2日齢の液体増殖させた培養物からのペレットを分析し、ソートストレプトマイセスするための手順を模式的に図1に示されている。方法の詳細は以下の通りである。 1。 （メディアとバッファの作成を含む）の成長<ol><li> （; pH7.4に調整し、蒸留水1Lに80グラムのNaCl、2mMのKCl、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2.4グラムのKH 2 PO 4 PBS）10×リン酸緩衝生理食塩水を1リットル調製する。使用時にPBSを1 Lを得るために、蒸留水900ミリリットルに10倍のPBS 100ミリリットルを追加。 </li><li> YEME培地1L（3グラムDifco酵母エキス、5グラムバクトペプトン、3グラムオキソイド麦芽エキス、10グラムのブドウ糖、340グラムのスクロース、1Lの蒸留水まで）および2.5MのMgCl 2を 100ミリリットルを用意します。オートクレーブで両方のソリューションを殺菌。また、他のストレプトミセスメディアは4,14を使用することができることに注意してください。 </li><li>に100ミリリットルYEME培地および0.2ミリリットルの2.5MのMgCl 2を追加します。無菌250ミリリットルの三角フラスコは、金属コイルばねを装備。勉強する細菌サンプルと同じ数のフラスコを準備します。 </li><li> 10 6胞子/ mlの胞子濃度を得るために、 ストレプトマイセス 10 8胞子を各フラスコに接種する。 180rpmで振盪しながら30℃で2日間細菌を成長させる。 </li></ol> 2。サンプリング<ol><li>無菌5ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルファルコンチューブに各培養物から5ミリリットルのサンプルを転送します。サンプル全体の文化を代表することを確実にするためにサンプルを採取しながら、ゆっくりと文化を振る。 </li><li>サンプルはCOPASで直ちに分析されたら、[いいえサンプル調製手順は必要ありません。氷の上にサンプルを保持し、このプロトコルの3.1に進みます。サンプルは、後の時点で分析すると、このプロトコルの工程2.3-2.5に記載されるようにペレットを修正する。適切analys後に洗浄しない場合にも、固定管系における細菌の増殖を阻止することに注意してくださいES。ホルムアルデヒドとの固定は、下流分析を妨げていないことを確認してください。例えば、RNAをホルムアルデヒドで固定した後、真菌のペレットから分離することができませんでした。対照的に、RNAが正常の70％エタノールで固定した12後に単離した。 </li><li>試料5mlに37％ホルムアルデヒド600μLを加え、チューブ3回転倒混和。 30分間氷上でサンプルを修正します。 </li><li>遠心分離機10分間4℃で固定ローターで2500×gでのサンプル。慎重に上清を除去し、PBS 5mlでペレットを洗う。 </li><li>ペレットをPBS 2Xで洗浄されるように、ステップ2.4​​を繰り返します。試料は、数週間、4℃でPBS中に保存することができる。 </li></ol> 3。 COPAS分析<ol><li> COPASプラス、ポンプ、コンピュータおよび488nmのアルゴンレーザーがオンになってBiosortソフトウェアを起動していることを確認します。オンが、レーザーは、まだスタンバイモデュスになります。 </li><li>シース液ボトルがいっぱいでないか確認してください廃液ボトルが空になっています。 </li><li>上にスタンバイから488 nmのアルゴンレーザーを切り替えて「開始」を押した後に「RUN」をクリックします。レーザーがオンのときにしてから約60秒で、[完了]をクリックします。 </li><li>圧力計を確認してください。 「シース」のための圧力は、「サンプル」、「ソーター」と「​​クリーン」は、それぞれの周りに4.0、0.5、2.7、および10.9をお読みください。 </li><li>次の「圧力OK」のチェックボックスをクリックします。次に、システムは、フローセルをプライミングし、使用する準備ができている。 </li><li>標準設定は11で、「遅延」と「幅」7と想定されます。しきい値は、飛行時間を表すTOFで、「TOF最小 &#39;の&#39;信号 &#39;の50と40に設定されている。 （完全を期すために：すべての &#39;利益&#39;が1に設定され、トリガが2.50 MHzのが選択されている「スキャンレートを選択して「下のEXT（絶滅）にし、「構成」タブで設定されている一致が「強化」に設定されています）。 </li><li>サンプルカップのANから残った水を除去D（50ミリリットル程度）のPBSと一緒にカップにステップ2.2または2.5からのストレプトマイセス·サンプルの0.1ミリリットルを追加。サンプルカップが適切に閉じられていることを確認します。 </li><li>データの収集を開始するには、[取得]をクリックします。毎秒30〜50のイベントの間で取得するために流速を管理します。流量が高すぎる場合、試料カップにPBSを追加する。流速が低すぎる場合、より多くのサンプルを追加する。 </li><li>少なくとも2500のイベントは、クリック &#39;stop&#39;を収集しているとき。すべてのデータを保存するには、「ストア」をクリックして、その後の統計分析のためのあなたのファイルを保存します。 Biosortソフトウェアは、。txtファイルは、その後の分析に使用される、そのうちの4つのファイル内のデータを保存します。 </li><li> 50ミリリットルの注射器と水2Xで洗浄してサンプルを除去することにより、試料カップを清掃してください。 </li><li>すべてのサンプルが分析されるまで繰り返して3.7から3.10を繰り返します。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li> txtファイルを開いて、（例えば、MS Excel用を使用して）25よりも低く、EXTを使用してデータを破棄します。この4,12（ アスペルギルスニガーのために150よりも低く、EXTとすべてのデータが破棄される）破片とゆるい菌糸断片に対応しています。その後、平野&#39;。TXT」ファイルに1列のすべてのTOFを保存（：多くのデータのためには、これはから入手できるプログラミング言語R、自動化することができるファイル<a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ）。 </li><li>あるSciLab（http://www.scilab.org/からバージョン5.3.2以降）が、一緒に説明書と、提供されています &#39;fittools」ライブラリと共にインストールさからのものであることを確認してください。 http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual％20fittools.pdf </li><li>あるSciLabを起動し、データをモデル化するためにfittoolsライブラリの必要な機能を実行します。要するに：（一度だけ必要とされる）取扱説明書に示されているようfittoolsライブラリをインストールします。 <ol><li> fittoolsライブラリをロードします。 </li><li>あるSciLabにデータ（ &#39;。TXT」ファイル）をお読みください。 </li><li>（自然対数は、デフォルトのログ機能である）データを変換ログインします。 </li><li>データへの2集団のモデルに適合。 </li><li>ヒストグラムとモデル（オプション）とのグラフをプロットします。 </li><li>データ（千回の反復）のブートストラップ。 </li><li>ブートストラップデータセットにモデルを当てはめる。 </li><li> 5パラメータの推定値の間隔の信頼を得る。これは集団の参加率（P）については、その2手段（μ1、μ2）および添付の標準偏差（α1とα2）を提供します。さらに、95％信頼区間（千回の反復）12,13,15をブートストラップした後にモデルと再装着によって決定されます。平均の信頼区間が重複しないとpの信頼区間は0.025から0.975の間にある場合、データセットは正規分布の二つの集団の組み合わせとして説明することができる。 （TH注大型ペレットの参加は1であるのに対し、小さなペレットの参加割合で、Pである- P）TOFおよびストレプトマイセス·ペレットの直径との関係は、0.57×TOF + 159ミクロン4に等しい。 </li></ol></li><li>場合、2つの集団は、平均のTOFはその後、大小のペレットを並べ替えるには上限と下限としてCOPASのパラメータを並べ替えるなどの用途が見出されている。また、他の仕分けパラメーターは、ユーザーの要求に応じて選択することができることに留意されたい。 </li></ol> 5。ペレット選別<ol><li>ステップ3.7で説明したようにソートする必要があるストレプトミセス·サンプルをロードします。 </li><li> 「制限のソート」に設定し、最小限の（LO）および最大（HI）のTOF値についての詳細を提供します。別の方法として、「地域」を押した後に所望の寸法や特性を持つペレットを選択するために「ゲート領域を規定する」を選択することで、領域を設定。 </li><li> 50 mlチューブをソートパラメータを満たす複数のペレットを収集します。あるいは、マイクロタイタープレートは、個々のペレットをソートするために使用することができる。複数のペレット（10 4〜10 5）を、DNAおよびタンパク質抽出のために必要とされる。単一のペレットは、遺伝子発現のqPCR分析のために十分であるが、複数のペレットをRNA配列決定のために必要とされる。 </li><li>ソートされ、選択したパラメータのためにソートする並べ替え手動」をクリックする必要のあるペレットの数を決定し、設定します。ペレットの設定量に達すると、自動的にソートが終了する。 </li><li>サンプルカップから50ミリリットルのシリンジでサンプル上左を取り外し、水2Xでカップを洗う。他のサンプルをソートする必要がある場合は、繰り返して5.1から5.5を繰り返します。 </li><li> COPASをシャットダウンする前に、残りのペレットを除去し、70％EtOHでサンプルカップおよび/または水中の2％の次亜塩素酸をきれいに水でサンプルカップをすすいでください。システム全体をきれいにし、水でこれを繰り返すように塩素水のサンプルを実行します。空トン彼は、コンテナとクリーンをオーバーフローするか、このコンテナ内に存在するフィルターを交換してください。 </li><li>終了したら、システムからの圧力を解放するために「停止」をクリックします。モータが停止してプログラムを閉じて、「パージせずにシャットダウン」をクリックする。その後、コンピュータ、COPAS、レーザー、ポンプのスイッチを切る。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

クローン集団6に異質の我々の理解に貢献した、単一の多数の細胞を高速に分析を可能にしたフローサイトメトリー。定期的なフローサイトメトリーは、放線菌や真菌の菌糸体多細胞ペレットの分析のための現実的ではありません。我々の研究は、 ストレプトマイセス·ペレットの高スループット分析がCOPASを用いて実現可能であることを実証した。ここで説明する手順は簡単、迅速、かつ再現性が高い。機器の操作中に心に留めておくべき重要なパラメータは、100イベント/秒（本プロトコールのステップ3.8）を超えないようにしてください流速、である。ペレット濃度、および従って、流速が高くなりすぎた場合、器具は、個々のペレットの検出に失敗したため、TOF値が正しく計算される。十分にPBSを添加することによって試料を希釈することで、この問題を克服する。 制限事項 COPASプラス使用<html>ここでdは30-700ミクロンの範囲のサイズを有する粒子を測定するのに適した1mmのノズル径を有する。このノズルは、したがって、放線菌によって形成されたペレットを測定することができます。糸状菌の場合には、マイクロコロニーはCOPASプラスの一般的な適用性を制限する、大きくてもよい。 COPAS XLサイズは1500ミクロンまでの粒子を測定することができますが、径の範囲内で、その感度はCOPASプラスに比べて少ない。 COPAS PlusとCOPAS XLの両方が30ミクロン未満の粒子を分析することはできません。これは、個々の微生物の胞子または細胞を分析することができないことを意味する。また、COPAS正確胞子および細胞または非常に小さいマイクロコロニーの小さな凝集を分析しないことがあります。このために、定期的なセルアナライザーを使用する必要があります。この制限は1-1,500ミクロンの範囲の粒子を分析することができ連合BiometricaのBiosorterによって克服される。購入賞は、しかし高い。 T &quot;&gt; トラブルシューティング COPASは操作が簡単で信頼性の高い測定器です。しかし、時にはペレットをサンプルカップに試料を装填し、測定を開始した後に検出されない。原因は、典型的には、容易に「クリーン」コマンドを押すことによって解決することができる詰まり入口チューブである。これはサンプルカップに戻す配管システムからのペレットを強制します。代替の理由は、蓋が適切に試料カップ上に置かれていないことかもしれません。これにより、圧力損失を検出するためのペレット付随失敗につながる。 意義と今後の方向性 ここでは、ペレットの大きさの分析に焦点を当てたが、COPASセットアップも分析することができ、並べ替えの蛍光と密度に基づいています。蛍光検出は、GFPなどのレポーターに基づく遺伝子発現を解析することを可能にします。さらに、細胞の組成物を評価することができる。さらに強力なこれらのパラメーターに応じてペレットを分離するオプションがあるTERS。ソートされたペレットは、全オミクス研究を含む下流の分析のために使用することができる。確かに、我々は以前60,000大型20万の小さなペレットをソートされ、プロテオームは、大小のペレット4の間に有意差があったことを明らかにした。この技術は、したがって、細胞工場としてストレプトミセスを向上させるために新たなリードを提供します。 COPAS技術の主な利点は、時間です。細胞ペレット上の以前の研究は、顕微鏡を用いて行われ、これは数百16まで分析することができるペレットの数を制限した。顕微鏡研究は、すでに液体成長ストレプトミセス培養 16内のペレットの2集団が存在することを示唆した。実際に、ペレットの二つの集団は、異なるストレプト4多数のかかわらず、培養条件の検出された。このサイズの不均一性は糸状放線菌に限定されるものではなく、糸状菌12で観察された&lt;/ SUP&gt;。全ての場合において、不均一性の根本的なメカニズムはまだ知られていない。ペレットをソートする可能性は大きさや蛍光によるこのようなメカニズムを解明することを可能にします。

放線菌は、糸状土壌ウェル抗生物質を作るためにそれらの技能のために知られている細菌、ならびに免疫抑制剤として使用され得るか、または真菌感染または癌と闘うために、1,2の化合物である。加えて、これらの生物は、工業的用途3広範囲の関心のある酵素を産生する。これらの商業的に興味深い化合物のほとんどは、バイオリアクター中で産生される。バイオリアクターにおける放線菌の成長は、塊又はペレットとして知られている相互接続された菌糸の複雑な構造の形成によって特徴付けられる。これらの多細胞構造は、サイズが4に関して非常に不均一であり、そのような大腸菌や枯草菌などの単細胞の細菌よりも以上万回大きいサイズに到達することができます。異質性は、自然生物系5で有益な形質とみなされているが、業界では生産の落とし穴と考えられている。バイオ原子炉の栽培は可能な限り高い収率を得る再現可能かつ制御可能でなければならない。バイオリアクター中のペレットタイプのそれぞれの役割についての詳細な理解は、細胞工場としてストレプトミセスを向上させることが非常に重要です。 フローサイトメトリーは、一般集団6に個々の細胞を分析するために使用される。フローサイトメーターは、同時に（例えば、大きさ、密度、および多色蛍光のような）細胞の特徴を測定することによって、マルチパラメータ情報を取得することができる。このようにして、電池特性ことにより培養し、細胞内で異質6の別個の集団の存在についての我々の理解に寄与する相関させることができる。より専門的な楽器により、ユーザが定義したパラメータに応じて細胞を選別することを可能にした。例えば、変異体をスクリーニングすることができる。ソーティングの後、このような変異体細胞は、さらなる特徴付けのために培養することができる。これはすでに、とりわけ、有用であることが証明されている、株7,8の生産性を向上させる。フローサイトメーターのノズルは、一般的に約10μmの最大直径を持つ細胞を通過させる。従って、ストレプトミセスのペレットは、通常のフローサイトメーターで分析することができない。しかしながら、それらは複合オブジェクトパラメトリックアナライザーソーター（COPAS）で分析することができる。定期的なフローサイトメータと同様に、COPASは、ハイスループット様式での粒子のマルチパラメータデータを取得することができる。 COPASの種類に応じて10-1,500ミクロンサイズの粒子を分析することができる。また、例えば、DNA、RNA、またはタンパク質の単離などの栽培又は下流の分析に使用することができる個々の粒子の選別を可能にする。 COPASは当初、このような線虫線虫（Caenorhabditis elegans）9、およびショウジョウバエの胚および幼虫10の小さな多細胞生物の分析およびソートのために設計されました。器具はまた、ゼブラフィッシュ11aが使用されてきた糸状菌12,13のために購入する。後者の生物はまた、糸状菌によって形成されるものよりもさらに大きい菌糸ペレットを形成する。我々は最近、COPASの使用は、ストレプト4についても可能であることを実証した。ここでは、サイズに応じて、ペレットをソートする方法論上の詳細を含め、 ストレプトマイセス·ペレットの不均一性を評価するためにCOPASを使用するための実験手順について説明します。この方法はまた、他のペレットを形成するストレプトミセスの分析のために使用され得ることは、注意してください。

<table><tbody><tr><td>COPAS Plus</td><td>Union Biometrica</td><td>PLUS</td><td>Large particle flow cytometer including lasers and software</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>PBS component</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>PBS component</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td>PBS component</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td>PBS component</td></tr><tr><td>Difco Yeast Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>210933</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Oxoid Malt Extract</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXLP0039B</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Media component</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td>Media components. Add after autoclaving.</td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Fixation of pellets</td></tr><tr><td>Sodium Hypochlorite Solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71696</td><td>For cleaning of the instrument</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20816.367</td><td>For cleaning of the instrument</td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>214-1132</td><td>Culture flask for growing Streptomyces</td></tr><tr><td>Springs</td><td>Verenfabriek De Spiraal</td><td>Custom-Made</td><td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td></tr><tr><td>Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Syringes (50 ml)</td><td>Sigma</td><td>Z683698</td><td></td></tr></tbody></table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

ストレプトミセス、酵素および抗生物質の産生のために産業界で使用されている糸状土壌細菌である。バイオリアクター中で増殖させた場合、これらの生物は、サイズが不均一であるペレットとして知られている相互接続された菌糸のネットワークを形成する。ここでは、複合オブジェクトパラメトリック·アナライザおよびソーター（COPAS）を使用して菌糸体ペレットを分析し、ソートする方法を説明します。詳細な手順は、機器の使用やデータの基本統計分析のために与えられている。我々はさらに、ペレットは、このようなRNAまたはタンパク質含有量の分析として、下流の処理を可能にする、ユーザー定義の設定に応じて並べ替えることができます方法について説明します。異質な成長の基礎となるメカニズムが取り組むことができるこの方法を使用して。これは、生産性ペレットサイズと相関することを考慮し、セルファクトリーとしてストレプトミセスを改善するための器械であろう。

ストレプトマイセス·ペレットのCOPAS測定 放線菌は、幅広いサイズを有する液体培養における菌糸体ペレットを形成する。ペレットサイズ分布を分析するために、2日齢の液体増殖させ、ストレプトミセス·コエリカラー培養物を、1mmのノズルを備えたCOPASプラスプロファイラを使用してフローサイトメトリー大きな粒子流に供した。典型的なCOPAS出力は、図2Aに可視化されるように、このような散布図である。 x軸は飛行時間型（TOF）、ペレットサイズ（ すなわち 、それは、レーザビームを通過させるように、より大きなペレット時間がかかり）と相関を表す。 y軸は、被写体の光学濃度を表す吸光度を示す。散布図の各点は、レーザービームを通過させる単一のペレットすなわち 、個々のイベントに対応しています。重要なことに、（レーザ100を超えるイベント/秒を検出したとき、すなわち ）サンプルが濃すぎる場合には、COPASは、しばしば個々のpの検出に失敗するellets。これは、高すぎる偽TOF値をもたらす。試料を希釈することは、さらに希釈がもはやインパクトTOFもしないところまで、平均TOF値が減少します。約100ペレット/秒を分析した際に、この点に到達する。 ヒストグラムにデータ点をプロットすると、サイズは通常、（ 図2B）は、分散されていないことを示しています。分布は右に歪んでいるように見える。ログは、データ·セットを変換することも、正規分布（ 図2C）には至らなかった。サイズ分布が2つの正規分布データの混合を仮定することによって説明することができるかどうかを評価することは、数学的にモデル化された12,15。モデリングは、実際のサイズ分布は、ペレットの二つの異なる集団が存在することを仮定することによって説明することができることを示した。小さなペレットの人口は、248ミクロンの平均サイズを持つすべてのペレットの92％で構成されながら、大規模なPELの人口（2集団が参加分率が2.5から97.5パーセントの間にあるときに存在すると想定されていることに注意）（すべてのペレットの8％）は319ミクロンの平均サイズを有しています。 サイズに応じて、ストレプトマイセス·ペレットの仕分け 大小のペレットの集団からのマイクロコロニーを選別した。この目的のために、2つの集団の平均ペレットサイズをソートするための境界を定義するために使用した。 319ミクロンよりも大きいペレットが大きいペレット集団（ 図3）からのものであると考えられていたのに対し、2サイズの重なり部分からペレット選別制限するように、248ミクロンよりも小さいペレットを、小さなペレット集団からであると考えられたディストリビューション。ソートされたペレットの顕微鏡分析は、その明確な大きさ（ 図3）を示した。収集されたペレットは、さらなるDNA、RNA、またはタンパク質の単離のために使用することができる。 &lt;IMGのALT = &quot;図1&quot; FO：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt;：コンテンツの幅FO = &quot;5インチ&quot; 図1。COPASを使用して、ストレプトミセス·ペレットを測定し、分析するための実験装置の模式図。詳細については、実験手順を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> 図2。液体成長ストレプトミセス培養におけるペレットサイズの不均一性。2日目のSのCOPAS分析コエリカラー YEME培地（A）は、（飛行時間の値として示される）、ペレットサイズが正常に配布されていないことを示しD（B）と、いずれも対数変換時に（C）そうなる。その代わりに、2のTOFで異なるペレットの集団（したがってサイズ）を検出した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> 図3。 （ピンク色で表示）248ミクロンより小さいサイズを有する大きさに応じて、ストレプトマイセスペレットの分画。ペレット（青色で表示）319μmと大きいペレットであると考えられたよりも大きなサイズを有するペレットのに対し、小さなペレットであると考えられた。顕微鏡分析は、大きさの違いを確認した。これらのサイズは、TOFとDの間のような関係を使用してログ変換されたデータから計算されたことに注意してください0.57×TOF + 159ミクロンに等しいストレプトマイセス·ペレットのiameter。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a>

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Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

液体培養物を成長させたストレプトマイセスの小型不均質である菌糸体ペレットを特徴とする。ここでは、ハイスループット様式で、このようなペレットを分析し、分類する方法を記載する。これらのペレットは、成長の不均一性を理解し、制御するためのリードを提供し、更なる分析のために使用することができる。

の仕分け<em&gt;ストレプトミセス</em複合オブジェクトパラメトリック·アナライザおよびソーターの使用&gt;細胞ペレット

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K ビュー.  Leiden University. 液体培養物を成長させたストレプトマイセスの小型不均質である菌糸体ペレットを特徴とする。ここでは、ハイスループット様式で、このようなペレットを分析し、分類する方法を記載する。これらのペレットは、成長の不均一性を理解し、制御するためのリードを提供し、更なる分析のために使用することができる。 

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

免疫・感染学

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

発生生物学

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

生化学

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification of bacterial taxa that transform specific pools of DOC in nature poses a technical challenge. 
Here we describe an approach that couples bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, fluorescence activated cell sorting (FACS), and 16S rRNA gene-based molecular analysis that allows culture-independent identification of bacterioplankton capable of degrading a specific DOC compound in aquatic environments. Triplicate bacterioplankton microcosms are set up to receive both BrdU and a model DOC compound (DOC amendments), or only BrdU (no-addition control). BrdU substitutes the positions of thymidine in newly synthesized bacterial DNA and BrdU-labeled DNA can be readily immunodetected 1,2. Through a 24-hr incubation, bacterioplankton that are able to use the added DOC compound are expected to be selectively activated, and therefore have higher levels of BrdU incorporation (HI cells) than non-responsive cells in the DOC amendments and cells in no-addition controls (low BrdU incorporation cells, LI cells). After fluorescence immunodetection, HI cells are distinguished and physically separated from the LI cells by fluorescence activated cell sorting (FACS) 3. Sorted DOC-responsive cells (HI cells) are extracted for DNA and taxonomically identified through subsequent 16S rRNA gene-based analyses including PCR, clone library construction and sequencing.

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Environmental bacterioplankton are incubated with a model dissolved organic carbon (DOC) compound and a DNA labeling reagent, bromodeoxyuridine (BrdU). Afterward, DOC-degrading cells are separated from the bulk community based on their elevated BrdU incorporation using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then identified by subsequent molecular analyses.

ブロモデオキシウリジン（BrdU）標識と溶存有機の文化に依存しない識別に対する後続の蛍光活性化細胞選別カーボン分解Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

生物学

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. Barcode Enabled Sequencing of Tetrads (BEST)1 replaces the manual processes of isolating, disrupting and spacing tetrads. BEST isolates tetrads by virtue of a sporulation-specific GFP fusion protein that permits fluorescence-activated cell sorting of tetrads directly onto agar plates, where the ascus is enzymatically digested and the spores are disrupted and randomly arrayed by glass bead plating. The haploid colonies are then assigned sister spore relationships, i.e. information about which spores originated from the same tetrad, using molecular barcodes read during genotyping. By removing the bottleneck of manual dissection, hundreds or even thousands of tetrads can be isolated in minutes. Here we present a detailed description of the experimental procedures required to perform BEST in the yeast Saccharomyces cerevisiae, starting with a heterozygous diploid strain through the isolation of colonies derived from the haploid meiotic progeny.

Barcode Enabled Sequencing of Tetrads (BEST) replaces the manual processes of isolating, disrupting and spacing tetrads. BEST isolates tetrads by fluorescence-activated cell sorting onto agar plates, separates the spores by agitation with glass beads, and determines which randomly arrayed colonies were derived from the same original tetrad using molecular barcodes.

ベスト：四分子のバーコード有効シーケン

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

マウス細胞型における低インプット代謝研究

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule intermediates. However, obtaining accurate and reliable measurements of cellular metabolism, particularly in rare cell types like hematopoietic stem cells, has traditionally required pooling cells from multiple animals. A protocol now enables researchers to measure metabolites in rare cell types using only one mouse per sample while generating multiple replicates for more abundant cell types. This reduces the number of animals that are required for a given project. The protocol presented here involves several key differences over traditional metabolomics protocols, such as using 5 g/L NaCl as a sheath fluid, sorting directly into acetonitrile, and utilizing targeted quantification with rigorous use of internal standards, allowing for more accurate and comprehensive measurements of cellular metabolism. Despite the time required for the isolation of single cells, fluorescent staining, and sorting, the protocol can preserve differences among cell types and drug treatments to a large extent.

著者スポットライト:希少造血幹細胞のメタボロミクス解析の進歩 

Here, we present a protocol to accurately and reliably measure metabolites in rare cell types. Technical improvements, including a modified sheath fluid for cell sorting and the generation of relevant blank samples, enable a comprehensive quantification of metabolites with an input of only 5000 cells per sample.

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

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蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

ブロモデオキシウリジン（BrdU）標識と溶存有機の文化に依存しない識別に対する後続の蛍光活性化細胞選別カーボン分解Bacterioplankton

ベスト：四分子のバーコード有効シーケン

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

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