2日齢の液体増殖させた培養物からのペレットを分析し、ソートストレプトマイセスするための手順を模式的に図1に示されている。方法の詳細は以下の通りである。 1。 （メディアとバッファの作成を含む）の成長<ol><li> （; pH7.4に調整し、蒸留水1Lに80グラムのNaCl、2mMのKCl、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2.4グラムのKH 2 PO 4 PBS）10×リン酸緩衝生理食塩水を1リットル調製する。使用時にPBSを1 Lを得るために、蒸留水900ミリリットルに10倍のPBS 100ミリリットルを追加。 </li><li> YEME培地1L（3グラムDifco酵母エキス、5グラムバクトペプトン、3グラムオキソイド麦芽エキス、10グラムのブドウ糖、340グラムのスクロース、1Lの蒸留水まで）および2.5MのMgCl 2を 100ミリリットルを用意します。オートクレーブで両方のソリューションを殺菌。また、他のストレプトミセスメディアは4,14を使用することができることに注意してください。 </li><li>に100ミリリットルYEME培地および0.2ミリリットルの2.5MのMgCl 2を追加します。無菌250ミリリットルの三角フラスコは、金属コイルばねを装備。勉強する細菌サンプルと同じ数のフラスコを準備します。 </li><li> 10 6胞子/ mlの胞子濃度を得るために、 ストレプトマイセス 10 8胞子を各フラスコに接種する。 180rpmで振盪しながら30℃で2日間細菌を成長させる。 </li></ol> 2。サンプリング<ol><li>無菌5ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルファルコンチューブに各培養物から5ミリリットルのサンプルを転送します。サンプル全体の文化を代表することを確実にするためにサンプルを採取しながら、ゆっくりと文化を振る。 </li><li>サンプルはCOPASで直ちに分析されたら、[いいえサンプル調製手順は必要ありません。氷の上にサンプルを保持し、このプロトコルの3.1に進みます。サンプルは、後の時点で分析すると、このプロトコルの工程2.3-2.5に記載されるようにペレットを修正する。適切analys後に洗浄しない場合にも、固定管系における細菌の増殖を阻止することに注意してくださいES。ホルムアルデヒドとの固定は、下流分析を妨げていないことを確認してください。例えば、RNAをホルムアルデヒドで固定した後、真菌のペレットから分離することができませんでした。対照的に、RNAが正常の70％エタノールで固定した12後に単離した。 </li><li>試料5mlに37％ホルムアルデヒド600μLを加え、チューブ3回転倒混和。 30分間氷上でサンプルを修正します。 </li><li>遠心分離機10分間4℃で固定ローターで2500×gでのサンプル。慎重に上清を除去し、PBS 5mlでペレットを洗う。 </li><li>ペレットをPBS 2Xで洗浄されるように、ステップ2.4​​を繰り返します。試料は、数週間、4℃でPBS中に保存することができる。 </li></ol> 3。 COPAS分析<ol><li> COPASプラス、ポンプ、コンピュータおよび488nmのアルゴンレーザーがオンになってBiosortソフトウェアを起動していることを確認します。オンが、レーザーは、まだスタンバイモデュスになります。 </li><li>シース液ボトルがいっぱいでないか確認してください廃液ボトルが空になっています。 </li><li>上にスタンバイから488 nmのアルゴンレーザーを切り替えて「開始」を押した後に「RUN」をクリックします。レーザーがオンのときにしてから約60秒で、[完了]をクリックします。 </li><li>圧力計を確認してください。 「シース」のための圧力は、「サンプル」、「ソーター」と「​​クリーン」は、それぞれの周りに4.0、0.5、2.7、および10.9をお読みください。 </li><li>次の「圧力OK」のチェックボックスをクリックします。次に、システムは、フローセルをプライミングし、使用する準備ができている。 </li><li>標準設定は11で、「遅延」と「幅」7と想定されます。しきい値は、飛行時間を表すTOFで、「TOF最小 &#39;の&#39;信号 &#39;の50と40に設定されている。 （完全を期すために：すべての &#39;利益&#39;が1に設定され、トリガが2.50 MHzのが選択されている「スキャンレートを選択して「下のEXT（絶滅）にし、「構成」タブで設定されている一致が「強化」に設定されています）。 </li><li>サンプルカップのANから残った水を除去D（50ミリリットル程度）のPBSと一緒にカップにステップ2.2または2.5からのストレプトマイセス·サンプルの0.1ミリリットルを追加。サンプルカップが適切に閉じられていることを確認します。 </li><li>データの収集を開始するには、[取得]をクリックします。毎秒30〜50のイベントの間で取得するために流速を管理します。流量が高すぎる場合、試料カップにPBSを追加する。流速が低すぎる場合、より多くのサンプルを追加する。 </li><li>少なくとも2500のイベントは、クリック &#39;stop&#39;を収集しているとき。すべてのデータを保存するには、「ストア」をクリックして、その後の統計分析のためのあなたのファイルを保存します。 Biosortソフトウェアは、。txtファイルは、その後の分析に使用される、そのうちの4つのファイル内のデータを保存します。 </li><li> 50ミリリットルの注射器と水2Xで洗浄してサンプルを除去することにより、試料カップを清掃してください。 </li><li>すべてのサンプルが分析されるまで繰り返して3.7から3.10を繰り返します。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li> txtファイルを開いて、（例えば、MS Excel用を使用して）25よりも低く、EXTを使用してデータを破棄します。この4,12（ アスペルギルスニガーのために150よりも低く、EXTとすべてのデータが破棄される）破片とゆるい菌糸断片に対応しています。その後、平野&#39;。TXT」ファイルに1列のすべてのTOFを保存（：多くのデータのためには、これはから入手できるプログラミング言語R、自動化することができるファイル<a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ）。 </li><li>あるSciLab（http://www.scilab.org/からバージョン5.3.2以降）が、一緒に説明書と、提供されています &#39;fittools」ライブラリと共にインストールさからのものであることを確認してください。 http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual％20fittools.pdf </li><li>あるSciLabを起動し、データをモデル化するためにfittoolsライブラリの必要な機能を実行します。要するに：（一度だけ必要とされる）取扱説明書に示されているようfittoolsライブラリをインストールします。 <ol><li> fittoolsライブラリをロードします。 </li><li>あるSciLabにデータ（ &#39;。TXT」ファイル）をお読みください。 </li><li>（自然対数は、デフォルトのログ機能である）データを変換ログインします。 </li><li>データへの2集団のモデルに適合。 </li><li>ヒストグラムとモデル（オプション）とのグラフをプロットします。 </li><li>データ（千回の反復）のブートストラップ。 </li><li>ブートストラップデータセットにモデルを当てはめる。 </li><li> 5パラメータの推定値の間隔の信頼を得る。これは集団の参加率（P）については、その2手段（μ1、μ2）および添付の標準偏差（α1とα2）を提供します。さらに、95％信頼区間（千回の反復）12,13,15をブートストラップした後にモデルと再装着によって決定されます。平均の信頼区間が重複しないとpの信頼区間は0.025から0.975の間にある場合、データセットは正規分布の二つの集団の組み合わせとして説明することができる。 （TH注大型ペレットの参加は1であるのに対し、小さなペレットの参加割合で、Pである- P）TOFおよびストレプトマイセス·ペレットの直径との関係は、0.57×TOF + 159ミクロン4に等しい。 </li></ol></li><li>場合、2つの集団は、平均のTOFはその後、大小のペレットを並べ替えるには上限と下限としてCOPASのパラメータを並べ替えるなどの用途が見出されている。また、他の仕分けパラメーターは、ユーザーの要求に応じて選択することができることに留意されたい。 </li></ol> 5。ペレット選別<ol><li>ステップ3.7で説明したようにソートする必要があるストレプトミセス·サンプルをロードします。 </li><li> 「制限のソート」に設定し、最小限の（LO）および最大（HI）のTOF値についての詳細を提供します。別の方法として、「地域」を押した後に所望の寸法や特性を持つペレットを選択するために「ゲート領域を規定する」を選択することで、領域を設定。 </li><li> 50 mlチューブをソートパラメータを満たす複数のペレットを収集します。あるいは、マイクロタイタープレートは、個々のペレットをソートするために使用することができる。複数のペレット（10 4〜10 5）を、DNAおよびタンパク質抽出のために必要とされる。単一のペレットは、遺伝子発現のqPCR分析のために十分であるが、複数のペレットをRNA配列決定のために必要とされる。 </li><li>ソートされ、選択したパラメータのためにソートする並べ替え手動」をクリックする必要のあるペレットの数を決定し、設定します。ペレットの設定量に達すると、自動的にソートが終了する。 </li><li>サンプルカップから50ミリリットルのシリンジでサンプル上左を取り外し、水2Xでカップを洗う。他のサンプルをソートする必要がある場合は、繰り返して5.1から5.5を繰り返します。 </li><li> COPASをシャットダウンする前に、残りのペレットを除去し、70％EtOHでサンプルカップおよび/または水中の2％の次亜塩素酸をきれいに水でサンプルカップをすすいでください。システム全体をきれいにし、水でこれを繰り返すように塩素水のサンプルを実行します。空トン彼は、コンテナとクリーンをオーバーフローするか、このコンテナ内に存在するフィルターを交換してください。 </li><li>終了したら、システムからの圧力を解放するために「停止」をクリックします。モータが停止してプログラムを閉じて、「パージせずにシャットダウン」をクリックする。その後、コンピュータ、COPAS、レーザー、ポンプのスイッチを切る。 </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. 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J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

クローン集団6に異質の我々の理解に貢献した、単一の多数の細胞を高速に分析を可能にしたフローサイトメトリー。定期的なフローサイトメトリーは、放線菌や真菌の菌糸体多細胞ペレットの分析のための現実的ではありません。我々の研究は、 ストレプトマイセス·ペレットの高スループット分析がCOPASを用いて実現可能であることを実証した。ここで説明する手順は簡単、迅速、かつ再現性が高い。機器の操作中に心に留めておくべき重要なパラメータは、100イベント/秒（本プロトコールのステップ3.8）を超えないようにしてください流速、である。ペレット濃度、および従って、流速が高くなりすぎた場合、器具は、個々のペレットの検出に失敗したため、TOF値が正しく計算される。十分にPBSを添加することによって試料を希釈することで、この問題を克服する。 制限事項 COPASプラス使用<html>ここでdは30-700ミクロンの範囲のサイズを有する粒子を測定するのに適した1mmのノズル径を有する。このノズルは、したがって、放線菌によって形成されたペレットを測定することができます。糸状菌の場合には、マイクロコロニーはCOPASプラスの一般的な適用性を制限する、大きくてもよい。 COPAS XLサイズは1500ミクロンまでの粒子を測定することができますが、径の範囲内で、その感度はCOPASプラスに比べて少ない。 COPAS PlusとCOPAS XLの両方が30ミクロン未満の粒子を分析することはできません。これは、個々の微生物の胞子または細胞を分析することができないことを意味する。また、COPAS正確胞子および細胞または非常に小さいマイクロコロニーの小さな凝集を分析しないことがあります。このために、定期的なセルアナライザーを使用する必要があります。この制限は1-1,500ミクロンの範囲の粒子を分析することができ連合BiometricaのBiosorterによって克服される。購入賞は、しかし高い。 T &quot;&gt; トラブルシューティング COPASは操作が簡単で信頼性の高い測定器です。しかし、時にはペレットをサンプルカップに試料を装填し、測定を開始した後に検出されない。原因は、典型的には、容易に「クリーン」コマンドを押すことによって解決することができる詰まり入口チューブである。これはサンプルカップに戻す配管システムからのペレットを強制します。代替の理由は、蓋が適切に試料カップ上に置かれていないことかもしれません。これにより、圧力損失を検出するためのペレット付随失敗につながる。 意義と今後の方向性 ここでは、ペレットの大きさの分析に焦点を当てたが、COPASセットアップも分析することができ、並べ替えの蛍光と密度に基づいています。蛍光検出は、GFPなどのレポーターに基づく遺伝子発現を解析することを可能にします。さらに、細胞の組成物を評価することができる。さらに強力なこれらのパラメーターに応じてペレットを分離するオプションがあるTERS。ソートされたペレットは、全オミクス研究を含む下流の分析のために使用することができる。確かに、我々は以前60,000大型20万の小さなペレットをソートされ、プロテオームは、大小のペレット4の間に有意差があったことを明らかにした。この技術は、したがって、細胞工場としてストレプトミセスを向上させるために新たなリードを提供します。 COPAS技術の主な利点は、時間です。細胞ペレット上の以前の研究は、顕微鏡を用いて行われ、これは数百16まで分析することができるペレットの数を制限した。顕微鏡研究は、すでに液体成長ストレプトミセス培養 16内のペレットの2集団が存在することを示唆した。実際に、ペレットの二つの集団は、異なるストレプト4多数のかかわらず、培養条件の検出された。このサイズの不均一性は糸状放線菌に限定されるものではなく、糸状菌12で観察された&lt;/ SUP&gt;。全ての場合において、不均一性の根本的なメカニズムはまだ知られていない。ペレットをソートする可能性は大きさや蛍光によるこのようなメカニズムを解明することを可能にします。

放線菌は、糸状土壌ウェル抗生物質を作るためにそれらの技能のために知られている細菌、ならびに免疫抑制剤として使用され得るか、または真菌感染または癌と闘うために、1,2の化合物である。加えて、これらの生物は、工業的用途3広範囲の関心のある酵素を産生する。これらの商業的に興味深い化合物のほとんどは、バイオリアクター中で産生される。バイオリアクターにおける放線菌の成長は、塊又はペレットとして知られている相互接続された菌糸の複雑な構造の形成によって特徴付けられる。これらの多細胞構造は、サイズが4に関して非常に不均一であり、そのような大腸菌や枯草菌などの単細胞の細菌よりも以上万回大きいサイズに到達することができます。異質性は、自然生物系5で有益な形質とみなされているが、業界では生産の落とし穴と考えられている。バイオ原子炉の栽培は可能な限り高い収率を得る再現可能かつ制御可能でなければならない。バイオリアクター中のペレットタイプのそれぞれの役割についての詳細な理解は、細胞工場としてストレプトミセスを向上させることが非常に重要です。 フローサイトメトリーは、一般集団6に個々の細胞を分析するために使用される。フローサイトメーターは、同時に（例えば、大きさ、密度、および多色蛍光のような）細胞の特徴を測定することによって、マルチパラメータ情報を取得することができる。このようにして、電池特性ことにより培養し、細胞内で異質6の別個の集団の存在についての我々の理解に寄与する相関させることができる。より専門的な楽器により、ユーザが定義したパラメータに応じて細胞を選別することを可能にした。例えば、変異体をスクリーニングすることができる。ソーティングの後、このような変異体細胞は、さらなる特徴付けのために培養することができる。これはすでに、とりわけ、有用であることが証明されている、株7,8の生産性を向上させる。フローサイトメーターのノズルは、一般的に約10μmの最大直径を持つ細胞を通過させる。従って、ストレプトミセスのペレットは、通常のフローサイトメーターで分析することができない。しかしながら、それらは複合オブジェクトパラメトリックアナライザーソーター（COPAS）で分析することができる。定期的なフローサイトメータと同様に、COPASは、ハイスループット様式での粒子のマルチパラメータデータを取得することができる。 COPASの種類に応じて10-1,500ミクロンサイズの粒子を分析することができる。また、例えば、DNA、RNA、またはタンパク質の単離などの栽培又は下流の分析に使用することができる個々の粒子の選別を可能にする。 COPASは当初、このような線虫線虫（Caenorhabditis elegans）9、およびショウジョウバエの胚および幼虫10の小さな多細胞生物の分析およびソートのために設計されました。器具はまた、ゼブラフィッシュ11aが使用されてきた糸状菌12,13のために購入する。後者の生物はまた、糸状菌によって形成されるものよりもさらに大きい菌糸ペレットを形成する。我々は最近、COPASの使用は、ストレプト4についても可能であることを実証した。ここでは、サイズに応じて、ペレットをソートする方法論上の詳細を含め、 ストレプトマイセス·ペレットの不均一性を評価するためにCOPASを使用するための実験手順について説明します。この方法はまた、他のペレットを形成するストレプトミセスの分析のために使用され得ることは、注意してください。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

ストレプトミセス、酵素および抗生物質の産生のために産業界で使用されている糸状土壌細菌である。バイオリアクター中で増殖させた場合、これらの生物は、サイズが不均一であるペレットとして知られている相互接続された菌糸のネットワークを形成する。ここでは、複合オブジェクトパラメトリック·アナライザおよびソーター（COPAS）を使用して菌糸体ペレットを分析し、ソートする方法を説明します。詳細な手順は、機器の使用やデータの基本統計分析のために与えられている。我々はさらに、ペレットは、このようなRNAまたはタンパク質含有量の分析として、下流の処理を可能にする、ユーザー定義の設定に応じて並べ替えることができます方法について説明します。異質な成長の基礎となるメカニズムが取り組むことができるこの方法を使用して。これは、生産性ペレットサイズと相関することを考慮し、セルファクトリーとしてストレプトミセスを改善するための器械であろう。

ストレプトマイセス·ペレットのCOPAS測定 放線菌は、幅広いサイズを有する液体培養における菌糸体ペレットを形成する。ペレットサイズ分布を分析するために、2日齢の液体増殖させ、ストレプトミセス·コエリカラー培養物を、1mmのノズルを備えたCOPASプラスプロファイラを使用してフローサイトメトリー大きな粒子流に供した。典型的なCOPAS出力は、図2Aに可視化されるように、このような散布図である。 x軸は飛行時間型（TOF）、ペレットサイズ（ すなわち 、それは、レーザビームを通過させるように、より大きなペレット時間がかかり）と相関を表す。 y軸は、被写体の光学濃度を表す吸光度を示す。散布図の各点は、レーザービームを通過させる単一のペレットすなわち 、個々のイベントに対応しています。重要なことに、（レーザ100を超えるイベント/秒を検出したとき、すなわち ）サンプルが濃すぎる場合には、COPASは、しばしば個々のpの検出に失敗するellets。これは、高すぎる偽TOF値をもたらす。試料を希釈することは、さらに希釈がもはやインパクトTOFもしないところまで、平均TOF値が減少します。約100ペレット/秒を分析した際に、この点に到達する。 ヒストグラムにデータ点をプロットすると、サイズは通常、（ 図2B）は、分散されていないことを示しています。分布は右に歪んでいるように見える。ログは、データ·セットを変換することも、正規分布（ 図2C）には至らなかった。サイズ分布が2つの正規分布データの混合を仮定することによって説明することができるかどうかを評価することは、数学的にモデル化された12,15。モデリングは、実際のサイズ分布は、ペレットの二つの異なる集団が存在することを仮定することによって説明することができることを示した。小さなペレットの人口は、248ミクロンの平均サイズを持つすべてのペレットの92％で構成されながら、大規模なPELの人口（2集団が参加分率が2.5から97.5パーセントの間にあるときに存在すると想定されていることに注意）（すべてのペレットの8％）は319ミクロンの平均サイズを有しています。 サイズに応じて、ストレプトマイセス·ペレットの仕分け 大小のペレットの集団からのマイクロコロニーを選別した。この目的のために、2つの集団の平均ペレットサイズをソートするための境界を定義するために使用した。 319ミクロンよりも大きいペレットが大きいペレット集団（ 図3）からのものであると考えられていたのに対し、2サイズの重なり部分からペレット選別制限するように、248ミクロンよりも小さいペレットを、小さなペレット集団からであると考えられたディストリビューション。ソートされたペレットの顕微鏡分析は、その明確な大きさ（ 図3）を示した。収集されたペレットは、さらなるDNA、RNA、またはタンパク質の単離のために使用することができる。 &lt;IMGのALT = &quot;図1&quot; FO：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt;：コンテンツの幅FO = &quot;5インチ&quot; 図1。COPASを使用して、ストレプトミセス·ペレットを測定し、分析するための実験装置の模式図。詳細については、実験手順を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> 図2。液体成長ストレプトミセス培養におけるペレットサイズの不均一性。2日目のSのCOPAS分析コエリカラー YEME培地（A）は、（飛行時間の値として示される）、ペレットサイズが正常に配布されていないことを示しD（B）と、いずれも対数変換時に（C）そうなる。その代わりに、2のTOFで異なるペレットの集団（したがってサイズ）を検出した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> 図3。 （ピンク色で表示）248ミクロンより小さいサイズを有する大きさに応じて、ストレプトマイセスペレットの分画。ペレット（青色で表示）319μmと大きいペレットであると考えられたよりも大きなサイズを有するペレットのに対し、小さなペレットであると考えられた。顕微鏡分析は、大きさの違いを確認した。これらのサイズは、TOFとDの間のような関係を使用してログ変換されたデータから計算されたことに注意してください0.57×TOF + 159ミクロンに等しいストレプトマイセス·ペレットのiameter。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a>

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Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

液体培養物を成長させたストレプトマイセスの小型不均質である菌糸体ペレットを特徴とする。ここでは、ハイスループット様式で、このようなペレットを分析し、分類する方法を記載する。これらのペレットは、成長の不均一性を理解し、制御するためのリードを提供し、更なる分析のために使用することができる。

の仕分け<em&gt;ストレプトミセス</em複合オブジェクトパラメトリック·アナライザおよびソーターの使用&gt;細胞ペレット

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K ビュー.  Leiden University. 液体培養物を成長させたストレプトマイセスの小型不均質である菌糸体ペレットを特徴とする。ここでは、ハイスループット様式で、このようなペレットを分析し、分類する方法を記載する。これらのペレットは、成長の不均一性を理解し、制御するためのリードを提供し、更なる分析のために使用することができる。 

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A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

マイクロ流体Perifusionデバイス内のマルチパラメトリック膵島Perifusionシステム

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

生物学

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的RNAを単離(英語)

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...