著者らは、研究デザインに彼女の初期の貢献のヘザー幣制と博士 Swarup ミトラ原稿の彼の批評のために感謝したいと思います。我々 はまた博士マイケル ・ b. ハリスありがとうコメント、改良、この方法論のデモの生産の支援したいと思います。系統は、線虫の遺伝学センター研究基盤プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。この出版物で報告された研究がによって国立科学研究所の一般医療賞を受賞番号 UL1GM118991、TL4GM118992、または RL5GM118990 の下で健康の国民の協会のやから機関の開発賞 (アイデア) サポートされています。国立科学研究所の一般医療許可番号 5P20GM103395-15 の下で健康の国民の協会の。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。UA は AA/EO の雇用者、教育機関、個人に対する違法な差別を禁止: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination。

1線虫ふるいの構築とその利用。
<ol><li>
構築プロトコル
	<ol>
<li>50 mL コニカル チューブ (図 1 a) から 2 蓋を取得します。</li>
		<li>(下の図 1 bから見た) ときに蓋の内側の唇の内側中心領域を削除するブンゼン バーナーと熱い金属プローブまたははんだごてを使用してまたはドリルを歩んだ。 注: はプラスチック製の蓋をカットする熱を使用して怪我のリスクが軽減されるためブレードすることが望ましいです。</li>
		<li>きれいとカットエッジの砂そして湾曲したファイルや研削工具 (例えばドレメル) ロータリーで表面をトップします。図 1を参照してください。</li>
		<li>適切な直径 (図 1) にモノフィラメント メッシュの円をカットします。このため、モノフィラメント ナイロン メッシュ シートの上にふたをトレースし、線のすぐ内側をカットします。</li>
		<li>接着剤がプラスチック (図 1E) に適用される 2 つの蓋の密着力が向上する蓋の上面に溝/スラッシュをカットします。</li>
		<li>エタノールとの蓋をきれいにし乾燥させます。</li>
		<li>シアノアクリ レート系接着剤を外側の縁を維持する両方の蓋の上面に適用します。 注: 少しの接着剤は、長い道のりを行きます。</li>
		<li>テーブル 1によるとモノフィラメント メッシュを 1 つ接着蓋 (図 1 階) に横たわっていた。メッシュの上に反転 2 番目のふたを配置します。両方の蓋はそのトップを一緒に必要です。しっかりと一緒に (図 1) を押します。メッシュを張ったことを確認します。 注: 安全策、蓋にメッシュを配置する使用ピンセットとして。</li>
		<li>一度接着剤の初期の層が乾燥している、蓋隙間の外側周囲にシアノアクリ レート系接着剤のリングを適用します。これは整合性を追加し、離れてまたは漏れている任意の剥離防止、寛大であります。</li>
		<li>モノフィラメント メッシュのメッシュ孔径フィルターをラベル付けします。 注: ここでは、我々 使用 2 つのメッシュ孔径-20 μ m、50 μ m。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
使用プロトコル
	<ol>
<li>あらかじめふるいを濡れています。<ol>
<li>M9 などの食塩液をピペット [Na2HPO4の 6 g、KH2PO41 L の純水 H2O と MgSO4 (1 M) の 1 つの mL の 3 g, 塩化ナトリウム 5 g]17、液滴フォームまでふるいの中心を通る、、凝縮してフィルターの下部 (図 2 a) の中心部に出る。必要に応じて、図形を下 (例えばキムワイプ) 糸くずのワイプを適用またはメッシュの水分液滴を広めます。</li>
			<li>50 mL の円錐管にふるいを置きます。'廃棄物管' として管のラベル (図 2 b)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>寒天プレートにc. の elegansの人口を洗います。<ol>
<li>M9 バッファーを洗浄し、時 (図 2) モノフィラメント メッシュ 1 mL の甲板上でワームを含む媒体を配置します。メッシュの中心で動作することを確認します。プレートからすべてのワームを洗います。 注: 通常、60 mm の板の M9 の 3 mL で十分です。</li>
			<li>、ピペッティングで失われたワームの数を最小限に抑えるガラス パスツール ピペットを使用して (必要に応じて繰り返す) メッシュ中心にプレートからワームを移動します。</li>
			<li>上から M9 バッファーが付いているフィルターをすすいでください。また、メッシュの中心で動作し、その地域のすべてのワームを洗浄することを確認します。すべての細菌や小さいワームは、メッシュを通過したことを確認する必要な回数だけを洗います。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ふるいのサイズ一致動物を収穫します。<ol>
<li>1.2.2.3 新しいコレクション チューブ (図 2 D) の内側に直面してのステップから大人のワームで、ふるいの上に新しい 50 mL のコニカル チューブを取り付けます。</li>
			<li>最初 (廃棄物管) を削除し、すぐにふるいと液滴が移行するを防ぐために新しい管を裏返して (図 2 e)。 注: 不妊が必要ない場合ワイプを使用糸くず (例えばキムワイプ) 芯液を反転する前にメッシュの底から。</li>
			<li>新しい上面 (図 2 f) から新しい 50 mL のチューブに M9 を使用してメッシュをすすいでください。もう一度、メッシュ センターで動作し、メッシュの下側に液滴を維持します。</li>
			<li>解決または優しくそれらをスピンダウンするワームを許可する (例えば、< 16 x g) 約 1 分 (図 2)。</li>
			<li>下に理想的にワームは、ペレットから緩衝液を吸い出しなさい > 0.5 mL またはペレットを乱すことがなく、できるだけ多くの流体を削除します。</li>
			<li>ガラス NGM プレート上にパスツール ピペットを使用してワームのピペットし、乾燥させます。スペース複数液滴を新しいプレートにので、彼らはより高速な (図 2 H) を乾燥.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ふるいをクリーンアップします。<ol>
<li>エタノールや逆浸透膜の水でやさしく、徹底的にふるいをすすぎます。乾燥させてください。</li>
			<li>無期限の将来使用するための清潔な容器に保管してください。</li>
			<li>メッシュ「サグ」外観を開発するときは、それを破棄します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2.線虫ふるい選別法の検証
<ol><li>一般的なメンテナンス
	<ol>
<li>すべての実験の文化ワーム標準線虫成長媒体17 (NGM の 1 L で構成されています, 塩化ナトリウム 3 g、975 mL 二重蒸留水 1 mL 1 M CaCl2のコレステロール 5 mg/mL の 1 mL の寒天培地の 17 g ペプトンの 2.5 g、1 M MgSO4の 1 mL、1 M KHPO4、25 mL と 100 mg/mL ストレプトマイシンの 0.5 mL) 25 ° C で</li>
	</ol></li>
	<li>実験的な治療管理
	<ol>
<li>3 つの治療群の比較: ピック、フルオロデオキシウリジン (FUDR) と線虫ふるい。<ol>
<li>FUDR 治療グループのすべての子孫の生産を防ぐために 100 μ M の最終的な集中に NGM メディアに 100 mg/mL FUDR を追加し、ワーム一日おきを食糧の枯渇を避けるために新鮮な NGM プレートに転送します。</li>
			<li>ピックアップ グループの選択し、プラチナ ループを使用して手動でワームを転送します。</li>
			<li>線虫ふるい治療グループの手順 1.2、NGM プレート上にワームをピペットします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>線虫ふるい割合収量
	<ol>
<li>ふるいはc. の elegansのソートにどのように効果的な定量化する 25 の ° C を (すなわち、産卵後 48 h) で成人の 1 日に時代同期の N2 動物を成長し、新鮮な NGM プレートにそれらを選ぶことによって転送 (合計 N = 50 または N = トレあたり 100 動物atment グループ)。</li>
		<li>回復の 24 h は NGM プレートに新しい人口を転送した後は、以下線虫ふるいとプロトコル (手順 1.2 参照) と正常に転送された動物の数をカウントします。</li>
		<li>100 (%) を掛けた伝冒頭に開始番号と比較して転送される動物の数の比率としてパーセントの利回りを計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan の試金 注: スコア運動クラス、咽頭ポンプ速度と、前方と後方の穏やかなタッチ応答の両方の healthspan パラメーターを 2、4、6、および 8 歳同期 N2 動物 25 ° C で維持のため成人の日に<ol>
<li>運動の追跡<ol>
<li>クラス ベースのシステム (クラス A、B、および C) に基づく運動スコアを割り当てる次のハーンらの方法18. 統計解析ソフトウェアで序数物流統計モデルを使用して 3 つの実験グループの効果を比較します。 注: クラス A 個人は、通常、正弦波パターンで自発的に移動します。B クラス個人は著しく正弦波運動で移動し、肝いりの動きを奨励する必要があります。クラス C 催促に応えて彼らの頭や尾を移動が、寒天の間で移動することができます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>咽頭ポンプ速度<ol>
<li>1 分の最終倍率 X 600 で実体顕微鏡下で視覚的に動物のターミナル咽頭電球のグラインダーの動きを数えます。</li>
			<li>Α で一方向の分散分析と統計解析の実施 = 0.05 とボンフェローニ後テスト α = 0.05。</li>
		</ol>
</li>
		<li>タッチレス ポンス<ol>
<li>優しいタッチの応答を記録し、3 つの治療群間で比較します。カリクストらによって記述された手法に基づく試金を実行します。19。</li>
			<li>レコード前方と後方、そっと尾または動物の頭部 (5 x、交互の頭と尾) にわたって垂直まつげピックのストロークによって応答をタップします。</li>
			<li>0 ~ 5 の規模で 1 ポイントとしてストロークの逆方向に前部・後部の応答の任意の動きを獲得します。</li>
			<li>Α で一方向の分散分析と統計解析の実施 = 0.05 とボンフェローニ後テスト α = 0.05。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>多産の試金
	<ol>
<li>再生への線虫ふるいの影響の使用を決定するには、時代同期の N2 動物を 25 ° C で成人期の 2 日目に成長します。</li>
		<li>60 h 卵を産むが後、転送プラチナ ピックと線虫ふるい NGM プレートに新しい動物、それらに回復する 4 h を与える (20-30 分のふるわれたプレートを乾燥する)。</li>
		<li>まつげを介して動物選ぶ NGM プレート プレート個別に回復後、卵を産むための 24 時間を与えるし、動物を削除します。別の 24 h の 25 ° C で通常の条件の下で開発する各プレートの子孫を許可します。 注: まつげピックは人間のまつげマニキュア液をパスツール ピペットの最後に確保し、エタノールで消毒します。</li>
		<li>実行可能な F1 世代の個体数を数えます。Α で T 検定を使用して統計分析を実行 = 0.05。 注: 実行可能な子孫が正常に孵化し、幼虫の定期的サイクルを通じて彼らの開発を開始する卵としてと見なされます。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光レポーター ストレス応答の試金
	<ol>
<li>ストレスの潜在的なマーカーを検出するための 3 つの一般的に使用される蛍光レポーター アッセイを実行: ひずみ [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol 6)]20; 細胞の核に DAF 16::GFP 転座hsp 16.2 式 [TJ375 gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21;sod 3 式 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>各試金のための文化 20 の ° C の 3 つの治療グループから時代同期の動物、成年期の 3 日目でそれらを調べて: 否定的なコントロールを使用して (日常的にプラチナ ピックを使って手動で動物のグループを移転)、(日常的に肯定的な制御、手動でプラチナを選ぶと確立されたストレス動物のグループを転送)、と線虫ふるい (篩を動物を通過し、イメージングの直前に NGM 上で 30 分間回復し)。</li>
		<li>DAF 16::GFP のアッセイで熱は20をイメージングする前に 30 分の 37 ° C で肯定的な対照動物を衝撃します。Hsp 16.2 試金のため熱衝撃 90 分、21をイメージングする前に 20 h 肯定的な制御動物です。Sod 3 試金のため22をイメージングする前に 4 h 100 mM パラコートと陽性対照動物を扱います。</li>
		<li>まつげを選ぶとすぐにワームを収穫し、ワームを動けなく 36% poloxamer 407 界面活性剤溶液 1 μ L を観察するそれらをマウントします。</li>
		<li>別の coverslip でマウントされたワームをサンドイッチします。標準的なガラス顕微鏡スライド、画像 2 つ coverslips FITC フィルター (80 X の全体倍率) の倒立蛍光顕微鏡に 8 倍の倍率と一定の露出を使用してワームをマウントします。</li>
		<li>DAF 16::GFP 試金の 3 つのグループ間の違いを検出するには、DAF 16::GFP レポーター (原子力記者が細胞質と中間に位置する場合記者が核、細胞質へ転流する場合の位置に基づいて動物を分類します。記者核および細胞質の両方である)。</li>
		<li>統計解析ソフトウェアの序数物流統計モデルを使用して結果を比較します。Hsp 16.2 と sod 3 式の試金は α で一方通行 ANOVA を使用 = 0.05 とテューキー投稿アドホックテスト α = 0.05 頭部領域の合計蛍光性を比較します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

ここで、デザインと並べ替えと線虫を維持するためのツールとしてアクセス可能な効果的な線虫のふるいの使用を紹介しました。このツールには、手動で集団、化学処理 (例えばFUDR)、および分離動物のより高価な方法を洗濯、個々 の動物を狩りにいくつかの利点があります。まず、線虫ふるい効率的かつ迅速に (20 分以内) 動物 (表 2) の大規模な混合?...

線虫、線虫はプレミア モデル生物です。研究室では、その栽培の簡単かつ制御された自然、に加えて彼らの全体のゲノムはシーケンス1と各細胞の発生運命は2知られています。これらの機能により線虫は遺伝学的研究のため広く使用されているモデル生物です。しかし、これらの有益な特性と一緒にには、研究者のいくつかの課題を来る。彼らの急速な生成の時間、 c. の elegans集団食品のうち実行することができますすぐにおよび/または複数の世代の集団を混合になって、発達段階を一度に提示します。したがって、固体線虫成長媒体 (NGM) の実験は研究者が細菌の食料源を使い果たすし、新しい幼虫を開発する前に、新鮮なプレートに動物を物理的に移動する必要。子孫世代と混ざらないから実験集団を防ぐために必要な動物の頻繁に転送するよう、これは退屈なことができます。それでも、いくつかの実験には、両方の多数の動物と長時間ポイント (例えば、成人期に DNA または RNA の抽出) が必要があります。これは正確に同期の人口を維持して、動物の数が多いを転送の課題を化合物します。
NGM 上で培養した線虫を転送する現在の方法は、ピッキングや洗濯の動物プレート;化学的に (例えば、DNA 複製阻害剤フルオロデオキシウリジンまたは FUDR); 動物の治療またはウェルプレートで動物を並べ替えるにフローサイトメトリーを使用して。ピッキングには、個人または複数の動物3,4を手動で転送する白金細線または、まつげで作られた手のひらツールの使用が含まれます。このメソッドの正確なが、スキルと時間が必要です、多数の動物の研究の制限。また 5 月を選ぶ可能性のある障害と力の不自然なと一貫性のない金額を個人をかけることによって物理的に有害な動物にストレスであります。洗濯と緩衝液の培養皿を洗浄し、新しい培養プレートにガラス パスツール ピペットで動物とソリューションを移すことを含みます。このメソッドでは複数の世代と動物の発達段階が一括で転送されるときに正確ではないが、迅速かつ効率的です。FUDR などの化学治療は、DNA 複製としたがって、配偶子の生産と卵の開発ブロックを介して子孫の生産を防ぐために養殖のメディアに溶解できます。しばらくの間効果的な正常発達プロセスを中断させないよう発達成熟後このメソッドを適用する必要があります、これはその管理3の前に動物を譲渡する必要がまだあることを意味します。このメソッドに複数携帯シグナル伝達経路、彼らの年齢として動物に顕著な影響の結果として (例えば、寿命延長または変更されたプロテオステイシス) c. の elegans使用5のひずみによっても影響します。 6,7,8,9,10。フローサイトメトリー メソッドは自動的に並べ替えし、別111 つのウェル プレートから個々 のc. の elegansを転送します。この方法は非常に効果的かつ効率的な流れの cytometry の機器は高価であり、多くの研究者がアクセスできません。動物を転送する代わりに、温度に敏感、 fer 15や有限要素法 1、温度調整12と無菌になるなど突然変異体のモデルを使用します。突然変異動物の使用はいくつかの状況で役に立つ、これらの特定の系統の野生型の動物よりも遅い成長、エージングや健康的なワームの貧しい人々 の代表者として、変化のゲノムに依存しています。また、不妊を引き起こす温度シフトへの依存はまた静的な環境の欠如の結果、遺伝子表現13,14,に影響を与える温度変化が容易に示されている15. 研究グループは以前のサイズ16 c. の elegansをフィルターするメッシュの使用を記述する技術を公開しています。しかし、このようなフィルターの使用と関連付けられるかもしれない全体的な健康の結果の変更テストの前の仕事を見つけることができませんでした。
こうして、線虫研究コミュニティ内で培養皿間動物の大きい数を転送するための手頃な価格、効率的、迅速、かつ正確な方法の必要性があります。(名前は線虫ふるい) 装置とその製造と線虫研究コミュニティのニーズを満たす操作の関連付けられているプロトコルの改良、アクセス可能な部分を開発しました。ここで、我々 は線虫ふるいとその使用方法の設計を共有し、一般的な健康または任意のストレス マーカー標準手動狩りと一般的使用、治療と比較した場合、その使用が影響しませんを紹介不妊治療を制限する化学 FUDR。

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

線虫(C. elegans) は基本的な生物医学の研究の範囲にわたって使用確立モデル生物です。線虫の研究コミュニティの中でc. の elegansの大規模な年齢をマッチさせた集団を維持する手頃な価格で効果的な方法の必要性があります。機械的に並べ替えと線虫のクリーニングの方法論を紹介します。私たちの目的は、均一サイズおよび実験での使用のためのライフ ステージの動物を取得するコスト効果の高い、効率的な高速、簡単なプロセスを提供することです。このツールは、線虫のふるいは、一般的な円錐ラボ チューブにスレッドし、線虫体サイズに基づいてを並べ替え特注蓋システムを使用してください。また線虫ふるい効果的にから転送する動物 1 つ培養プレート別急速な並べ替え、同期、および健康のマーカーに影響を与えることがなく洗浄できることを示す運動などストレス誘導性遺伝子記者。このアクセス可能な革新的なツールはc. の elegans個体群を維持するため高速で効率的、かつ非ストレスの多いオプションです。

線虫ふるい 2 のスクリュー キャップの簡単な洗浄法を用いた生物の生きている人口を抽出するために使用目的の発達年齢の体径より不織布ナイロン モノフィラメント メッシュの領域を確保で構成されます。標準の円錐管に添付し、機械的にチューブでさらにメンテナンス及び実験 (例えば、転送または遺伝の収穫) を行う準備ができて希望の動物を残し...

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

現在のプロトコルを含むソートと年齢をマッチさせた集団のクリーニングの方法論線虫。それは研究用の線虫の実験的人口を取得するのに単純な安価なとカスタムメイドの効率的なツールを使用します。

線虫ふるい: ローテク装置と小型の多細胞生物の並べ替えのための方法論

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K ビュー.  University of Alaska Fairbanks. 現在のプロトコルを含むソートと年齢をマッチさせた集団のクリーニングの方法論線虫。それは研究用の線虫の実験的人口を取得するのに単純な安価なとカスタムメイドの効率的なツールを使用します。

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

発生生物学

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

環境学

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

遺伝学

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

の自動分離<em&gt; C.虫</em&gt;可変細菌性病原体の植民地

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

免疫・感染学

Automatic Image Processing to Determine the Community Size Structure of Riverine Macroinvertebrates

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community size structure responds to biotic and abiotic gradients, including anthropogenic perturbations across taxa and ecosystems. However, the manual measurement of small-bodied organisms such as benthic macroinvertebrates (e.g., &gt;500 &#181;m to a few centimeters long) is time-consuming. To expedite the estimation of community size structure, here, we developed a protocol to semi-automatically measure the individual body size of preserved river macroinvertebrates, which are one of the most commonly used bioindicators for assessing the ecological status of freshwater ecosystems. This protocol is adapted from an existing methodology developed to scan marine mesozooplankton with a scanning system designed for water samples. The protocol consists of three main steps: (1) scanning subsamples (fine and coarse sample size fractions) of river macroinvertebrates and processing the digitized images to individualize each detected object in each image; (2) creating, evaluating, and validating a learning set through artificial intelligence to semi-automatically separate the individual images of macroinvertebrates from detritus and artifacts in the scanned samples; and (3) depicting the size structure of the macroinvertebrate communities. In addition to the protocol, this work includes the calibration results and enumerates several challenges and recommendations to adapt the procedure to macroinvertebrate samples and to consider for further improvements. Overall, the results support the use of the presented scanning system for the automatic body size measurement of river macroinvertebrates and suggest that the depiction of their size spectrum is a valuable tool for the rapid bioassessment of freshwater ecosystems.

The article is based on the creation of an adapted protocol to scan, detect, sort, and identify digitized objects corresponding to benthic river macroinvertebrates using a semi-automatic imaging procedure. This procedure allows the acquisition of the individual size distributions and size metrics of a macroinvertebrate community in about 1 h.

河川大型無脊椎動物の群集サイズ構造を決定するための自動画像処理

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

イン・シトゥバイオプロセスにおける単細胞形態のリアルタイム測定のための顕微鏡検査

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

生物工学

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

の仕分け<em&gt;ストレプトミセス</em複合オブジェクトパラメトリック·アナライザおよびソーターの使用&gt;細胞ペレット

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

生物学

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

線虫ふるい: ローテク装置と小型の多細胞生物の並べ替えのための方法論

要約

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フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

特徴マイクロバイダイナミクス-フローサイトメトリーベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

大規模混合ステージカエノハブディティス・エレガンス集団の文化とアッセイ

の自動分離

河川大型無脊椎動物の群集サイズ構造を決定するための自動画像処理

イン・シトゥバイオプロセスにおける単細胞形態のリアルタイム測定のための顕微鏡検査

の仕分け

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

線虫ふるい: ローテク装置と小型の多細胞生物の並べ替えのための方法論

要約

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フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

の自動分離

河川大型無脊椎動物の群集サイズ構造を決定するための自動画像処理

イン・シトゥバイオプロセスにおける単細胞形態のリアルタイム測定のための顕微鏡検査

の仕分け

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

特徴マイクロバイダイナミクス-フローサイトメトリーベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

大規模混合ステージカエノハブディティス・エレガンス集団の文化とアッセイ