Brittany gün ve onların teknik destek için Jessica Onyak ve Dr. Liu nazik onun epifluorescent mikroskop kullanmamıza izin verdiğin için teşekkür etmek istiyorum. Destek bildirimleri: NIH R15EY026255-01 ve Karl Kirchgessner Vakfı.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Akron Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Retina yönünü belirlemek için Superior rektus kas simgesel yapı kullanma
Not: Superior rektus kas dorsal retina (Tablo 1) için bir dönüm noktası olduğunu. Deneme dorsal retina işaretleme gerektirmiyorsa, atlamak adım 1 ve adım 2 ile devam edin.
<ol><li>Onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Protokolü fare ötenazi için izleyin.</li>
	<li>Dünyanın genel yönünü belirlemek için yanık izi ötenazi (Şekil 1A) hemen sonra kornea sklera sınırında burun ve temporal canthi arasında doğrudan dorsal kornea üzerinde olun. On saniye için bir koter kalemi Isıtma ve dorsal kornea için kalemin bir saniyeliğine dokunmadan işaretlemek yanık olun. Not: Holding için kornea koter kalemi çok uzun ponksiyon dünya neden olur. Not: bazı koter kalemleri ışık yayarlar iken, Tablo reçetesi listelenen koter kalemi ısıtıldığında dark-adapted deneyler için güvenli bir seçenek yapmak herhangi bir ışık yayarlar değil.</li>
	<li>Enükleasyon için Kıvrımlı pensler hafifçe göz yerinden itmek ve Globe'dan altında kavrama için kullanın. Dünya kaldırmak için optik siniri kesmek yok; Bunun yerine, yavaş yavaş dünya onun soketten dünya yuvasından serbest bırakılıncaya kadar aynı anda bunu yavaşça soldan sağa doğru hareket ederken kaldır. Not: Bu hareket ne zaman dünyanın sonunda tamamen soketten çıkarmak için dünya bağlı kalır için rektus kas sağlayacaktır. Optik siniri de sık sık dünyanın bağlı kalır.</li>
	<li>Dünyanın bir petri diseksiyon orta içeren ekli rektus kasları ile aktarın. Hangi göz sol göz ve sağ gözü olduğunu izlemek emin olun. Not: Tetkik onların Deneysel protokol ile hizalar bir uygun diseksiyon orta kullanmalısınız.</li>
	<li>Diseksiyon kapsamına görsel olarak dorsal kornea yanığı bulun ve superior rektus kas ile tanımlamak ki öyle (Şekil 1A) ilişkili.</li>
	<li>Diseksiyon makası veya bir 20 G (0.9 mm x 25 mm) kornea yanığı işareti (bakınız Tablo malzemeler), delinme iğne. Üstün kas bisect için optik sinir doğru küre içine kesme rahatlatma derin bir olun. Bu kesim ile izole ve yeniden oluşturulan bir retina rakamlar 1B ve 1 Cgösterilir.</li>
	<li>Yavaşça ponksiyon adım 1.6 ile retina parçası maruz kadar yapılan deliğin içine girse forseps ( Tablo malzemelerigörmek) iki kümesi kullanarak retina yalıtmak için başlayın. Not: Bu önemlidir bu yavaşça, çok zorla yırtılma olarak yapılması giderici kesim daha fazla gözyaşı için neden olabilir.</li>
	<li>Forseps sklera tamamen kaldırılıncaya kadar ayrı retina sklera üzerinden alay için kullanın. Retina tamamen izole olana iris, lens, vitre ve kalan herhangi bir yapı forseps ile kaldırın. Not: Protokol burada duraklatılmış. Doku s-opsin immünhistokimya için düzeltilmesi olacaksa, 3.5 adıma geçer.</li>
</ol>2. Retina yönünü belirlemek üzere Choroid fissür simgesel yapı kullanma
Not: Choroid fissür göz arkasında sklera üzerinde present ve zamansal Kutbu'ndan burun pole (rakamlar 2B ve 2 C; çalıştırır Tablo 1).
<ol><li>Fare ötenazi için onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi iletişim kuralı izleyin.</li>
	<li>Dünyanın genel yönünü belirlemek için yanık izi ötenazi (Şekil 2A) hemen sonra kornea sklera sınırında burun ve temporal canthi arasında doğrudan dorsal kornea üzerinde olun. On saniye için bir koter kalemi Isıtma ve dorsal kornea için kalemin bir saniyeliğine dokunmadan işaretlemek yanık olun. Not: Holding için kornea koter kalemi çok uzun ponksiyon dünya neden olur.</li>
	<li>Göz enucleate ve diseksiyon orta içeren bir petri yerkürenin aktarın. Hangi göz sol göz ve sağ gözü olduğunu izlemek emin olun. Not: Tetkik onların Deneysel protokol ile hizalar bir uygun diseksiyon orta kullanmalısınız.</li>
	<li>Görsel olarak bulmanıza ve tanımlamanıza choroid fissür (Şekil 2B, 2 C) göz arkasında. Not: Choroid fissür Ayrıca kızıl ötesi ışık20altında kadeh içinde görünür durumdadır.</li>
	<li>Dorsal yanık superior kutbunda yer alır olarak göz hala fare olsaydı olurdu Petri kabına dünya gelecek şekilde yönlendirin. Not: Dorsal varlığı dünyanın, burun ve geçici yan tanımlanması için yanmak sağlar sağ veya sol göz olup olmadığı sürece belgelenmiş oldu: sağ gözü ise, burun choroid fissür yanık ve tempora sağa doğru olacaktır l choroid fissür yanık soluna doğru olacaktır. Sol göz, zamansal choroid fissür yanık sağa doğru olacaktır ve burun choroid fissür yanık soluna doğru olacaktır. Diseksiyon makası veya bir 20 G (0,9 x 25 mm) (bakınız Tablo malzemeler), yapmak bir delik dorsal yanık olduğu Globe iğne.</li>
	<li>Sığ bir rahatlatma dorsal kornea yanığı olduğu optik sinir doğru kesim yapmak. # Bu parçayı dorsal retina kimlik yalıtım (Şekil 2D) sonra için izin choroid fissür dik olacak.</li>
	<li>Optik siniri doğru aşağıdaki iki derin giderici kesim yapmak: bir diseksiyon bıçaklar astar tarafından makas kadar göz arkasında zamansal choroid fissür çizgili ve bir diseksiyon bıçaklar astar tarafından ile burun koroid makas fissür satırı göz arkasında. Bu kesim bir izole ve yeniden oluşturulan retinada Şekil 2D ve 2Eüzerinde gösterilir. Not: Alternatif olarak, derin bir kesik zamansal choroid fissür yapılabilir ve gereksiz kesmek sırt kornea yanığı yapma burun choroid fissür sığ bir kesim yapılabilir. Bu daha az giderici kesim ile retina doğru oryantasyon sağlar.</li>
	<li>Yavaşça ponksiyon adım 2.7 ve 2.8 ile retina parçası maruz kadar yapılan deliğin içine girse forseps ( Tablo malzemelerigörmek) iki kümesi kullanarak retina yalıtmak için başlayın. Not: Bu önemlidir bu yavaşça, çok zorla yırtılma olarak yapılması daha fazla gözyaşı giderici cut(s) neden olabilir.</li>
	<li>Forseps sklera tamamen kaldırılıncaya kadar ayrı retina sklera üzerinden alay için kullanın. Retina tamamen izole olana iris, lens, vitre ve kalan herhangi bir yapı forseps ile kaldırın. Not: Protokol burada duraklatılmış. Doku s-opsin immünhistokimya için düzeltilmesi olacaksa, 3.5 adıma geçer.</li>
</ol>3. S-opsin gradyan içerisinde fare Retina etiketleme
Not: S-opsin photopigment ifade retina ventral yarısı için mükemmel bir işaretleyici yapma ventral retina1, asimetrik olarak dağıtılır. Bu yöntem yalnızca sabit için yararlıdır ve immunostained doku (Tablo 1). Aşağıdaki adımları yukarıda belirtilen yöntemlerden herhangi birini kullanarak disseke Retina uygulanabilir.
<ol><li>Fare ötenazi için onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi iletişim kuralı izleyin.</li>
	<li>Hemen sonra ötenazi, göz enucleate ve dünya diseksiyon orta ile Petri kabına yerleştirin. Hangi göz sol göz ve retina disseke sonra retina yönünü belirlemek için sağ gözü olduğunu izlemek emin olun. Not: Tetkik onların Deneysel protokol ile hizalar bir uygun diseksiyon orta kullanmalısınız.</li>
	<li>
Retina retina parçası maruz kadar yavaşça kornea bir delik gözyaşı forseps (malzemeler tablo) iki kümesi kullanarak yalıtmak için başlayın. Not: Bu önemlidir bu yavaşça, çok zorla yırtılma olarak yapılması gözyaşı retina neden olabilir.</li>
	<li>Forseps sklera tamamen kaldırılıncaya kadar ayrı retina sklera üzerinden alay için kullanın. Retina tamamen izole olana iris, lens, vitre ve kalan herhangi bir yapı forseps ile kaldırın. Not: Protokol burada duraklatılmış. Deneme için bir ex vivo retina kullanarak aşağıdaki adımları gerçekleştirmeden önce deneme gerçekleştirin.</li>
	<li>Düz yalan olur ki diseksiyon makası kullanarak, retina dört giderici kesim yapmak. Retina ganglion hücre tarafında nitroselüloz membran (Tablo reçetesi) üzerinde hafifçe forseps ile retina membran üzerine her köşesine basarak binin. Not: S-opsin gradyan için Retina yönlendirme kullanırken giderici kesim konum rasgele olabilir.</li>
	<li>Forseps kullanarak, bir 24-şey plaka (Tablo reçetesi) ilk kuyuda bağlı retina aktarmak fiksasyon için 1 mL % 4 paraformaldehyde (Malzeme tablo) ile dolu. 24-şey plaka bir orbital çalkalayıcı, oda sıcaklığında (Tablo reçetesi) yerleştirin ve retinanın tam olarak 40 min için düzeltmek. Not: Aşağıdaki yıkama ve kuluçka adımlarının tümünün bir orbital çalkalayıcı üzerinde 24-şey plaka ile tamamlanmalıdır.</li>
	<li>15 dakika oda sıcaklığında retina de 1 mL 0.1 M PBS ile dolu ikinci aktararak yıkayın. İki kez ardışık olarak retina 0.1 M PBS dolu üçüncü ve dördüncü kuyuları için aktararak bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Beşinci de içeren 1 çözüm (% 1.7 Triton X-100 ve %5.2 eşek normal serum içinde 0.1 M PBS; bkz: Malzemeler tablo) engelleme mL için bağlı retina aktarmak ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Tavşan anti-s-opsin birincil antikor ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) 1:500 bir konsantrasyon, engelleme çözüm için ve 4 ° C'de üç gün kuluçkaya</li>
	<li>Aşırı birincil antikor retina üzerinden sırayla altı Wells, oda sıcaklığında 10 dakika her 1 mL 0.1 M PBS ile dolu yerleştirerek altı kez yıkayın.</li>
	<li>Bir de taze engelleme çözüm (% 1.7 Triton X-100 ve %5.2 eşek normal serum içinde 0.1 M PBS) ile retina yerleştirin ve eşek Anti-tavşan Alexa-594 ikincil antikor ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Gecede 4 ° C'de ikincil antikor ile retina kuluçkaya</li>
	<li>Aşırı ikincil antikor retina üzerinden sırayla taze 0.1 M PBS için oda sıcaklığında her 10 min 1 mL dolu altı Wells yerleştirerek altı kez yıkayın.</li>
	<li>Forseps kullanarak, bağlı retina 0.1 M PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Nitroselüloz zar retina retina artık bağlı olduğu kadar yavaşça forseps retina ve membran arasında ipuçları ekleyerek serbest bırakın.</li>
	<li>Retina retina cam sopa kadar yavaşça o forseps ile dürtmeye tarafından bir cam mikroskop slaytta mount ve Petri kabına slayt kaldırın.</li>
	<li>Retina Aquamount ile slayt üzerinde kapak ve #1.5 coverslip ile kaplayın. Slaydı slayt tepsisine yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve oda sıcaklığında bir saat oturup bekleyin.</li>
	<li>Buzdolabı ve mağaza içinde bir slayt tepsi slayt dönmek ( Tablo malzemelerigörmek) 4 ° c kullanılmadığı zaman. Slayt için 24 saat coverslipped sonra tırnak cilası kuruma önlemek için slayt kenarlarında mühürlemek için kullanın. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
</ol>4. kullanarak Retina Immunostained Retina yönünü belirlemek için S-opsin ile yeniden
<ol><li>S-opsin gradyan confocal mikroskop ya da bir fotoğraf makinesi eki olan bir epifluorescent mikroskobu ile görselleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) ve böylece tüm retina (rakamlar 1B, 2D, 3A ve bir görüntüde görülebilir retina görüntü 3D). bu bölümlerde düşük büyütmede retina görüntüleme ve görüntüleri birlikte dikiş yapılabilir.</li>
	<li>Böylece tanımlanabilir Retina adı. Örneğin, adı "Retina1" olmak ilk retina yeniden.</li>
	<li>Karşıdan yükleyip ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html.</li>
	<li>Yeniden olabilir, ancak klasörleri boş bırakmak için ihtiyacı her retina için bireysel bir klasör oluşturun. Örneğin, "Retina1" adlı bir klasör oluşturun. Bu retina yeniden oluşturmak için gereken tüm dosyaları bu klasör sonraki adımda yerleştirilir. Not: Bu klasörleri içermesi gereken tek Retistruct tarafından analiz edilecek olan dosyaları dosyalarıdır. Aşağıda ayrıntılı olanlar dışındaki tüm dosyaları retina Retistruct yazılım tarafından açılacak yapamaz hale getirecek.</li>
	<li>Açık belgili tanımlık imge Retina ImageJ içinde dosya seçerek → aç ve o zaman seçme "Retina1".</li>
	<li>Görüntünün herhangi bir değişiklik yapmadan, "başlıklı image.png" klasörüne kaydetmek "Retina 1 dosya → Kaydet → PNG seçerek". Not: Dosya "image.png" olarak yeniden inşası için bir retina dosyayı tanıyamıyor Retistruct yazılımınızın adlandırılması gerekir.</li>
	<li>Retina kenarlarını anahat için parçalı satırı aracını kullanın. Retina sınırında iki bitişik noktalar tıklayarak, parçalı çizgi aracı aslında "noktalar bağlamak bir anahat oluşturma iki bitişik noktalar arasında" olacak. Tüm retina özetlenen kadar yineleyin. → Araçlar → ROI Yöneticisi → retina anahat olarak "Analyze seçerek"Retina1"başlıklı outline.roi" klasörüne kaydetmek daha fazla → Kaydet [t] → ekleyin. Not: Retina kenarına nerede s-opsin boyama geçişleri için arka plan tespit edilebilir.</li>
	<li>Optik disk kenarlığını anahat için 4.7. adımda anlatıldığı gibi kısımlara ayrılmış satırı aracını kullanın. → Araçlar → ROI Yöneticisi → optik disk anahat olarak "Analyze seçerek"Retina1"başlıklı od.roi" klasörüne kaydetmek daha fazla → Kaydet [t] → ekleyin. Not: Optik disk retina ortasında küçük delik olarak tanımlanır ve diseksiyon kalitesine göre değişir. Not: Tüm Retistruct yeniden yapılanma ("image.png", "outline.roi" ve "od.roi") için gerekli dosyaları şimdi "Retina1" klasörüne kaydedilmiş olmalıdır.</li>
	<li>Download, install ve Retistruct programı açmak için Sterratt, vd. , ek materyalleri bölümünde yer Retistruct Kullanıcı Kılavuzu'nda açıklanan yönergeleri izleyin 24</li>
	<li>Pencere yer aldı, Retistruct'ı tıklattığınızda "Açık" simgesi üst sol-in pencere ve "Retina1" dizini klasörü seçin.</li>
	<li>Ölçek çubuğu yok var olduğunu gösteren bir görüntü penceresi açılır. Tıkırtı "Kapatmak" ve retina görüntüsünü kutusunda görünecektir. Top "Özellikler" düğmesini tıklatarak anahat Retina görselleştirmek sağında görünür renk (Şekil 5A) için pencere ve değişim anahat rengini.</li>
	<li>Önemli: retina sağ gözü veya sol göz (Şekil 5A) soldaki panelinde gelen olup olmadığını belirtin.</li>
	<li>Soldaki "gözyaşı Ekle" düğmesini tıklatın ve bir gözyaşı veya kesme retinada gözyaşı (Şekil 5A) üç tepe noktaları üzerinde tıklatarak nerede belirtin. Bu üç köşeleri kesme bağlanan çizgiler oluşturur. Retina tüm kesim için yineleyin.</li>
	<li>Dorsal retina Retina anahat rasgele bir noktaya tıklayarak tarafından belirtin. Büyük harf "D" Bu noktada anahat (Şekil 5B) görünür. Not: Dorsal retina retina, s-opsin degrade karşısında daha koyu yarısı olacaktır. Ancak, Retistruct dorsal retinada işaretleme işaretleme için "sırt" Bu adımda rasgele böylece retina, dorsal yarısı tanımlamak için güvenilir bir yöntem değildir.</li>
	<li>Yeniden yapılandırma "Retina yeniden yapılandırma" düğmesi üst retina ekranın (Şekil 5B) bıraktı. Yeniden oluşturulan retina polar bir arsa kesintileri görülebilir (Şekil 5C) anahat olarak aynı renkte görünür.</li>
	<li>"Retina1" klasör dizini (Şekil 5D) yeniden oluşturulan retina ve tüm ilişkili veriler kaydedilir böylece ekranın sağ "Kaydet" düğmesini tıklatın.</li>
	<li>Yeniden oluşturulan retina için "PDF" düğmesini sağ taraftaki bölmede (Şekil 5D) kaydedin. Bir kutu boyut özellikleri için soran görünür. Varsayılan boyut için aşağıdaki adımları kabul edilir. Bu eylem yeniden oluşturulan retina "image.polar.pdf" "Retina1" klasör dizini olarak kaydedecektir.</li>
	<li>"İmage.polar.pdf" boyama programı (veya diğer görüntü işleme programı) açın ve "Boya Kovası" aracını kullanın (veya benzeri) yeniden oluşturulan retinanın arka plan siyah değiştirmek için. Yeniden oluşturulan retina "Retina1_reconstructed.tif" "Retina1" klasör dizini gibi bir .tif dosyası olarak kaydedin. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
	<li>"Retina_Rotator.m" (bakınız ek materyalleri) denilen retina döndürme için MATLAB kodunu indirin. Kod dosyası klasöründeki diğer dosya ile kendi klasörüne yerleştirin.</li>
	<li>MATLAB, sürüm 2007b açmak veya daha sonra. MATLAB açmak için kod dosyasını çift tıklayın. Komut penceresinde, "Retina_Rotator" yazın ve sonra enter tuşuna basın. Arama penceresi görünür. Not: .tif dosyaları için belirli kodudur. Döndürülecek dosyası doğru biçimde değilse, kod retina doğru döndürür değil. 4,17 4,18 bkz:. uygun biçimde restore edilmiş retina kurtardığın için.</li>
	<li>Döndürülmesi için dosyayı açın. Örneğin, "Retina1_reconstructed.tif" seçin. Kod daha sonra yeniden oluşturulan retina analiz eder ve otomatik olarak döndürülmüş retina özgün dosyanın konumlandırıldığı klasöründe "Retina1_reconstructed_rotated.tif" olarak kaydedilir.</li>
	<li>Kod retina analiz sonra bir pencere de Retina görüntüleri önce ve sonra karşılaştırma (rakamlar 3B ve 3 C; için döndürme gösteren görünür Rakamlar 3E ve 3F). Not: Bu kodu yeniden oluşturulan retina böylece ventral (parlak) yarı alt ve böylece doğru s-opsin degrade1göre retina yönlendirme üst dorsal (dimmest) yarım olduğunu döner. Eğer olup olmadığını retina sağ gözünden veya sol gözünü belgelenmiş oldu, burun ve temporal Polonyalılar konumunu da yönlendirme (Şekil 3) bu yönteminden yaygınlaştırılması.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li><li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina.">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li><li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites:+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina.">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li><li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types.">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li><li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina.">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li><li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice:+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina.">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131 (2014).</li><li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes.">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li><li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+selectivity+in+the+retina:+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function.">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li><li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li><li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Ikbkap+causes+slow,+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia.">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map.">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938 (2013).</li><li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion.">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina.">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612 (2015).</li><li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma.">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li><li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function+of+the+M4+cell,+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision.">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li><li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina:+Rod+and+cone+photoresponses.">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+type,+size,+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts.">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li><li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors:+differences+between+an+albino+(Swiss)+and+a+pigmented+(C57/BL6)+strain.">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice.">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina.">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li><li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space.">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li><li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+eye:+Opsins,+photoreceptors,+retina+and+eye+cup.">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li><li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina:+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package.">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Belirlenmesi ve anatomik alanı izole fare retinada yönünü etiketleme için kapsamlı, standart protokol olmuştur. Protokol burada girişimleri standartlaştırılması tarafından bu boşluğu doldurmak için detaylı ve derin anatomik işaretlerini kullanmak nasıl ayrıntılı noktalarına güvenilir bir şekilde referans olarak tanımlamak Retina yönlendirme. Bu iletişim kuralı derin anatomik simge yapılar fare retina kornea yanığı22gibi yüzeysel simge yapılara daha yönlendirme için daha doğru ve güvenilir bir yöntem sağlamak gösterilmiştir. Böylece, Retina yönlendirme kornea yanığı dayanıyordu çalışmalar büyük hataları rektus kasları ve choroid fissür gibi simge yapılara dayanıyordu çalışmalar daha yönde vardı olabilir. Bu tutarsızlık ihtiyacını ve sonuçları yorumlama ve doğru Retina yönlendirme bağlı çalışmalar arasında karşılaştırmalar yapma ile ilgili bu standart iletişim kuralı önemini vurgulamaktadır. Genel olarak, standart bir protokol böylece oluşabilecek veri toplama karıştırıcı bir değişkende varlığıyla Retina tanımlamak için standart dışı yöntemlerin kullanımı ortadan kaldırarak vizyon araştırmacılar takip etmek için kullanılan genel yöntem sağlar Yönlendirme.
Burada sunulan kolayca tekrarlanabilir ve deneysel protokoller birçok türleri için geçerli yöntemlerdir. Aslında, bu protokolü en büyük avantajlarından biri, uyum yeteneği var. Choroid fissür, s-opsin ifade ve rektus kas yerler tüm güvenilir Retina yönlendirme22 tanımlamak için bulunmuştur çünkü en deneysel parametreleri uygun Simgesel Yapı veri toplama (tablo en iyi duruma getirmek için seçilebilir 1). Buna ek olarak, diseksiyon yöntemleri retina yönünü daha da netleştirmek için kombine edilebilir. Örneğin, choroid fissür kesim s-opsin immünhistokimya ile tüm dört Polonyalılar Retina yönlendirmek için kombine edilebilir: burun ve temporal hemisferlerin choroid fissür kesim tarafından belirlenebilir ve s-opsin immünhistokimya teşhis ventral ve dorsal hemisferlerin. Henüz, bu protokol adaptasyon Fizyoloji deneyler zamana duyarlı doğa tarafından sınırlı. O bir dönüm noktası belirlemek, kornea yanmak yapmak ve giderici bir kesim yürütmek için gereken zaman ex vivo deneyler önemli doku ölümüne neden olabilir çünkü bu diseksiyon yöntemlerden bazıları az en uygun olabilir. Neyse ki, bir tetkik derin işaretlerini belirleme ve rahatlatma yapma choroid çatlak veya superior rektus kas diseksiyon yöntemi ile tanıdık haline gelmiştir sonra kesim hızla diseksiyon rutin bir parçası haline ve önemli ölçüde eklemeyin diseksiyon uzunluğu için. Her ne kadar biz burada ayrıntılı adımları zamanında son derece zamana duyarlı deneyler için ekleyebilirsiniz kabul ediyor musunuz, doku canlılığı artık bir sorun (Şekil 3 olduğunda s-opsin degrade hoc sonrası Retina yöndür kullanmanızı öneririz ). S-opsin retina, yönlendirmek için etkili bir yol için dört Polonyalılar tanımlayabilirsiniz gibi retina boyama: s-opsin boyama retina dorsal ve ventral direkleri böler ve bağlı olarak burun ve zamansal Polonyalılar için sağlar retina sağ veya sol göz (Şekil 3) var. Bu nedenle, bu iletişim kuralını yöntemleri deneysel parametrelerin yerine getirebilecek doğru Retina yönlendirme için güvenilir ve yinelenebilir bir dizi sağlar inanıyoruz.
Olarak değiştirilmiş herhangi bir retina diseksiyon ile tetkik ve izole edildikten doku kalitesi doğruluğunu tarafından diseksiyonu yöntemin geçerliliğini sınırlıdır. Herhangi bir doku diseksiyon sırasında kaybolur veya bir retina çok doğru yeniden yapılanma için ezilmiş, Retistruct ve MATLAB programı güvenilir bir şekilde yeniden inşa veya retina yönlendirmek mümkün olmayacaktır. Bu nedenle veri toplamak için kullanarak deneyler önce diseksiyon yöntemi uygulama önemlidir. Burada zor değildir diseksiyonlarının türleri açıkladı iken, onlar belirli bir dönüm noktası ile retina yönlendirme tanımlama tekrarlanabilirlik sağlamak için uygulanan gerekir. Ayrıca, görsel olarak doğru landmark emin olmak için veri toplama başlamadan önce anatomik işaretlerini belirleme tetkik pratik kullanılıyor esastır. Ya choroid fissür yapmak için keser veya superior rektus kas keser ve beri sabit bir işaretleyici ve böylece dissectio doğruluğu üzerinde bağımlı değildir seyiyor s-opsin gradyan için kesim karşılaştırmak belirli bir tetkik doğruluğunu kontrol etmenin bir yolu olduğunu n. potansiyel dissectors Ayrıca kesim Şekil 1 ' de gösterilen doğru Simgesel Yapı ile yeniden oluşturulan Retina örnekleri için yeniden oluşturulan onların Retina karşılaştırmak ve Şekil 2. Esasen, potansiyel bir tetkik belirli diseksiyon türü için bu protokolü bölümünde özetlenen adımları gerçekleştirmeniz gerekir, bu olsun superior rektus kas veya koroid fissür yöntemi ve geçerliliğini kurmak için s-opsin geçişin sonuçları karşılaştırmak bir belirli tetkik. Tetkik Simgesel Yapı konumu hakkında emin değilseniz ise, retina bir yanlış yönde neden olabilir çünkü olacak, varsayılan olarak, veri toplama ve etkiler yorumu.

Bir önemli ve bazen gözden Retina nörolojik uygun yönlendirmeyi ve izole bütün Dağı retina analizini bir retina bir elektrofizyoloji kayıt odasında ya da histolojik slayt üzerindeki yönünü olsun yönüdür. Bu, özellikle şu anda memeli görsel sistemin araştırmalar için en çok kullanılan modeldir fare retina içeren çalışmalar için önemlidir. Fare retina dağınık şekilde üniforma değil ama melanopsin ganglion hücrelerinin, geçici OFF-Alfa ganglion hücrelerinin ve koni opsins1,2 gibi işlevsel olarak farklı Retina hücre tiplerinin yoğunluğu ve boyutu degradeler vardır son keşifler ortaya ,3,4,5. Sonuç olarak, retina yönünü belirlemek için kullanılan yöntemi içeren hücre türü veya opsin dağıtımları2,3,6, deneysel sonuçları etkileyebilecek yönde yön-seçmeli olarak ayarlama ganglion hücreleri7,8,9ve Retina dejenerasyonu10,11,12,13,14 topografik desenleri . Aslında, değil raporlama nasıl Retina yönlendirme bildirilmektedir tutarsızlıkları edebiyat ve karışıklık çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak çalışırken neden olabilir. Bu nedenle araştırmacılar bu tür çalışmaların sonuçları doğru bir şekilde yorumlanabilir için retina yönünü belirleme yöntemi rapor hayati önem taşımaktadır.
Retina yönlendirme sık oküler enükleasyon1,3,12,15,16,17 önce sırt, Menfez, burun veya zamansal kornea Puanlama tarafından tanımlanır ,18,19 veya kesme veya ekstraoküler kaslar6,7gibi simge yapılara derin anatomik göz boyama, koroid fissür20,21, ya da s-opsin degrade2,3. Rektus kasları superior rektus, inferior rektus, medial rektus veya lateral rektus kas, ekin ya bisects bir derin giderici kesim yaparak sırt, Menfez, burun kemiği ve zamansal retina sırasıyla tanımlamak için kullanılabilir. Ancak, çoğu deneyler için bir rektus kas kullanarak retina22yönlendirme için yeterli olur. Göz geliştirme kalıntısı olan choroid yarığın göz arkasında zayıf yatay bir çizgi olarak görülebilir. Bu satır her sonu burun veya küre23zamansal kutup sona erer. Son olarak, s-opsin ifade asimetrik olarak farelerde ventral retina dağıtılır ve s-opsin antikorlar immunohistokimyasal deneyleri1ventral retinada ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Son eseri Stabio, vd. 22 kornea yanığı gibi yüzeysel oküler simge yapılara anatomik uzaydaki insan hatası ve zamansal ve medial kullanırken kornea yanığı yapımında değişkenlik nedeni büyük olasılıkla retina yönlendirme için daha az güvenilir bir yöntem olduğunu gösterdi referans noktaları olarak canthi. Buna ek olarak, derin tarihi yerler, superior rektus kas, choroid fissür ve s-opsin gradyan gibi retina22yönlendirme için daha güvenilir ve doğru yerlerinden olmak gösterilmiştir. Ancak, bu anatomik yerlerinden tanımlaması literatürde ayrıntılı olarak açıklanan değildir benzersiz diseksiyon adımları gerektirir. Böylece, bu iletişim kuralının amacı doğru fare retina kayma yönünü belirlemek için superior rektus kas, choroid fissür ve s-opsin degrade kullanımı hakkında kapsamlı bir eğitim sağlamaktır. Buna ek olarak, iki s-opsin antikorlar yanı sıra s-opsin immünhistokimya için bir iletişim kuralı etkinliğinin karşılaştırılması dahil ettik.
Bir ek meydan okuma çalışmaları üzerinde hassas Retina yönlendirme güvenerek wholemount Retina kayıt odası, yemek veya slayt üzerindeki düzleştirmek için gerekli büyük giderici kesim olduğunu. Bu düz iki boyutlu bir yapı olarak yansıması zaman doğal olarak bir üç boyutlu yapısı nedir analiz için sorunlar ortaya çıkarabilir. Retistruct24 adlı bir program--dan o toplanan verilerin analiz önce düz wholemount retina üç boyutlu yapısını dönmek için kullanılabilir. Böylece, bu iletişim kuralı bir bölümünü s-opsin immunostained fare Retina yeniden oluşturmak için Retistruct yazılım kullanmak için gerekli olan adımları vurgulama için adamıştır. Protokolü was gelişmiş-e doğru döndür ve şark fare Retina s-opsin ile lekeli bizim özel MATLAB komut kullanmak için bir bölümü de dahil ettik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1499px;" width="1498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">0.1 M Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:125px;">P5244</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Axioplan2 Epifluorescent Microscope</td>
			<td style="width:243px;">Zeiss</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Clear Nailpolish</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Corning LSE Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS6780FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Costar TC-Treated 24-well Plates</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:243px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;">SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey anti-Goat Alexa 594</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey anti-Rabbit Alexa 594</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey Normal Serum</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">566460</td>
			<td>Use at 5.2% (52 &#956;L with 86 &#956;L of 20% Triton X-100 and 863 &#956;L of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:243px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Goat anti-s-opsin</td>
			<td style="width:243px;">Santa Cruz Biotechnologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">sc-14363</td>
			<td>Not commerically available as of 2017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Graefe Curved Forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:125px;">11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">ImageJ or FIJI</td>
			<td style="width:243px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td>
			<td style="width:243px;">Bovie Medical Corporation</td>
			<td style="width:125px;">AA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">MATLAB</td>
			<td style="width:243px;">MathWorks</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">At least version 2007b or later</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Micro Cover Glasses&#160;</td>
			<td style="width:243px;">VWR International</td>
			<td style="width:125px;">48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Micro Slide Trays</td>
			<td style="width:243px;">VWR International</td>
			<td style="width:125px;">82020-913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Moira Ultra Fine Forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:125px;">11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">HAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:243px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">15714-S</td>
			<td>Use at 4% (25 &#956;L and 875 &#956;L of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm)&#160;</td>
			<td style="width:243px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:125px;">305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Pyrex Glass Petri Dish</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS3160152</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">R</td>
			<td style="width:243px;">The R Project for Statistical Computing</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software; version 3.4.3 or later</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Rabbit anti-s-opsin</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">ABN1660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Retiga R3 Microscope Camera</td>
			<td style="width:243px;">Qimaging</td>
			<td style="width:125px;">01-RET-R3-R-CLR-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Retistruct</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software&#160; compatiable with Windows 7 or Windows 10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media</td>
			<td style="width:243px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">14-390-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">T8787</td>
			<td>Use 1.7% (86 &#956;L of 20% Triton-X with 52 &#956;L of Donkey Normal Serum and 863 &#956;L of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Vannas Spring Dissection Scissors&#160;</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:125px;">15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">5MP USB Microscope Digital Camera</td>
			<td style="width:243px;">AmScope</td>
			<td style="width:125px;">MU500</td>
			<td>To be used with the Olympus Dissection Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

where you cut matters: a dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks

Boyutu degradeler Retina hücre tiplerinin ve yoğunluk analizi de dahil olmak üzere görsel neuroscience, birçok çalışma için önemli doğru ve güvenilir bir şekilde izole fare retina kayma yönünü belirleme yön yön-seçmeli olarak ayarlama ganglion hücrelerinin ve topografik dejenerasyon desenleri bazı retina hastalıkları olarak muayene. Ancak, tanımlamak ve fare retina Retina yönde etiketlemek için kullanılan literatürde bildirilen birçok farklı oküler diseksiyon yöntemleri vardır. Bu tür çalışmalarda kullanılan yönlendirme yöntemi genellikle gözardı edilir iken değil raporlama nasıl Retina yönlendirme belirlenir tutarsızlıkları edebiyat ve karışıklık çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak çalışırken neden olabilir. Kornea yanığı gibi yüzeysel oküler simge yapılara sık kullanılan ama son zamanlarda rektus kasları, choroid çatlak veya s-opsin gradyan gibi daha derin yerler daha az güvenilir olduğu gösterilmiştir. Burada, kapsamlı bir rehber için doğru bir şekilde incelemek ve bir izole fare retina kayma yönünü belgelemek için derin oküler yerlerinden kullanımını sağlamak. Ayrıca iki s-opsin antikorların etkinliği karşılaştırıldığında ve s-opsin immünhistokimya için bir protokol dahil. Retina göre s-opsin degradenin yönünü Retistruct yazılımı ile retina yeniden yapılanma ve özel kod ile dönme gerektirdiğinden, biz hem bu programları kullanmak için gereken önemli adımlar sundu. Genel olarak, bu iletişim kuralının amacı güvenilir ve yinelenebilir bir dizi yöntem en deneysel protokoller için uyarlanabilir doğru Retina yönlendirme için teslim etmektir. Gelecekteki çalışmaları için Retina yönlendirme yöntemleri standartlaştırmak için bu eser kapsamlı bir amacı olduğunu.

Doğru ve güvenilir bir şekilde üstün rektus kas bisects tek bir rahatlatma kesim dorsal retina (Şekil 1) tanımlar. Choroid fissür doğru ve güvenilir bir şekilde zamansal ve burun choroid fissür (Şekil 2) boyunca derin giderici kesikler burun ve temporal retina tanımlar. Bu örnekte, giderici bir kesim de dorsal retina retina (Şekil 2D, dikey ok) dorsal/ventral ekseni tanımlamak için yapılmıştır. Bu süreçlerin adımları çoğaltma amaçla gelecekteki dissectors tarafından gösterilir. S-opsin immünhistokimya birleşimi (Şekil 3A ve 3D), Retistruct yazılımı (3B, 3E) ile imar ve özel MATLAB kodla (3 C, 3F) doğru dönüş sağlar retina, hem de retina sağ veya sol göz (Şekil 3) olup biliniyorsa burun ve temporal Polonyalılar tahliyeleri ve dorsal yarısı tanımlaması. Biz de etkili şekilde s-opsin koniler (Şekil 4A-D) etiketleme için iki yaygın olarak kullanılan s-opsin birincil antikorlar göre: her iki keçi anti-s-opsin birincil antikor ve tavşan anti-s-opsin birincil antikor etkili bir şekilde etiketleyin s-opsin koniler (Şekil 4E) aynı fare.
Giderici kesim s-opsin yeniden immunostained retina üzerinde tespit edilmiştir ve konumlarına s-opsin degrade tarafından belirlenen şekilde karşılaştırıldı. Bizim özel MATLAB kullanma kodu (bakınız Ek malzemeler), Retina ventrally, böylece doğru yerleştirerek s-opsin boyama en yoğun bulunduğu olması doğru bir şekilde döndürülmüş (için superior rektus) 90 °, 0 ° (için burun doğru nazal, dorsal Choroid fissür) ve geçici (geçici choroid fissür için) 180 ° de gerçek. Açılı kesim değeri her bireyin giderici Retina göre s-opsin degrade döndürülmüş sonra ImageJ içinde açı aracını kullanarak tespit edilmiştir. Ortalama bir açı kesme türü giderici her için hesaplanır ve giderici her kesim türü ortalama değerini daha sonra üzerinde bir kutup çiz (Şekil 6) çizildi. Ortalama olarak, superior rektus kas kesim 96,3 ± 4.3 ° dorsal kutbunda tespit (n = 11) (Şekil 6). Burun choroid fissür 6,7 ± 5.8 ° burun kutbunda tespit ve zamansal choroid fissür 172.0 ± 4,4 ° zamansal kutbunda tespit (n = 9; Şekil 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg"> Şekil 1: doğru sağ gözünde dorsal retinada tanımlamak için superior rektus kas kullanarak. (A) dorsal kornea yanık bir koter ucu kalem (beyaz ok) ile yapılan scleral kornea sınırına yakın bir örnek. Superior rektus kas da bu görünümde (beyaz ok) görünür. Bir rahatlatma ile (B) örnek bir bütün olarak bağlı retina dorsal retinada superior rektus kas parçalamak tarafından yapılan kesti. Ok dorsal retinada superior rektus kas parçalamak tarafından yapılan kesim rahatlatma derin gösteriyor. Retina birincil antikor keçi anti-s-opsin ile lekeli ( Tablo malzemelerigörmek) ve ikincil antikor eşek Anti-keçi Alexa 594 ( Tablo reçetesi; görmek uyarma: 590 nm; Emisyon: 620 nm) (mavi). Retina Texas kırmızı filtre ile bir epifluorescent mikroskopla görüntüsü (595 nm). (C) A retina Retistruct içinde yeniden ve bir özel MATLAB kod ile döndürülmüş ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek) üstün rektus kas görünür kesmek (beyaz ok) giderici ile. D: dorsal V: ventral, T: geçici, N: burun. Ölçek çubukları = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg"> Şekil 2: choroid fissür doğru sağ gözünde retinada burun ve temporal Polonyalılar tanımlamak için kullanarak. (A) dorsal kornea yanık koter ucu kalemle yapılan kornea scleral sınırına yakın bir örnek. (B) koroid fissür sklera (beyaz ok) göz arkasında görünür. Dorsal kornea yanığı da 90 ° zamansal choroid fissür üzerinden bulunan bu görünümde görünür. (C) koroid fissür optik sinir scleral kornea sınıra seyahat sklera, göz arkasında görünür. (D) A retina lekeli keçi anti-s-opsin ile ( Tablo malzemelerigörmek) ve ikincil antikor eşek Anti-keçi Alexa 594 ( Malzemeler tablo; görmek uyarma: 590 nm; Emisyon: 620 nm) ile choroid fissür kesim (yatay (Camgöbeği) oklar) ve sırt giderici (dikey ok) kesti. Retina Texas kırmızı filtre ile bir epifluorescent mikroskopla görüntüsü (595 nm). (E) bir retina Retistruct içinde yeniden ve dorsal giderici kesme ve burun ve temporal choroid fissür kesim görünür (beyaz ok) ile özel MATLAB kodla (bakınız ek malzemeler) döndürülür. D: dorsal V: ventral, T: geçici, N: burun. Ölçek çubukları = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg"> Şekil 3: s-opsin degrade dört Polonyalılar Retina tanımlamak için kullanarak. (A) bir retina örneği disseke immunostained s-opsin etiket ve bir Texas kırmızı filtre ile bir epifluorescent mikroskopla görüntüsü doğru bir göz (595 nm). Topografik yönlendirme s-opsin degrade tarafından belirlenir beri bu retina içinde rasgele kesikler. (B) A Retistruct ile retinada gelinen sonuçlar. Retina özel MATLAB kodu (bkz: Ek malzemeler) çalıştırmak değil çünkü s-opsin degrade doğru uyumlu değildir ki dikkat edin. (C) a retina özel kodla döner sonuçlarını. Retina s-opsin boyama en yoğun alt kısmında yer alır böylece döndürülmüş ve ventral Retina tanımlanır. Retina sağ gözünden olduğundan, zamansal kutup bulunduğu 90 ° saat yönünün tersine dorsal Kutbu'ndan ve burun direği bulunduğu 90 ° saat yönünde dorsal Kutbu'ndan. (D) bir retina örneği disseke immunostained s-opsin etiket ve bir Texas kırmızı filtre ile görüntülü bir sol göz (595 nm). Topografik yönlendirme s-opsin degrade tarafından belirlenir beri bu retina içinde rasgele kesikler. (E) dijital olarak Retistruct ile D retinada gelinen sonuçlar. Retina özel kod tarafından döndürülmüş değil çünkü s-opsin degrade doğru uyumlu değildir ki dikkat edin. (F) D retinada özel kodla döner sonuçlarını. Retina s-opsin boyama en yoğun alt kısmında yer alır böylece döndürülmüş ve ventral Retina tanımlanır. Retina sol gözünden olduğundan, Burun direği bulunduğu 90 ° saat yönünün tersine dorsal Kutbu'ndan ve zamansal kutup bulunduğu 90 ° saat yönünde dorsal Kutbu'ndan. D: dorsal V: ventral, T: geçici, N: burun. Ölçek çubukları = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg"> Şekil 4: s-opsin koni etiketleme iki birincil s-opsin antikorlar karşılaştırılması. (A) A retina lekeli keçi anti-s-opsin birincil antikor ile (bkz. Tablo malzeme). (B) aynı fare diğer retina lekeli tavşan anti-s-opsin birincil antikor ile (bkz. Tablo malzeme). (C) A temsilcisi bölge (0.1 x 0.1 mm2) keçi anti-s-opsin birincil antikor ile lekeli bir retina seçin. Bir epifluorescent mikroskobu 40 X büyütme, alınan görüntü. (D) A temsilcisi bölgesinden (0.1 x 0.1 mm2) bir retina lekeli tavşan anti-s-opsin ile (bkz. Tablo malzeme), bir birincil antikor alternatif. Görüntü üzerinde bir epifluorescent mikroskobu 40 X büyütme, çekildi. İmmunopositive s-kozalakları keçi anti-s-opsin ve tavşan anti-s-opsin, herhangi bir test Retina lekeli sayısında anlamlı bir fark olduğundan (E) her iki antikorlar s-koni dış segmentleri aynı sayıda etiket. eccentricities (n = 2; ANOVA post hoc Bonferroni testi ile; p > 0.05). Ölçek çubukları = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg"> Şekil 5: Retina immunostained s-opsin ile yeniden oluşturmak için Retistruct yazılım kullanmak için görsel bir kılavuz. (A) A retina görülebilir anahat ile Retistruct açıldı ve bir "gözyaşı" eklendi. Puan "Gözyaşı" üst üste Beyaz oklarla gösterilir. Hiçbir belirli landmark diseksiyon sırasında Retina yönlendirme işaretlemek için kullanılan gibi tüm bu retina içinde rasgele, kesikler. Önemli düğmeleri kırmızıyla özetlenmiştir. "Tüm gözyaşları eklendi" ile (B) A retina ve dorsal retina retina kenarına "D" ile tanımlanır. "Yeniden Retina" düğmesini şimdi görünür olduğuna dikkat edin. Önemli düğmeleri kırmızıyla özetlenmiştir. (C) bir retina yeniden yapılandırma işlemi. Yeniden oluşturulan retina kutup Arsa giderici mavi (mavi oklar kesim yerleri açıklığa kavuşturmak için üst üste) keser gösterilen sağda görünür. (D) bir retina Retistruct çalışan nihai sonucu. Orijinal wholemount retina sol tarafta kalır ve yeniden oluşturulan retina sağda gösterilir. Giderici kesim mavi (beyaz ok kesim yerleri açıklığa kavuşturmak için üst üste) görülebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg"> Şekil 6: superior rektus kas ve koroid fissür doğru fare retina yönlendirmek için kullanılabilir. Açıları bir kutup Arsa kesim giderici ya da superior rektus kas elde edilen veya Retistruct ile yeniden Retina choroid fissür keser. Giderici kesim s-opsin yeniden immunostained retina üzerinde tespit edilmiştir ve konumlarına s-opsin geçişin konuma karşılaştırıldı. S-opsin boyama en yoğun bulunduğu ventrally, gerçek dorsal (90 ° superior rektus için) olması doğru bir şekilde Retina döndürmek için özel MATLAB kod kullanarak, burun kemiği (0 ° burun choroid fissür için) gerçek ve zamansal (180 ° zamansal koroid için gerçek fissür) her retina için belirlenmiştir. Her bireysel rahatlatma kesme açısı ImageJ ve ortalama bir açı belirlendi değerini kesme türü giderici her için hesaplanır. Superior rektus kas kesim 96,3 ± 4.3° dorsal kutbunda tespit (n = 11). Burun choroid fissür 6,7 ± 5.8 ° burun kutbunda tespit ve zamansal choroid fissür 172.0 ± 4,5 ° zamansal kutbunda tespit (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Derin Simgesel Yapı</td>
			<td>Kornea yanığı konumu</td>
			<td>Retinanın tespit Kutbu</td>
			<td>Deneysel uygulama</td>
		</tr>
<tr>
<td>Superior rektus</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Canlı ya da sabit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Burun Choroid fissür</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Burun kemiği</td>
			<td>Canlı ya da sabit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zamansal Choroid fissür</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Zamansal</td>
			<td>Canlı ya da sabit</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsin gradyan</td>
			<td>Hiçbiri</td>
			<td>Dorsal, Menfez, burun, zamansal</td>
			<td>Sabit</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Derin yerler, retina Kutbu onlar tespit ve ister canlı ya da sabit doku uygulaması için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks at JoVE.com

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Bu iletişim kuralı derin oküler yerler, s-opsin immünhistokimya, Retistruct ve özel kod doğru ve güvenilir bir şekilde izole fare retina anatomik uzayda yönlendirmek için kullanımı için kapsamlı bir diseksiyon ve analiz rehber sağlar.

Nerede konularda kesme: Bir diseksiyon ve fare Retina mekansal oryantasyon analiz Rehber'den oküler yerler

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K Görüntüleme.  The University of Akron. Bu iletişim kuralı derin oküler yerler, s-opsin immünhistokimya, Retistruct ve özel kod doğru ve güvenilir bir şekilde izole fare retina anatomik uzayda yönlendirmek için kullanımı için kapsamlı bir diseksiyon ve analiz rehber sağlar.

Video: Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Nörobilim

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

Rat Beyin gelen Serebral Yüzey damarları ve İlişkili Beyin zarları ve Diseksiyon ve Koroid Pleksus bir Görsel Açıklama

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Kerevit ve yüzgeç Sistemi: Sinir Kordon ve Motorlu Pattern Extracellular Recordings ve Diseksiyon için Pratik Kılavuzu

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. Lineage-specific transcription factors are considered to play essential roles in cell specification and differentiation during development. ChIP coupled with high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) is widely used to analyze genome-wide binding sites of transcription factors (or its associated complex) to genomic DNA. However, a large number of cells are required for one standard ChIP reaction, which makes it difficult to study the limited number of isolated primary cells or rare cell populations. In order to understand the regulatory mechanism of oligodendrocyte lineage-specific transcription factor Olig2 in acutely purified mouse OPCs, a detailed method using ChIP-seq to identify the genome-wide binding sites of Olig2 (or Olig2 complex) is shown. First, the protocol explains how to purify the platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFR&#945;) positive OPCs from mouse brains. Next, Olig2 antibody mediated ChIP and library construction are performed. The last part describes the bioinformatic software and procedures used for Olig2 ChIP-seq analysis. In summary, this paper reports a method to analyze the genome-wide bindings of transcriptional factor Olig2 in acutely purified brain OPCs.

Here we present a protocol which is designed to analyze the genome-wide binding of the oligodendrocyte transcription factor 2 (Olig2) in acutely purified brain oligodendrocyte precursor cells (OPCs) by performing low-cell chromatin immunoprecipitation (ChIP), library preparation, high-throughput sequencing and bioinformatic data analysis.

Transkripsiyon faktörü Olig2 genomik bağlayıcı siteleri içinde akut tanımlayan PDGFRα + hücreleri tarafından analiz sıralama düşük hücreli Kromatin Immunoprecipitation saf

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;