Gostaríamos de agradecer o dia de Brittany e Jessica Onyak para sua assistência técnica e Dr. Liu por amavelmente nos deixar usar seu microscópio de epifluorescente. Agradecimentos de apoio: NIH R15EY026255-01 e a Fundação de Kirchgessner de Karl.

<ol>
	<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li><li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina.">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li><li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites:+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina.">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li><li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types.">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li><li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina.">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li><li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice:+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina.">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131 (2014).</li><li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes.">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li><li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina.">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li><li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space.">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li><li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+eye:+Opsins,+photoreceptors,+retina+and+eye+cup.">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li><li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina:+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package.">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Não houve nenhum protocolo abrangente, padronizado para a determinação e a orientação da retina do rato isolado no espaço anatômico de rotulagem. O protocolo detalhada aqui tenta preencher esse vazio com a padronização e detalhando como usar pontos anatômicos profundos como referência pontos para confiantemente identificar a orientação da retina. Tem sido demonstrado que os marcos anatômicos profundos no presente protocolo fornecem um método mais preciso e confiável para orientar a retina do rato do que Marcos superficiais tais como queimaduras da córnea22. Assim, estudos que têm confiado em queimaduras da córnea para orientação da retina podem ter tido erros maiores na orientação de estudos que têm contado com marcos históricos, como os músculos retos e fissura coroide. Esta discrepância destaca a necessidade e a importância do presente protocolo padronizado com relação a interpretar os resultados e fazer comparações entre os estudos que dependem da orientação da retina precisa. Em geral, um protocolo padronizado irá fornecer um método comum para pesquisadores de visão a seguir, eliminando assim a presença de uma variável de confundimento em aquisição de dados que pode ocorrer com o uso de métodos não-padronizados para a identificação de retina orientação.
Os métodos apresentados aqui são facilmente reproduzíveis e aplicável a muitos tipos de protocolos experimentais. Na verdade, uma das maiores vantagens desse protocolo é sua adaptabilidade. Porque a fissura coroide, expressão de s-opsin e Marcos de músculo reto todos foram encontrados para identificar confiantemente orientação da retina22 o Marco que melhor se adapte os parâmetros experimentais pode ser escolhido para otimizar a aquisição de dados (tabela de 1). Além disso, métodos de dissecação podem ser combinados por forma a esclarecer a orientação da retina. Por exemplo, fissura coroide cortes podem ser combinados com s-opsin imuno-histoquímica para orientar todos os quatro polos da retina: hemisférios nasais e temporais podem ser identificados pelas cortes fissura coroide, e s-opsin imuno-histoquímica pode identificar hemisférios dorsais e ventrais. Ainda, a capacidade de adaptação do presente protocolo pode ser restringida pela natureza dos experimentos de Fisiologia com tempo-sensível. Porque o tempo que demora para identificar um ponto de referência, fazer uma queimadura da córnea e executar um alívio corte pode resultar em morte do tecido significativa em ex vivo experimentos, alguns desses métodos de dissecação podem ser menos do que ideal. Felizmente, uma vez que um Dissecador tornou-se familiarizado com a fissura coroide ou método de dissecação do músculo reto superior, identificando os marcos profundos e tornando a aliviar cortes rapidamente tornar-se parte da rotina de dissecação e não adicionar significativamente para o comprimento de dissecação. Embora reconheçamos que as etapas detalhadas aqui podem adicionar em vez de experiências extremamente sensíveis ao tempo, nós sugerimos o uso do gradiente s-opsina para orientação da retina post hoc quando a viabilidade do tecido não é mais uma questão (Figura 3 ). Coloração da retina para s-opsina é uma maneira eficaz para orientar a retina, como ele pode identificar todos os quatro polos: s-opsin manchando a retina se divide em polos dorsais e ventrais e permite a identificação da nasal e temporal polos dependendo se a retina é um direito ou esquerdo do olho (Figura 3). Portanto, acreditamos que este protocolo oferece um conjunto confiável e reproduzível de métodos para orientação da retina preciso que podem cumprir quaisquer parâmetros experimentais.
Como com qualquer modificada dissecação da retina, a validade do método dissecação é limitada pela precisão do Dissecador e a qualidade do tecido que foi isolado. Se qualquer tecido é perdido durante a dissecção ou uma retina também é desconfigurado para reconstrução precisa, Retistruct e o programa MATLAB não será capazes de forma confiável reconstruir ou orientar a retina. Portanto, é importante praticar o método de dissecação antes de usá-lo para a coleta de dados de experiências. Enquanto os tipos de dissecações explicaram aqui não são difíceis, eles devem ser praticados para garantir a repetibilidade de identificar a orientação da retina com um marco especial. Além disso, é essencial que a prática do Dissecador visualmente, identificando os pontos anatômicos antes de iniciar a coleta de dados para garantir que o Marco correto está sendo usada. Uma maneira de verificar a exatidão de um particular Dissecador é tornar qualquer fissura coroide cortes ou músculo reto superior cortes e em seguida, comparar a localização dos cortes ao gradiente s-opsina, já que é um marcador fixo e, portanto, não é dependente da exactidão dos dissectio s. potenciais dissectors também podem comparar suas retinas reconstruídos para os exemplos de retina reconstruído com Marco preciso cortes são mostrados na Figura 1 e a Figura 2. Essencialmente, um Dissecador potencial deve executar as etapas descritas neste protocolo para um tipo particular de dissecação, quer seja o músculo reto superior ou a coroide fissura método e comparar os resultados com o gradiente s-opsina para estabelecer a validade de um Dissecador particular. Porque se não tiver certo sobre a localização do landmark o Dissecador, pode resultar em uma orientação imprecisa da retina que irá, por padrão, afetam interpretação e coleta de dados.

Um aspecto importante e às vezes negligenciado da neurociência da retina é a orientação correta e a análise da retina toda montagem isolada, seja a orientação de uma retina em uma câmara de gravação de eletrofisiologia ou sobre lâmina histológica. Isto é particularmente importante para os estudos envolvendo a retina do rato, que é atualmente o modelo mais amplamente utilizado para investigações do sistema visual de mamíferos. Descobertas recentes revelam que a retina do rato não é espacialmente uniforme mas tem gradientes de densidade e tamanho dos tipos de células da retina funcionalmente distintos, tais como células ganglionares de melanopsina, transientes células ganglionares de OFF-alfa e opsins cone1,2 ,3,4,5. Por conseguinte, o método utilizado para determinar a orientação da retina pode afetar os resultados experimentais envolvendo a célula tipo ou opsina distribuições2,3,6, direção ajuste de direção-seletivo gânglio células7,8,9e padrões topográficos de degeneração da retina10,11,12,13,14 . Na verdade, não relatório orientação como da retina é relatada pode causar discrepâncias na literatura e confusão ao tentar comparar os dados entre os estudos. Portanto, é vital que os investigadores relatam o método para identificar a orientação da retina para que os resultados de tais estudos podem ser interpretados com precisão.
Orientação da retina é geralmente identificada, marcando a córnea dorsal, ventral, nasal ou temporal antes da Enucleação ocular1,3,12,15,16,17 ,18,19 ou por corte ou coloração marcos anatômicos profundos olhos tais como os músculos extra-oculares6,7, a coroide fissura20,21, ou o s-opsin gradiente2,3. Os músculos retos podem ser usados para identificar o dorsal, ventral, nasais e a retina temporal, fazendo um corte profundo alívio que corta a ligação de qualquer um o reto superior, reto inferior, reto medial, o músculo reto lateral, respectivamente. No entanto, para a maioria dos experimentos, usar um músculo reto é suficiente para orientar a retina22. A fissura coroide, que é um remanescente do desenvolvimento do olho, pode ser vista como uma ténue linha horizontal na parte de trás do olho. Cada extremidade desta linha termina na nasal ou polo temporal do globo,23. Finalmente, expressão de s-opsin assimetricamente é distribuído para a retina ventral em camundongos, e anticorpos opsin-s podem ser usados para revelar a retina ventral em imuno-histoquímica experiências1.
Trabalho recente de Stabio, et al 22 demonstraram que Marcos oculares superficiais, tais como queimaduras da córnea são um método menos confiável para orientar a retina no espaço anatômico, provavelmente devido a erro humano e variabilidade em fazer a queimadura da córnea quando usando o temporal e medial canthi como pontos de referência. Em contraste, Marcos profundos, tais como o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente s-opsina, foram mostrados para ser mais confiáveis e precisos para orientar a retina22Marcos. No entanto, a identificação destes pontos anatômicos requer etapas de dissecação exclusivos que não são descritas em detalhes na literatura. Assim, o objetivo do presente protocolo é fornecer um tutorial completo sobre como usar o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente s-opsina para identificar com precisão a orientação espacial da retina do rato. Além disso, incluímos uma comparação da eficácia dos dois anticorpos s-opsina, bem como um protocolo para s-opsin immunohistochemistry.
Um desafio adicional para estudos baseando-se na orientação precisa da retina é os grandes cortes de alívio necessários para achatar as retinas wholemount em uma câmara de gravação, prato ou slide. Isto pode apresentar desafios para a análise do que é naturalmente uma estrutura tridimensional, quando ela é imaginada como uma estrutura bidimensional plana. Um programa chamado Retistruct24 pode ser usado para retornar uma retina plana wholemount a sua estrutura tridimensional antes dos dados coletados a partir dele são analisados. Assim, uma seção do presente protocolo é dedicada a destacar as etapas que são necessárias para usar o software Retistruct para reconstruir as retinas de rato de immunostained s-opsina. Também incluímos uma seção de protocolo para usar nosso script personalizado do MATLAB, que foi desenvolvido para rato com precisão girar e orientar as retinas manchadas com s-opsina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1499px;" width="1498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">0.1 M Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:125px;">P5244</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Axioplan2 Epifluorescent Microscope</td>
			<td style="width:243px;">Zeiss</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Clear Nailpolish</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Corning LSE Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS6780FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Costar TC-Treated 24-well Plates</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:243px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;">SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey anti-Goat Alexa 594</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey anti-Rabbit Alexa 594</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey Normal Serum</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">566460</td>
			<td>Use at 5.2% (52 &#956;L with 86 &#956;L of 20% Triton X-100 and 863 &#956;L of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:243px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Goat anti-s-opsin</td>
			<td style="width:243px;">Santa Cruz Biotechnologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">sc-14363</td>
			<td>Not commerically available as of 2017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Graefe Curved Forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:125px;">11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">ImageJ or FIJI</td>
			<td style="width:243px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td>
			<td style="width:243px;">Bovie Medical Corporation</td>
			<td style="width:125px;">AA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">MATLAB</td>
			<td style="width:243px;">MathWorks</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">At least version 2007b or later</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Micro Cover Glasses&#160;</td>
			<td style="width:243px;">VWR International</td>
			<td style="width:125px;">48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Micro Slide Trays</td>
			<td style="width:243px;">VWR International</td>
			<td style="width:125px;">82020-913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Moira Ultra Fine Forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:125px;">11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">HAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:243px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">15714-S</td>
			<td>Use at 4% (25 &#956;L and 875 &#956;L of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm)&#160;</td>
			<td style="width:243px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:125px;">305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Pyrex Glass Petri Dish</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS3160152</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">R</td>
			<td style="width:243px;">The R Project for Statistical Computing</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software; version 3.4.3 or later</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Rabbit anti-s-opsin</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">ABN1660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Retiga R3 Microscope Camera</td>
			<td style="width:243px;">Qimaging</td>
			<td style="width:125px;">01-RET-R3-R-CLR-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Retistruct</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software&#160; compatiable with Windows 7 or Windows 10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media</td>
			<td style="width:243px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">14-390-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">T8787</td>
			<td>Use 1.7% (86 &#956;L of 20% Triton-X with 52 &#956;L of Donkey Normal Serum and 863 &#956;L of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Vannas Spring Dissection Scissors&#160;</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:125px;">15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">5MP USB Microscope Digital Camera</td>
			<td style="width:243px;">AmScope</td>
			<td style="width:125px;">MU500</td>
			<td>To be used with the Olympus Dissection Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

where you cut matters: a dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks

Com precisão e confiabilidade identificar a orientação espacial da retina do rato isolado é importante para muitos estudos em neurociência visual, incluindo a análise da densidade e tamanho gradientes de tipos de células da retina, a direção de afinação de direção-seletivo células ganglionares e o exame dos padrões topográficos degeneração em algumas doenças da retina. No entanto, existem muitos métodos diferentes de dissecação ocular relatados na literatura que são usados para identificar e rotular a orientação da retina na retina do rato. Enquanto o método de orientação utilizado em tais estudos é muitas vezes esquecido, não relata como retinal orientação é determinada pode causar discrepâncias na literatura e confusão ao tentar comparar os dados entre os estudos. Marcos oculares superficiais, tais como queimaduras da córnea são comumente usados, mas recentemente foram mostrados para ser menos confiáveis do que os marcos mais profundos, como os músculos reto, fissura coroide ou gradiente s-opsina. Aqui, nós fornecemos um guia completo para o uso do fundo oculares Marcos de precisão de dissecar e documentar a orientação espacial de uma retina de rato isolado. Temos também comparou a eficácia de dois anticorpos s-opsin e incluiu um protocolo para s-opsin immunohistochemistry. Porque a orientação da retina de acordo com o gradiente s-opsin requer reconstrução da retina com o software Retistruct e rotação com código personalizado, apresentamos os passos importantes necessários para usar os dois destes programas. No geral, o objetivo do presente protocolo é entregar um conjunto confiável e reproduzível de métodos para exata orientação da retina que é adaptável aos protocolos mais experimentais. Um objectivo fundamental deste trabalho é a padronização de métodos de orientação da retina para futuros estudos.

Um único corte de alívio que corta o músculo reto superior com precisão e confiantemente identifica a retina dorsal (Figura 1). A fissura coroide com precisão e confiabilidade identifica a retina nasal e temporal com cortes profundos de alívio ao longo da fissura coroide temporal e nasal (Figura 2). Neste exemplo, um corte de alívio também fez na retina dorsal a fim de identificar o eixo dorsal/ventral da retina (Figura 2D, seta vertical). As etapas destes processos são mostradas com fins de replicação por futuros dissectors. Uma combinação de imuno-histoquímica s-opsina (Figura 3A e 3D), reconstrução com software Retistruct (3B, 3E) e rotação exata com um código personalizado do MATLAB (3 C, 3F) permitem a identificação das metades ventrais e dorsais da retina, bem como os polos nasais e temporais se sabe se a retina é de um olho esquerdo ou direito (Figura 3). Nós também comparamos dois anticorpos primários de s-opsin comumente usados para a eficácia da rotulagem cones s-opsina (Figura 4A-D): ambos o bode anticorpo primário anti-s-opsin e o anticorpo primário de coelho anti-s-opsin efetivamente etiqueta s-opsin conoides (Figura 4E) o mouse mesmo.
Aliviar cortes foram identificados na retina de s-opsin immunostained reconstruída e suas localizações foram comparadas à orientação determinada pelo gradiente s-opsina. Usando nosso personalizado MATLAB código as retinas (ver Materiais suplementares), com precisão foram girados para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada ventralmente, colocando, assim, verdadeira dorsal em 90 ° (para reto superior), verdadeiro nasal em 0 ° (para nasal fissura coroide) e verdadeiro temporal em 180 ° (para temporal fissura coroide). O valor de cada indivíduo aliviar corte ângulo foi determinado usando a ferramenta de ângulo no ImageJ após as retinas foram giradas de acordo com o gradiente s-opsina. Um ângulo médio foi calculado para cada alívio cortar o tipo e o valor médio de cada tipo de corte alívio foi então plotado em um terreno polar (Figura 6). Em média, cortes de músculo reto superior identificaram o polo dorsal 96.3 ± 4,3 ° (n = 11) (Figura 6). A fissura coroide nasal identificado o polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° e temporal fissura coroide identificado o polo temporal 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; A Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg"> Figura 1: usando o músculo reto superior para identificar com precisão a retina de um olho direito dorsal. (A) um exemplo de uma queimadura da córnea dorsal, perto da fronteira da córnea-scleral feita com uma caneta de ponta de cauterização (seta branca). O músculo reto superior é também visível neste modo de exibição (seta branca). (B) um exemplo de um todo montado retina com um alívio de corte feito na retina dorsal por atravessa o músculo reto superior. Seta retrata o profundo alívio corte feito na retina dorsal por atravessa o músculo reto superior. A retina está manchada com o anticorpo primário cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) e anticorpo secundário burro anti-cabra 594 Alexa (ver Tabela de materiais; excitação: 590 nm; emissão: 620 nm) (ciano). Retina foi fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). (C), A retina reconstruída em Retistruct e girado com um código personalizado do MATLAB (ver Material suplementar) com o reto superior muscular aliviando corte visível (seta branca). D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg"> Figura 2: usando a fissura coroide para identificar com precisão os polos nasais e temporais da retina de um olho direito. (A) um exemplo de uma queimadura da córnea dorsal, perto da fronteira da córnea-scleral feita com uma caneta de ponta de cauterização. (B) a coroide fissura visível na parte de trás do olho sobre a esclera (seta branca). A queimadura da córnea dorsal é também visível neste ponto de vista, localizado a cerca de 90° a partir da fissura coroide temporal. (C) a coroide fissura visível na parte de trás do olho sobre a esclera, viajando do nervo óptico à fronteira córneo-escleral. (D), A retina manchada de cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) e anticorpo secundário burro anti-cabra 594 Alexa (ver Tabela de materiais; excitação: 590 nm; emissão: 620 nm) (ciano), com cortes de fissura coroide (horizontal as setas) e o alívio dorsal corte (seta vertical). Retina foi fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). (E) uma retina reconstruída em Retistruct e girado com um código personalizado do MATLAB (ver material suplementar) com o corte de alívio dorsal e os cortes nasal e temporal fissura coroide visíveis (setas brancas). D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg"> Figura 3: usando o gradiente s-opsina para identificar todos os quatro polos da retina. (A), um exemplo de uma retina dissecado de um olho direito que foi immunostained para rotular s-opsin e fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). Os cortes neste retina são arbitrários, desde que a orientação topográfica é determinada pelo gradiente s-opsina. (B) os resultados da reconstrução da retina em A com Retistruct. Observe que o gradiente s-opsin não está corretamente alinhado porque a retina não foi executada através do código personalizado do MATLAB (ver Materiais suplementares). (C) os resultados da retina na com o código personalizado de giro. A retina foi girada para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada na parte inferior e identificada como a ventral da retina. Porque a retina é de um olho direito, o polo temporal está localizado 90° no sentido anti-horário do polo dorsal e o polo nasal é localizado 90° no sentido horário do polo dorsal. (D) um exemplo de uma retina dissecado de um olho esquerdo que foi immunostained para rotular s-opsin e fotografada com um filtro vermelho Texas (595 nm). Os cortes neste retina são arbitrários, desde que a orientação topográfica é determinada pelo gradiente s-opsina. (E) os resultados da reconstrução digitalmente a retina em D com Retistruct. Observe que o gradiente s-opsin não está corretamente alinhado porque a retina não foi girada pelo código personalizado. (F) os resultados de rotativas da retina em D com código personalizado. A retina foi girada para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada na parte inferior e identificada como a ventral da retina. Porque a retina é de um olho esquerdo, o polo nasal é localizado 90° no sentido anti-horário do polo dorsal e o polo temporal está localizado 90° no sentido horário do polo dorsal. D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg"> Figura 4: comparação de dois anticorpos primários s-opsin na rotulagem cones s-opsin. (A), A retina manchado com o anticorpo primário de cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais). (B) outra retina do rato mesmo corados com anticorpo primário de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais). (C) A região representativa (0,1 x 0,1 mm2) de uma retina manchado com o anticorpo primário de cabra anti-s-opsina. Imagem tirada em um microscópio de epifluorescente ampliação de 40 X. (D) A região representativa (0,1 x 0,1 mm2) de uma retina manchada de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais), uma alternativa de anticorpo primário. Imagem foi tirada em um microscópio de epifluorescente ampliação de 40 X. (E) ambos os anticorpos rotular o mesmo número de segmentos de s-cone exterior porque não há nenhuma diferença significativa no número de immunopositive s-cones que estão manchadas de cabra anti-s-opsin e anti-s-opsin do coelho em qualquer um do retinal testado excentricidades (n = 2; ANOVA com teste post hoc de Bonferroni; p > 0,05). Barras de escala = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg"> Figura 5: um guia visual para usar o software Retistruct para reconstruir as retinas immunostained com s-opsin. (A), A retina, inaugurado em Retistruct com o contorno visível e um "rasgo" adicionado. Pontos do "Rasgo" são indicados com setas brancas sobrepostas. Todos os cortes neste retina são arbitrários, como nenhum Marco particular foi usado para marcar a orientação da retina durante a dissecção. Botões importantes são descritas em vermelho. (B), A retina com todas as "lágrimas" adicionado e a retina dorsal identificada com "D" na periferia da retina. Observe que o botão de "Retina reconstruir" agora é visível. Botões importantes são descritas em vermelho. (C) o processo de reconstrução de uma retina. A trama do polar da retina reconstruída aparecerá à direita, mostrando que a aliviar cortes em ciano (setas azuis sobrepostos para esclarecer locais de corte). (D) o resultado final da execução uma retina através de Retistruct. A retina wholemount original permanece no lado esquerdo e reconstruída retina aparece no lado direito. Os cortes de alívio são visíveis em ciano (setas brancas sobrepostas para esclarecer locais de corte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg"> Figura 6: A fissura de músculo e coroide reto superior pode ser usada para orientar com precisão a retina do rato. Uma trama polar dos ângulos obtidos a partir de qualquer músculo reto superior aliviando cortes ou fissura coroide cortes em retinas que foram reconstruídas com Retistruct. Aliviar cortes foram identificados na retina de s-opsin immunostained reconstruída e suas localizações foram comparadas com a localização do gradiente s-opsina. Usando o código personalizado do MATLAB para girar com precisão as retinas para que a maior concentração de s-opsin coloração é localizado ventralmente, verdadeiro dorsal (90° para reto superior), true nasal (0° para fissura coroide nasal) e temporal (180° para coroide temporal é verdade fissura) foram determinados para cada retina. O valor de cada individual aliviar o ângulo de corte foi determinado no ImageJ e um ângulo médio foi calculado para aliviar cada tipo de corte. Cortes de músculo reto superior identificaram o polo dorsal 96.3 ± 4,3 ° (n = 11). A fissura coroide nasal identificado o polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° e temporal fissura coroide identificado o polo temporal 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Marco profundo</td>
			<td>Localização de queimadura da córnea</td>
			<td>Polo de Retina identificado</td>
			<td>Aplicação experimental</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reto superior</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fissura coroide nasal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Nasal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temporal fissura coroide</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Temporal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsin gradiente</td>
			<td>Nenhum</td>
			<td>Dorsal, Ventral, Nasal, Temporal</td>
			<td>Fixo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Marcos profundos, o polo da retina identificam-se, e se eles podem ser usados para aplicação de tecido vivo ou fixo.

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Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Este protocolo fornece um guia completo de dissecção e análise para o uso de fundo oculares Marcos s-opsin immunohistochemistry, Retistruct e código personalizado com precisão e confiabilidade orientar a retina de rato isolado no espaço anatômico.

Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K visualizações.  The University of Akron. Este protocolo fornece um guia completo de dissecção e análise para o uso de fundo oculares Marcos s-opsin immunohistochemistry, Retistruct e código personalizado com precisão e confiabilidade orientar a retina de rato isolado no espaço anatômico.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Neurociência

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

O Sistema Swimmeret de lagosta: Um Guia Prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares Recordings do padrão motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. Lineage-specific transcription factors are considered to play essential roles in cell specification and differentiation during development. ChIP coupled with high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) is widely used to analyze genome-wide binding sites of transcription factors (or its associated complex) to genomic DNA. However, a large number of cells are required for one standard ChIP reaction, which makes it difficult to study the limited number of isolated primary cells or rare cell populations. In order to understand the regulatory mechanism of oligodendrocyte lineage-specific transcription factor Olig2 in acutely purified mouse OPCs, a detailed method using ChIP-seq to identify the genome-wide binding sites of Olig2 (or Olig2 complex) is shown. First, the protocol explains how to purify the platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFR&#945;) positive OPCs from mouse brains. Next, Olig2 antibody mediated ChIP and library construction are performed. The last part describes the bioinformatic software and procedures used for Olig2 ChIP-seq analysis. In summary, this paper reports a method to analyze the genome-wide bindings of transcriptional factor Olig2 in acutely purified brain OPCs.

Here we present a protocol which is designed to analyze the genome-wide binding of the oligodendrocyte transcription factor 2 (Olig2) in acutely purified brain oligodendrocyte precursor cells (OPCs) by performing low-cell chromatin immunoprecipitation (ChIP), library preparation, high-throughput sequencing and bioinformatic data analysis.

Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular

Resumo

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Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando

A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

O Sistema Swimmeret de lagosta: Um Guia Prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares Recordings do padrão motor

Imagem Ca

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Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular