この手法により、大規模なワーム集団を収集し、最小限の操作で複数のオミクスプラットフォームに使用できます。この技術により、複数のオミクス実験で混合ステージC.elegans集団を収集し、各サンプルの全体的な画像を得ることができます。大規模な培養プレートにグラビッド大人のスポット漂白のために、ブンゼンバーナーの上にワームピックを炎上し、細菌の芝生の端から大規模な培養プレートに新鮮な大腸菌をすくうためにピックを使用しています。
スポット漂白のための4番目のチャンクプレートから単一のグラビッド大人を選び、大腸菌の芝生から離れた大規模な培養プレートの一角に作りたてのアルカリ次亜塩素酸溶液の5マイクロリットルを追加します。肉体の大人をアルカリ性次亜塩素酸溶液に入れ、線虫をタップしてキューティクルを破壊し、卵を放出します。合計5人の大人が同じように大腸菌の芝生の周りに均等に置かれている場合は、蓋をプレートに戻します。
大規模な培養プレートからサンプルを収穫するには、50ミリリットルのM9溶液を1つの大規模な培養プレート表面に注ぎ、プレートを旋回して、M9が線虫増殖培地アガロース表面全体を覆うことを確認します。M9と無菌血清ピペットをプライムし、M9とワームの集団がプレートの一角に集まるようにプレートを傾けます。プライミングされたピペットを使用してワーム懸濁液を吸引し、ワームを50ミリリットルの円錐チューブに追加します。
細菌の塊や破片を破壊するためにロッカーの上にチューブを置きます。すべてのワームが3つのプレートすべてから採取されたら、各チューブから15ミリリットルのワームを3つの15ミリリットルの円錐形チューブのそれぞれに移し、遠心分離によってチューブ内のワームを沈下します。慎重にワームペレットを乱すことなく上清を吸引し、各チューブにワーム懸濁液の13ミリリットルを追加します。
ペレットを再中断し、できるだけ多くの細菌や破片を洗い流し、再びワームを遠心分離するためにチューブを反転させます。各ワーム集団が収集されたら、洗浄ごとに新鮮なM9溶液の10ミリリットルでワームペレットを3回洗浄します。最後の洗浄後、洗浄した各ワームペレットを10ミリリットルの二重蒸留水で再び中断します。
母集団サイズ推定では、各チューブから100マイクロリットルのワームサンプルの3つの100マイクロリットルのアリコートをサンプル当たり900マイクロリットルのM9溶液で素早く希釈し、そのアリコートを使用して連続希釈を行います。ストックワームサンプルサスペンションをロッカーに置き、アリコートが数えられている間に培養物を連続的に動かし、均質になるまでワーム希釈液を混ぜます。最初の1~10個のワームサンプルから5マイクロリットルの溶液をガラス顕微鏡スライドに加え、光顕微鏡でワームを数えます。
サンプルに 50 個未満のワームがある場合は、1:100 と 1:1,000 の希釈液を数えます。50 を超えるワームがある場合は、次のシリアル希釈に移動します。各希釈の各アリコート複製を3回数えた後、希釈数を平均して、ワームの推定母集団サイズを決定する。
その後、ワームサンプルを適切な実験アリコートに分割し、フラッシュはマイナス80°Cの貯蔵のために液体窒素中のサンプルを凍結します。大粒子流サイトメトリー用のワームサンプルを調製するには、M9溶液の最終体積に約5倍の10〜第4混合段階ワームアリコートを希釈し、1ミリリットルの大腸菌あたり1ミリグラムの200マイクロリットルと0.5マイクロモル赤蛍光マイクロスフェア溶液の1:50希釈液をワームサスペンションに加える。ロッキングで室温で20分間インキュベーションした後、遠心分離によってワームと微小球を収集し、新鮮なM9溶液でワームを2回洗浄して、余分な細菌と非内部化された微小球を除去します。
2回目の洗浄後、ペレットをM9溶液5ミリリットルで再懸濁する。ペレットがきれいに見える場合は、ワームに50ミリモルモルナトリウムアジドを加えたM9の5ミリリットルを追加し、ロッカーにチューブを置いて正確なカウントとサイジングのためにワームをまっすぐにし、安楽死させる。人口分布のドキュメントでは、校正された384ウェルプレートテンプレートを開き、20個のゲートオブジェクトを4つのウェルに分配し、サンプルの20のバー領域ごとに各ゲート領域の4つの技術的複製を取得するようにテンプレートを設定します。
40ミリリットルのワームサンプルを大きな粒子フローサイトメーターに積み込み、サンプルを連続的に攪拌しながらサンプルの選別を自動的に開始し、サンプルからサンプルのオブジェクトを調整された384ウェルプレートに落ち着かせ、同時に分配するのを防ぎます。サンプル全体をソートし、ゲート領域の最大数を384ウェルプレートに分配したら、サイトメーターからサンプルを取り出し、器具を洗浄します。大規模な培養プレート法は、カエノハブディティス遺伝学センター変異体とカエノハブディティスエレガンス自然多様性資源野生株の混合物を含むC.Elegansの15株で試験した。
この分析では、大規模な培養プレート法により、人口規模は約94,500から9,290,000程度の値を得た。参照株PD1074および株全体における平均集団サイズは約240万ワームであった。C.elegans株間の推定人口サイズには、平均12.2の大規模な培養プレート成長日の間に有意な差は見つからなかった。
PD1074大規模培養プレートは、12.2日の平均成長時間で完全な混合段階の集団に成長するのに10〜14日かかりました。最も遅い成長株は最大20日間成長し、最も急速に成長している株は最低10日間成長した。PD1074のこのサンプル分布では、大粒子フローサイトメーター上でL1段階からグラビッド成体を通してワームを測定した。
その後のイメージングとサンプル間の母集団分布の変動の視覚化は、パイプラインがC.elegansの混合ステージ集団を生成することを明らかにした。サンプル コレクション全体でワームを正確にカウントして、成長と調査で比較可能なデータを取得することが重要です。この収集アプローチは、RNAシーケンシング、ゲノミクス、その他のオミクス分析に適用して、C.elegans集団内で起こる複雑なダイナミクスに対する理解を深めることができます。
この技術により、複数のオミクス実験で混合ステージC.elegans集団を収集し、各サンプルの全体的な画像を得ることができます。
