用されているモデルは、現在マウスの網膜を含む調査のため特に重要です。マウス網膜空間的に均一ではないが、メラノプシン神経節細胞、過渡 OFF α 神経節細胞、錐体オプシン1,2 などの機能的に異なる網膜細胞型の密度とサイズ グラデーションの最近の発見を明らかに ,3,4,5。その結果、網膜の方向性を決めるための手法がありますセル型オプシン分布2,3,6を含む実験結果方向が方向性のチューニング神経節細胞7,8,9, と網膜変性症10、11,12,13,14 の地形パターン.実際には、報告しないどのように網膜の方向を報告を引き起こす可能性が不一致文献および混乱の研究の間でデータを比較する際。したがって、研究者がこのような研究の結果を正確に解釈できるように網膜の方向を識別する方法を報告することが重要です。
網膜の方向の眼球摘出1,3,12,15,16,17 前に背側、腹側、鼻または一時的な角膜を得点によって識別される一般的 ,18,19外眼筋6,7など目の深い解剖学的ランドマークを染色したり、によって脈絡膜裂20,21, またはまたはs オプシン グラデーション2,3。腹直筋は上直筋、下直筋、内側直筋、外側直筋、いずれかの添付ファイルを二等分深い緩和カットすることによって背側、腹側、鼻と一時的な網膜をそれぞれ識別するために使用できます。ただし、ほとんどの実験では、1 つの直筋を用いたことで網膜22の方向付けのため十分です。目の開発の残骸である脈絡裂は、目の後ろにかすかな水平線として表示できます。この線の両端は、鼻腔またはグローブ23時間極のいずれかで終了します。最後に、s オプシンの発現は非対称マウスの腹側網膜に分散し、s オプシン抗体は免疫組織化学実験1で腹側の網膜を明らかにする使用ことができます。
Stabioらによる最近の仕事22角膜火傷等表面的な眼のランドマークが解剖学的スペース、ヒューマン エラーと角膜のやけどを作る時間と内側を使用する場合に可変性の原因で網膜の方向付けのため信頼性の低いメソッドであることを示した基準点として canthi。対照的に、上直筋、脈絡裂のオプシン グラデーションなどの深いランドマークは網膜22の方向付けのためのより信頼性の高い、正確なランドマークに示されています。しかし、これらの解剖学的ランドマークの同定文献で詳細に説明されていないユニークな解剖の手順が必要です。したがって、このプロトコルの目標は、上直筋、脈絡裂および s オプシン グラデーションを使用してマウス網膜の空間的なオリエンテーションを正確に識別する方法に関する包括的なチュートリアルを提供することです。さらに、我々 は s オプシン免疫組織化学のためのプロトコルと同様に、2 つのオプシンの抗体の有効性の比較を含まれています。
正確な網膜の向きに依存する研究に追加課題の 1 つは、記録室、料理、またはスライドで wholemount 網膜を平らにするために必要な大規模な緩和カットです。これはフラット二次元構造物としてイメージが作成されたとき、何が当然立体構造の解析のための課題を導入できます。それから収集したデータを分析する前に、その立体構造にフラット wholemount 網膜に戻ります Retistruct24と呼ばれるプログラムを使用できます。したがって、このプロトコルのセクションは Retistruct ソフトウェアを使用して、s オプシン immunostained マウス網膜の再構築に必要な手順を強調する専用です。我々 はまた正確に回転とオリエントのマウス網膜のオプシンとステンド グラスを開発した当社のカスタム MATLAB スクリプトを使用するためのプロトコルのセクションを含まれています。

<table><tbody><tr><td>0.1 M Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 Epifluorescent Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nailpolish</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Low Speed Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC-Treated 24-well Plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat Alexa 594</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit Alexa 594</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Normal Serum</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>Use at 5.2% (52 &amp;mu;L with 86 &amp;mu;L of 20% Triton X-100 and 863 &amp;mu;L of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-s-opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&amp;nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>Not commerically available as of 2017</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ or FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>Freely available software</td></tr><tr><td>Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>At least version 2007b or later</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slide Trays</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira Ultra Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>Use at 4% (25 &amp;mu;L and 875 &amp;mu;L of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm)&amp;nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glass Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>Freely available software; version 3.4.3 or later</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsin</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Microscope Camera</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Freely available software&amp;nbsp; compatiable with Windows 7 or Windows 10</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Use 1.7% (86 &amp;mu;L of 20% Triton-X with 52 &amp;mu;L of Donkey Normal Serum and 863 &amp;mu;L of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)</td></tr><tr><td>Vannas Spring Dissection Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>5MP USB Microscope Digital Camera</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>To be used with the Olympus Dissection Microscope</td></tr></tbody></table>

where you cut matters: a dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks

正確かつ確実にマウス単離網膜の空間的なオリエンテーションを識別する視覚神経科学、密度の解析や網膜のセルタイプのサイズ グラデーションなど、多くの研究の重要な方向性のチューニングの方向神経節細胞といくつかの網膜疾患における地形変性パターンの検討。ただし、多くの異なる眼郭清の方法を文献で報告し、マウス網膜における網膜の方向をラベルに使用するがあります。方向のような調査で使用される方法はしばしば見落とされて、報告しないどのように網膜の方向を決定を引き起こす可能性が不一致文献および混乱の研究の間でデータを比較する際。角膜のやけどなど表面的な眼のランドマークが使われませんが最近腹直筋、脈絡裂のオプシン グラデーションなど深いランドマークより信頼性が低いことが示されています。ここでは、正確に分析し、マウス単離網膜の空間的なオリエンテーションを文書化する深い眼のランドマークの使用のため包括的なガイドを提供します。また 2 つのオプシンの抗体の有効性を比較して s オプシン免疫組織化学のためのプロトコルが含まれています。S オプシン グラデーションによると網膜の方向は、Retistruct ソフトウェアによる網膜再建とカスタム コードの回転を必要とするため、私たちはこれらのプログラムの両方を使用するために必要な重要なステップを発表しました。全体的に、このプロトコルの目標は、最も実験的プロトコルに適応できる正確な網膜向きのメソッドの信頼性と再現性のあるセットを提供することです。この作品の包括的な目標は、将来研究のため網膜方向メソッドを標準化することです。

正確かつ確実に直筋を二等分単一緩和カットは、背側の網膜 (図 1) を識別します。脈絡裂正確かつ確実に鼻と一時的な網膜を深い緩和時間と鼻の脈絡裂 (図 2) に沿って識別します。この例では、緩和のカットもしました背側網膜の網膜 (図 2D、垂直の矢印) の背/腹軸を識別するために。将来 dissectors によってレプリケーションの目的のこれらのプロセスの手順を示します。S オプシン免疫組織化学の組み合わせ (図 3 a と3 D)、(3 b, 3 e) Retistruct ソフトウェアによる再建とカスタム MATLAB コード (3 C、3 f) と正確な回転が可能、鼻と時間極これは網膜が右または左目 (図 3) かどうかがわかっている場合と同様に、網膜の腹側と背側半分の id。S オプシン コーン (図 4A ~ D) をラベリング効果の 2 つの一般的に使用される s オプシン一次抗体も比較した: 両方ヤギ アンチのオプシンの一次抗体、ウサギ抗のオプシンの一次抗体に効果的にラベルを付ける同じマウス s オプシン コーン (図 4E)。
緩和カットされた s オプシン再建 immunostained 網膜上識別され、s オプシン勾配によって決定される方位の場所を比較しました。当社のカスタム MATLAB コード (補足資料参照)、網膜のオプシン染色の最高濃度のある腹、真配置、正確に回転しました (直) の 90 ° で 0 ° (鼻の真の鼻背脈絡裂) と時間 (時間的脈絡裂) の 180 ° 真します。角をカット緩和個々 の価値は、網膜を s オプシン グラデーションによると回転した後に ImageJ で角度ツールを使用して決定されました。各緩和カットタイプの平均角度を計算したし、ポーラー プロット (図 6) でプロットしました緩和カット種類ごとの平均値。平均すると、筋肉のカットは上直筋識別 96.3 ± 4.3 ° 背極 (n = 11) (図 6)。鼻の脈絡裂 6.7 ± 5.8 ° 鼻ポールと一時的な脈絡裂示さ 172.0 ± 4.4 ° 時間極 (n = 9;図 6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg"> 図 1: 右目の背側の網膜を正確に識別する上直筋を使用しています。(A) 焼灼ペン (白い矢印) で作られた角膜強膜の国境近くの背側角膜火傷の例。上直筋はこのビュー (白い矢印) に表示されますも。全体の例 (B) 除去のマウントされた網膜は、上直筋を二等分して背側網膜に作られたカット。矢印は、上直筋を二等分によって背側網膜に作られたカットを緩和深を示しています。網膜は一次抗体ヤギ抗-s-オプシンと汚れる (材料の表を参照) と二次抗体ロバの反やぎ Alexa 594 (材料の表を参照してください励起: 590 nm; 排出量: 620 nm) (水色)。網膜をテキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡をイメージしました (595 nm)。(C) A 網膜 Retistruct で再建され、MATLAB のカスタム コードを使用して回転 (補足資料を参照してください)、上直筋効くと目に見えるカット (白い矢印)。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg"> 図 2: 脈絡裂を使用して正確に右目の網膜の鼻と時間の極を識別する。(A) 焼灼ペンで作られた角膜強膜の国境近くの背側角膜火傷の例。(B) 脈絡膜裂強膜 (白い矢印) で目の後ろに表示されます。背側の角膜のやけどは時間的脈絡裂から約 90 ° に位置する、このビューに表示も。(C) 脈絡膜裂強膜、角膜強膜の枠線を走行視神経からの目の後ろに表示されます。(D) は網膜に染まったヤギ抗-s-オプシン (材料の表を参照してください) と二次抗体ロバの反やぎ Alexa 594 (材料の表を参照してください励起: 590 nm; 排出量: 620 nm) 脈絡裂カット (水平 (シアン)矢印) 切り (垂直方向)、背側の緩和します。網膜をテキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡をイメージしました (595 nm)。(E) 網膜は Retistruct で再建され、背の緩和カットと鼻で、一時的な脈絡裂カット表示 (白い矢印) カスタム MATLAB コード (補足資料を参照してください) を使用して回転します。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg"> 図 3: s オプシンのグラデーションを使用して網膜のすべての 4 本の棒を識別する。S オプシンのラベルに immunostained をされており、テキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡を用いたイメージング右目から網膜の例 (A) 解剖 (595 nm)。地形向き、s オプシン グラデーションによって決まりますので、この網膜でカット、任意です。(B) Retistruct A で網膜の再建の結果。S オプシン グラデーションがない正しく並んでいること網膜がカスタム MATLAB コード (補足資料を参照してください) を実行されていないので注意してください。(C) カスタム コードで網膜を回転の結果。網膜は、s オプシン染色の最高濃度は下部にありますように回転し、腹側の網膜として識別されています。網膜は、右の目からは、一時的なポールは位置 90 ° 背極から反時計回りに、鼻ポール位置 90 ° 背極から時計回りに。(D) 網膜の例は左眼のオプシンのラベルに immunostained をされており、テキサス赤フィルターでイメージから解剖 (595 nm)。地形向き、s オプシン グラデーションによって決まりますので、この網膜でカット、任意です。(E) Retistruct と D で網膜をデジタル再構成の結果。S オプシン グラデーションがない正しく並んでいること網膜がカスタム コードによって回転されていないので注意してください。(F) カスタム コードと D で網膜を回転の結果。網膜は、s オプシン染色の最高濃度は下部にありますように回転し、腹側の網膜として識別されています。網膜は、左の眼からは、鼻のポールの位置 90 ° 背極から反時計回りと一時的な棒が位置 90 ° 背極から時計回りに。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg"> 図 4: s オプシン コーンをラベルに 2 つのプライマリ s オプシン抗体の比較。(A) A 網膜ヤギ抗のオプシンの一次抗体で染色 (材料の表を参照してください)。 (B) 同じマウスの他の網膜に染まったウサギ抗のオプシン一次抗体 (材料の表を参照してください)。(C) A ヤギ抗のオプシンの一次抗体で染色網膜から代表 (0.1 × 0.1 mm2)Epifluorescent 顕微鏡を用いた 40 倍の倍率で撮影した画像。網膜から (D) の代表的な地域 (0.1 × 0.1 mm2) に染まったウサギ抗-s-オプシン (材料の表を参照)、一次抗体の代替。イメージは、40 倍の倍率で epifluorescent 顕微鏡で撮影されました。(E) 両抗体のラベル s コーンの外側のセグメントの数が同じヤギ抗-s-オプシンとウサギ抗-s-オプシン テスト網膜の染色陽性の錐体の数に差がないので離心率 (n = 2;アドホックの記事ボンフェローニ テストと分散分析p > 0.05)。スケール バー = 1 mm (A B);25 μ m (C ・ D)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg"> 図 5: s オプシンと網膜 immunostained を再構築する Retistruct ソフトウェアを使用するための視覚的なガイドします。アウトライン表示で Retistruct で開かれた A (A) 網膜と、「涙」に追加。「涙」のポイントは、スーパーイン ポーズの白い矢印で示されます。この網膜にあるすべてのカットは、します解剖時に網膜の方向をマークする特定のランドマークが使用されていない任意の。重要なボタンの輪郭が赤に。すべての「涙」追加 (B) A 網膜と網膜の端に"D"が付いて背網膜。「網膜の再構築」ボタンが表示されます注意してください。重要なボタンの輪郭が赤に。(C) 網膜の再建のプロセス。再建された網膜の極座標は、シアン (青い矢印のカット位置を明確にする重ね合わせ) でカット、緩和を示す右に表示されます。(D) Retistruct を通じて網膜を実行する最終的な結果。元 wholemount 網膜そのまま左側と右側再建された網膜に表示されます。緩和のカットは、シアン (カット位置を明確にする重ね合わせ白い矢印) で表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg"> 図 6: 上直筋と脈絡膜裂を正確にマウス網膜の向きを使用できます。カットを緩和、上直筋から得られる角度の極座標または脈絡裂は Retistruct と再建されている網膜にカットできます。緩和カットされた s オプシン再建 immunostained 網膜に識別され、s オプシン グラデーションの場所の場所を調べた。カスタムの MATLAB のコードを使用すると、正確に網膜を回転して s オプシン染色の最高濃度が腹側に位置する、真背 (90 ° 上直筋)、真の鼻 (鼻脈絡裂の 0 °)、真の一時的な脈絡膜のための一時的な (180 °裂) 各網膜を求めた。カット アングルは、ImageJ と平均の角度で決定されたそれぞれの個別緩和の値は、緩和の型をカットごとに算出しました。上直筋カット識別 96.3 ± 4.3 ° 背極 (n = 11)。鼻の脈絡裂 6.7 ± 5.8 ° 鼻ポールと一時的な脈絡裂示さ 172.0 ± 4.5 ° 時間極 (n = 9)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>深いランドマーク</td>
			<td>角膜のやけどの場所</td>
			<td>識別される網膜の極</td>
			<td>実験的アプリケーション</td>
		</tr>
<tr>
<td>上直筋</td>
			<td>背側</td>
			<td>背側</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>鼻の脈絡裂</td>
			<td>背側</td>
			<td>鼻</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>一時的な脈絡裂</td>
			<td>背側</td>
			<td>一時的です</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>S オプシン グラデーション</td>
			<td>どれも</td>
			<td>背、腹、鼻、時間</td>
			<td>固定</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 深いランドマーク、網膜の極彼らを識別するとかライブや固定組織のアプリケーションに使用できます。

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Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

このプロトコルは、正確かつ確実に東洋の解剖学的領域でマウス単離網膜に深い眼のランドマーク、s オプシン免疫組織化学、Retistruct、およびカスタム コードを使用するため包括的な郭清と分析のガイドを提供します。

事項をカットする場所: 郭清と眼のランドマークからマウス網膜の空間的なオリエンテーションの解析ガイド

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K ビュー.  The University of Akron. このプロトコルは、正確かつ確実に東洋の解剖学的領域でマウス単離網膜に深い眼のランドマーク、s オプシン免疫組織化学、Retistruct、およびカスタム コードを使用するため包括的な郭清と分析のガイドを提供します。

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

神経科学

<meta charset="utf8"></head><body>組織透明化と蛍光標識を用いた網膜周皮細胞の可視化

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

生化学

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable tool to evaluate and characterize changes in a variety of retinal and ocular disease and injury models. In light induced retinal degeneration models, SD-OCT can be used to track thinning of the photoreceptor layer over time. In glaucoma models, SD-OCT can be used to monitor decreased retinal nerve fiber layer and total retinal thickness and to observe optic nerve cupping after inducing ocular hypertension. In diabetic rodents, SD-OCT has helped researchers observe decreased total retinal thickness as well as decreased thickness of specific retinal layers, particularly the retinal nerve fiber layer with disease progression. In mouse models of myopia, SD-OCT can be used to evaluate axial parameters, such as axial length changes. Advantages of SD-OCT include in vivo imaging of ocular structures, the ability to quantitatively track changes in ocular dimensions over time, and its rapid scanning speed and high resolution. Here, we detail the methods of SD-OCT and show examples of its use in our laboratory in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia. Methods include anesthesia, SD-OCT imaging, and processing of the images for thickness measurements.

Here, we describe the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to visualize retinal and ocular structures in vivo in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia.

光コヒーレンストモグラフィーを用いたげっ歯類モデルにおける眼疾患のin vivo構造評価

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable ...

生物工学

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

医学

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

マウスおよびラットの視覚系の構造と機能読み出しとして光干渉断層計と動視反応を使用してください。

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images from which the retinal thickness can be calculated. Although OCT is widely used in clinical practice, its application in basic research is not as prevalent, especially in small animals such as mice. Because of the small size of their eyeballs, it is challenging to conduct fundus imaging examinations in mice. Therefore, a specialized retinal imaging system is required to accommodate OCT imaging on small animals. This article demonstrates a small-animal-specific system for OCT examination procedures and a detailed method for image analysis. The results of retinal OCT examination of very-low-density lipoprotein receptor (Vldlr) knockout mice and C57BL/6J mice are presented. The OCT images of C57BL/6J mice showed retinal layers, while those of Vldlr knockout mice showed subretinal neovascularization and retinal thinning. In summary, OCT examination could facilitate the noninvasive detection and measurement of retinopathy in mouse models.

Here, we describe an in vivo imaging technique using optical coherence tomography to facilitate the diagnosis and quantitative measurement of retinopathy in mice.

光干渉断層撮影法の網膜症モデルマウスへの応用

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...

事項をカットする場所: 郭清と眼のランドマークからマウス網膜の空間的なオリエンテーションの解析ガイド

要約

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網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

光コヒーレンストモグラフィーを用いたげっ歯類モデルにおける眼疾患のin vivo構造評価

超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1^gfp/gfpレポーターマウスの画像

マウスおよびラットの視覚系の構造と機能読み出しとして光干渉断層計と動視反応を使用してください。

光干渉断層撮影法の網膜症モデルマウスへの応用

事項をカットする場所: 郭清と眼のランドマークからマウス網膜の空間的なオリエンテーションの解析ガイド

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超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

マウスおよびラットの視覚系の構造と機能読み出しとして光干渉断層計と動視反応を使用してください。

光干渉断層撮影法の網膜症モデルマウスへの応用

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1^gfp/gfpレポーターマウスの画像