我々 は自分の仕事のすべての現在および元クンケル研究室メンバーに感謝と議論のプロトコルに関連して今回発表されたデータを再利用します。この作品は、国立衛生研究所 (NIH)、国立環境衛生研究所 (NIEHS) の学内研究部門から T.A.K. にプロジェクト Z01 ES065070 によって支えられました。

1. アルカリ加水分解と特異的南しみ (図 1)
<ol><li>細胞増殖とゲノム DNA の隔離<ol>
<li>酵母 DNA 精製キットの製造元の指示に従ってを使用して酵母ゲノム DNA を分離します。(0.5 の光学密度) と 1 の間の成長の指数の段階にあるカルチャを使用します。TE バッファー (10 mM トリス-HCl, pH 7.5、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)) x 1 の 35 mL で最終的な DNA ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>DNA に 5 mg/mL RNase A の 1 つの mL を追加し、37 ° C で 30 分間インキュベート</li>
		<li>3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) の 0.1 のボリュームを使用して DNA を沈殿させると氷の上に 20 分間 100% エタノールの 2.5 倍の量。</li>
		<li>16,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>70% のエタノールの 500 mL で 2 回ペレットを洗浄します。ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>ベンチにペレットを乾燥し、TE バッファー x 1 の 35 ml で再懸濁します。</li>
		<li>DsDNA BR アッセイ キットと蛍光 (資材表) を用いた DNA 量的に表わします。</li>
		<li>3 M 酢酸ナトリウム、pH 5.2 と 2.5 量 100% の 0.1 のボリュームを使用する各サンプルから DNA の 5 mg の沈殿物の合計量 200 mL EtOH (中性ゲル コントロールが必要な場合に追加、必要に応じて 5 mg の DNA が必要な場合は、H2O を追加)。20 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>16,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>ベンチにペレットを乾燥させます。H2o. 14 mL で DNA を再懸濁します</li>
	</ol></li>
	<li>アルカリ加水分解しゲル電気泳動<ol>
<li>1 M 島の 6 mL を追加し、55 ° C 2 時間インキュベートします。</li>
		<li>5 分間氷の上のサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>アルカリの DNA 読み込みバッファー x 6 の 4 つの mL を追加: 300 ミリメートル島、6 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、18 %polysucrose (資材表)、0.15% ブロム クレゾール グリーンと 0.25% キシレンシアノール FF。</li>
		<li>1% のアガロース、50 mM NaOH、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 で構成されるアルカリ ゲルをキャストします。1 レーンあたり読み込まれる DNA のサンプルの 24 mL は、櫛を使用します。</li>
		<li>X アルカリ電気泳動バッファー 1 で室温でゲルを実行: 50 mM NaOH、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。DNA サイズ マーカーが含まれます。</li>
		<li>チューブを簡単にスピンし、アルカリ agarose のゲルに全体 24 mL サンプルを読み込みます。30 V、10 V で 18-20 h に続いて、30 分 electrophorese します。</li>
		<li>穏やかな動揺の中和バッファー i: 1 M トリス-HCl、1.5 M の NaCl に室温で各 45 分の 2 の孵化のためのゲルを中和します。</li>
		<li>SYBR ゴールド汚れ穏やかな揺れで部屋の温度で 2 時間の 1/10,000 の希釈を含む水 200 mL で中和されたゲルを浸すことによって、DNA を染色します。</li>
		<li>UV transilluminator を用いた DNA を可視化します。アルカリ感度の向上は、DNA5で未修理リボヌクレオチドのより高い密度を示す小さい DNA のフラグメントの出現を引き起こします。</li>
	</ol></li>
	<li>南転送<ol>
<li>アルカリのゲルから DNA を転送すると、毛管作用10正荷電のナイロン膜。Sambrook とラッセルのマニュアル10この転送を設定する方法の例があります。</li>
		<li>アルカリの転送バッファーに室温で 15 分間アルカリ ゲルを浸す: 0.4 M NaOH、1 M 塩化ナトリウム。</li>
		<li>(ゲルのサイズへカット) ナイロン膜を水で簡単に濡れているし、アルカリ転送バッファーで 5 分間浸します。</li>
		<li>ガラスのグラタン皿に 3 のガラス ビーカー (100 mL) を反転による転送プラットフォームの設定します。この料理は agarose のゲルのサイズより少し大きめにする必要があります。それらの上にガラス板を設定します。</li>
		<li>ガラス板を 3 MM CHR 濾紙 (ゲルとバッファー貯蔵所にエッジの上に羽織ることができます長い方の辺の幅のサイズにカット) の 2 の大きい部分をかけなさい。</li>
		<li>アルカリの転送バッファーをクロマトグラフィー紙と半塗りガラス皿に注ぐ。5 mL ガラス ピペットを使用して泡を滑らか。</li>
		<li>上、再度泡を滑らかに agarose のゲルを配置します。パラフィルムでゲルのすべての端を囲みます。アルカリの転送バッファーのゲルの少量を注ぐ。</li>
		<li>漬けナイロン膜のゲルの上に配置します。泡を滑らか。</li>
		<li>ウェット 2 紙の部分は agarose のゲルのサイズにカットします。膜の上にそれらを配置し、任意の気泡を滑らかに。</li>
		<li>転送サンドイッチの上にペーパー タオル (agarose のゲルよりも少し大きいサイズにするカット) の大規模なスタックを配置します。ペーパー タオルの上にガラス板を慎重に配置します。トップ (質量 400 g うまくの本) に重み付きオブジェクトを追加します。</li>
		<li>室温で一晩進む転送ができます。</li>
		<li>慎重に転送スタックを離れて取り、中和バッファー II に室温で 15 分間膜を浸す: 0.5 M トリス-HCl、pH 7.2、1 M 塩化ナトリウム。</li>
		<li>クロスリンク UV 架橋剤を用いた荷電のナイロン膜への DNA。架橋剤の膜を置き、autocrosslink の設定を使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>南部のプローブの準備 注: ラギング鎖の DNA の繊維の対初期リードでアルカリに敏感なサイトのプロトコルに基づいていますを検出するここで説明している方法は11で公開以前。実験調査は III (図 3 a) 染色体のARS306の複製の起源に隣接する 2 つの方向 (または 1 つまたは OR2) のいずれかで挿入されているURA3のレポーターの遺伝子で実行されます。酵母ゲノム DNA にアルカリに敏感なサイトの存在は、リボヌクレオチド定款、DNA ポリメラーゼ活性12,13,14のバイオ マーカーとしてリボヌクレオチドの使用を許可するインジケーターです。ターゲットのレプリケーションでは、効率的なARS306の起源に隣接する DNA シーケンスを使用して、このアプローチは、他のゲノムの場所と同様に標的遺伝子を受けやすいはずです。<ol>
<li>次のプライマー対を用いたURA3レポーターの遺伝子の PCR 増幅 520 基ペア セグメント: URA3-F1 (5´ GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) と URA3 R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC)。</li>
		<li>テンプレートとして酵母ゲノム DNA の 10-20 ng、4 μ L 各のプライマー (10 μ M 在庫)、Taq バッファー Ex (Mg2 + plus)、dNTP の混合物 (2.5 mM) の 8 μ L、0.5 μ L の Ex Taq DNA ポリメラーゼの x 10 の 10 μ L の PCR 反応を実行 (5 U/μ L)、H2o. の 100 μ L に最終的な音量を調整して</li>
		<li>次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。1 分、1 分、2 分; 72 ° C 55 ° C の 95 ° C の 30 サイクル4 ° C で 10 分押しのための 72 ° C</li>
		<li>PCR 精製キットを使用して PCR の製品の浄化し、H2o. の 50 mL を使用して DNA を溶出これは今 radiolabeling 反応のテンプレートとして使えます。</li>
		<li>アンチセンス カイネティックスの次のプライマーを使用: 使用 URA3 A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) プローブ A. 焼鈍 DNA を可視化します。OR2 と鎖 DNA の遅れまたは 1 つのURA3は、tnascent、 URA3のとき、これは初期の主要な鎖 DNA に対応します。URA3 B (5´ CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) を使用して、プローブ B. 焼鈍新生 DNA を可視化します。URA3は、または 1 つの初期のラギング鎖の DNA URA3 OR2 の場合初期の主要な鎖 DNA に相当 (図 3)。<ol>
<li>テンプレート DNA、プライマー (10 μ M 在庫)、Taq バッファー (Mg2 + plus) Ex 10 x の 5 μ L、4 μ L (dCTP) マイナス 2.5 mM dNTPs の 2 μ L と 10-20 ng 増幅URA3フラグメントを用いた radiolabeling 反応を実行 -32P dCTP の 5 μ L (50 μCi)、0.5 μ L の ExTaq DNA ポリメラーゼ (5 U/μ L) H2O を実行次のカイネティックスのプログラムの 50 μ L に最終的な音量を調整して: 94 ° C、5 分。25 サイクル 94 ° c 1 分、55 ° C、30 秒、1 分; 72 ° C4 ° C で 5 分押しのための 72 ° C</li>
		</ol>
</li>
		<li>G-25 スピン列を使用して、非法人放射性ラベルを削除します。標識のサンプルを追加するには、前にピペッティングで 720 g、削除バッファー x で 1 分の列を遠心します。標識反応生成物と分類されたプローブを溶出する 720 x g で 2 分間遠心をロードします。</li>
		<li>95 ° c 直前のハイブリダイゼーション プローブを変性する 5 分間インキュベートします。簡単にクールな氷の上。</li>
	</ol></li>
	<li>南交配<ol>
<li>交配管に接液膜と 25 mL の作りたての交配バッファーを追加: 0.5 M リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2, 7% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、1% ウシ血清アルブミン (BSA)。ハイブリダイゼーション オーブンで回転で 1-2 時間の 65 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>慎重に、溶液を捨て、交配バッファー プラス放射性標識プローブの 25 mL を加えます。65 ° C 回転で 16-18 h で孵化させなさい。</li>
		<li>放射性廃棄物コンテナーに、溶液を注ぐ。隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション i: 40 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2、室温で 5 分の 5 の洗浄を行う 5 %sds、0.5 %bsa、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。</li>
		<li>隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション II と 65 ° C で 15 分の 2 洗浄を実行: 40 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2, 1 %sds、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。</li>
		<li>ピンセットを用いたハイブリダイゼーション チューブから膜を取り出し、開いているプラスチック製のスリーブ プロテクターに置きます。カバーし、イメージング プレートを公開します。異なる露出時間 4 h から 4 d に至るまでの数をみてください。</li>
		<li>必要に応じて、除去し、再約 3-4 倍異なるプローブを用いてしみをプローブします。ストリップ、65 ° c 50% ホルムアミド、2 x SSPE ソリューションの 25 mL で 2 h の膜をインキュベートします。 注: 20 x SSPE 原液: 3 M の NaCl、0.2 M NaH2PO4、0.02 M の EDTA、pH 7.4。</li>
		<li>放射性廃棄物コンテナーに、溶液を注ぐ。隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション II の 65 ° C で 15 分の 2 洗浄を実行します。</li>
		<li>ガイガー カウンターを持つ膜をチェックし、信号が残っている場合、ストリップのプロトコルを繰り返します。</li>
		<li>前述の通り前の雑種との交配を実行します。</li>
	</ol></li>
</ol>2 突然変異率と酵母菌の特異性の測定
<ol><li>細胞培養を準備します。<ol>
<li>(アデニンの補充のみ必要な場合は 250 mg/mL アデニンと補われる産スープの 5 mL に 100 mg/mL アデニンと補われた YPD 寒天上に成長した単一コロニー (健全な酵母細胞がサイズ適切なフォームに 30 ° C で 2-3 日植民地) を接種します。使用ずみはアデニン auxotroph) です。成長するシェーカー インキュベーターまたは 30 ° C で回転子の文化に達する飽和 (重度の成長障害なしひずみの 36-48 h) まで。</li>
		<li>〜 2000 x g で 5 分で細胞をスピンします。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、5 mL の滅菌水で洗浄を行う。</li>
		<li>500 mL の滅菌水に細胞を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞培養とめっきの希釈<ol>
<li>非選択のコントロールの 1,600,000 のプレート 100 mL 完了 (COM) プレート上に各文化の要因によって 96 ウェル プレートで細胞を希釈します。</li>
		<li>Ura3変異体の選択、100 mL 原液細胞野生型 (WT) ひずみの 5 フォア プレートのプレートします。興味のひずみの突然変異率は WT ひずみよりも高くなると予想される場合、セルをそれに応じて希釈します。</li>
		<li>Can1変異体の選択、セルを 5 倍希釈、WT ひずみのカナバニン含むプレート (缶) 100 mL をプレートします。希釈率は 0.5 です。</li>
		<li>イースト菌のコロニーが形成されるまでは、30 ° C でプレートを孵化させなさい。成長欠陥なし系統、2-3 日は COM は通常十分なプレートと 5 フォア プレートの 3-5 日をすることができます。異なる系統間変異率を比較すると、同じ日にコロニーをカウントする成長を選択することをお勧めします。冷蔵室 (~ 4 ° C) でカウントする準備ができてのプレートを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>自然突然変異率の計算<ol>
<li>各プレート上の目に見えるコロニーをカウントし、コロニー数のメモを取る</li>
		<li>ドレークの式を使用して突然変異率を計算: μ = f ÷ ln (μNt)。fは変異頻度の変異体の最終的な培養細胞の数で割った値の数によって計算されます。Nt は最終的な培養細胞の数であり、 μは突然変異率。この方程式は、ニュートン ・ ラプソン法などの反復的な方法で解決できます。突然変異率15を計算するリー ・ コールソンのテストを含むその他の推定方法あります。</li>
		<li>各分離株の utation 率の信頼区間と仮定すると対数正規分布を計算します。95% 信頼区間が最もよく使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>突然変異スペクトルの解析<ol>
<li>各 5 FOA から単一コロニーを拾うまたは板することができますと産板リフレッシュします。</li>
		<li>コロニー次のプライマーを用いて突然変異を検出するためにURA3またはCAN1の遺伝子そしてシーケンスを増幅する PCR を実行: URA3 F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') URA3 r (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') 両方の PCR の拡大のため、800 bp URA3遺伝子の塩基配列決定CAN1 F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') CAN1 r (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') の増幅特性と CAN1 AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3')、CAN1 9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3')、CAN1 10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') と CAN1 BR (5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') 1800 bp CAN1レポーターの遺伝子の順序のため。</li>
		<li>コロニー PCR を行うには、5 μ L H2O ので単一コロニーを再懸濁し、テンプレートとして 1 μ L を使用します。プライマー (5 μ M 株式) 5 x KAPA2G バッファー (Mg2 + plus) の 2 μ L のそれぞれの 1 μ L、dNTP (2.5 mM) の 0.5 μ L、0.5 μ L の KAPA2G 高速 DNA ポリメラーゼ、H2o. の 12 μ L を追加します。</li>
		<li>URA3遺伝子の増幅、次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。5 サイクル 95 ° C の 10 s、61 ° C、15 s、30 のための 72 ° C s;95 ° C の 10 のためのサイクル 35 秒、61 ° C、15 s 72 ° C、30 s;4 ° C で 2 分押しのための 72 ° CCAN1遺伝子の増幅、次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。5 サイクル 95 ° C の 10 秒、61 ° C、15 s、45 のための 72 ° C s;95 ° C の 10 のためのサイクル 35 秒、61 ° C、15 s、45 のための 72 ° C s;4 ° C で 2 分押しのための 72 ° C</li>
		<li>突然変異を識別するために DNASTAR Seqman プロや Sequencher などのプログラムを使用して参照シーケンスにシーケンス結果を合わせます。</li>
		<li>突然変異型 (図 4) または突然変異の場所 (図 5) での突然変異のデータをコンパイルします。(観測されたイベントの数は突然変異体シーケンスの数で割った値) 突然変異の頻度の特定の突然変異率を乗じた全体的な突然変異率を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+sugar%3A+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+H2-initiated+ribonucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair.</a> Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).</li>
<li>Li, Y., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja990592p">Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).</li>
<li>Williams, J. S., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+in+DNA%3A+origins%2C+repair+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences.</a> DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).</li>
<li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).</li>
<li>Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luria-Delbruck+fluctuation+experiments%3A+design+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis.</a> Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).</li>
<li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbruck+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Research%22%5BJournal%5D)">A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol.</a> Mutat Research. 781, 7-13 (2015).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+roles+of+DNA+polymerases+epsilon+and+delta+at+the+eukaryotic+replication+fork+are+evolutionarily+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved.</a> PLoS Genetics. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+are+signals+for+mismatch+repair+of+leading-strand+replication+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors.</a> Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).</li>
<li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+1-mediated+removal+of+ribonucleotides+from+nascent+leading-strand+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA.</a> Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).</li>
<li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+processing+of+ribonucleotides+in+DNA+by+topoisomerase+1+is+leading-strand+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).</li>
<li>Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha%2C+epsilon%2C+delta%2C+and+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+%7Balpha%7D+and+%7Bdelta%7D%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li>
<li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).</li>
<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここでは、2 組の DNA 複製と未修理リボヌクレオチドの変異原性の効果の中に組み込まれてリボヌクレオチドを半定量的に解析は、頻繁に実験のためのプロトコルについて述べる。ただし、これらのアプローチは、モデルが出芽酵母を真核生物を含む、他の微生物とさらに高い真核生物にこれらの技術を簡単に適合できます。
南しみが付くことと相まってアルカリ アガロース電気泳動による DNA の未修理リボヌクレオチドのプロービング リボヌクレオチドの現在の数と彼らに組み込まれたストランドに関する重要な情報を提供します。しかし、そのアルカリ感度は基本サイトなど、他の DNA の病変によっても発生に注意する重要です。リボヌクレオチドを DNA 検出の別の手段は、哺乳類細胞21で行われている精製の RNase H2 酵素治療で。我々 のアプローチはありますがラギング繊維URA3レポーターの遺伝子変異解析実験に用いたのと初期のリードでアルカリに敏感なサイトの調査、それは注文の他の場所でアニール プローブを設計することが可能他のゲノムのサイトでリボヌクレオチド密度に関する重要な情報を得よう。他汎用 DNA プローブ実験プロシージャの南しみの部分を参照として使用もできます。
変動試験を使用して突然変異率の測定微生物の様々 な変異イベントの分析に広く使用されています、従って DNA のリボヌクレオチドの変異原性の結果の分析に限定されていません。測定の精度を高めるためにはこの実験の独立した文化の数を増やす大幅。産媒体に関心のひずみをストリー キング、二倍体酵母の染色のテトラッド解剖によって得られた独立した胞子のコロニーの分析で、独立した植民地を取得できます。理想的には、複数の独立した半数体酵母の使用 (e.g。、テトラッド解剖から) ひずみに変動の影響を最小限に抑えることをお勧めします。自然突然変異率が高いとき、またはひずみ成長欠陥があるとき、これは特に重要です。自発性を測定するために用いることができる追加のメソッド突然変異率が突然変異の蓄積実験22 です。この分析における突然変異頻度は広範な成長後セルの決定され、突然変異率の計算に使用することができます。ディープ シーケンス技術による突然変異蓄積実験のカップリングは、遺伝子突然変異率と特異性を解析する強力なツールであること実証されています。

真核生物の核 DNA の複製時に、リボヌクレオチドはすべての 3 つの主要な DNA replicases、DNA ポリメラーゼ (政治家) α、ε、δ1、2ゲノムに組み込まれます。RNase H2 依存リボヌクレオチド切除修理 (RER3) は、これらの組み込みのリボヌクレオチドの大半を削除します。
糖の水酸基 2' 2' 3' 環状リン酸や 5'-オハイオ州4と他の 1 つの端を解放、隣接のリン酸ジエステル結合を攻撃できる DNA のリボヌクレオチドは、加水分解を受けやすい。アルカリ条件大幅にこの反応を加速することができます。したがって、基本的なソリューションで潜伏中に埋め込まれたリボヌクレオチドの加水分解アルカリ アガロース電気泳動5で目視できるゲノム DNA の断片化が発生します。この DNA を膜に転送およびアルカリに敏感なサイトに、新生リード- またはラギング鎖の DNA を組み込むリボヌクレオチドによって引き起こされるを識別できるように特異的プローブを用いたサザンブロット解析によって検出できます。それぞれ。
酵母細胞 H2 RNase 活性、トポイソメラーゼ (Top1) 私は埋め込みリボヌクレオチド6,7で DNA をニックスするときリボヌクレオチドの除去を開始できます。ただし、Top1 は、リボヌクレオチドの 3' 側に切断、これは 5'-オハイオ州と桿菌に難治性 2' 3' 環状リン酸の DNA 終了を生成します。修理、またはこれらの '汚れた部分' の異常処理に失敗はゲノム不安定性につながることができます。さらに、切開繰り返し DNA シーケンス内で発生すると、修復処理は欠失変異体につながります。タンデムリピートのため、これは特に問題となる、削除に短い (の 2 つおよび 5 つの塩基対の間) が一般的に RNase H2 欠損細胞で観察されます。酵母リボヌクレオチド体用新生リーディング鎖合成中に無差別 DNA ポリメラーゼ ε 変異 (pol2 M644G) の活動によって悪化させる RNase H2 の不在で Top1 依存への有害な影響。
自発の突然変異につながる DNA のリボヌクレオチドの処理と適切なレポーター遺伝子を使用し、付属の形質転換の選択でこの変異を検出できます。変動試験やルリアと Delbrück の実験は、選択可能なレポーター遺伝子8,9を使用して突然変異率を測定する最も一般的な方法の 1 つです。酵母、 URA3とCAN1遺伝子は、遺伝子の機能が失われるすべての突然変異型の検出を可能にする前進突然変異試験で記者として使えます。突然変異率はターゲットのレポーターの遺伝子の変異のないシングル コロニーから始まった複数並列文化の観察中央値として。RNase H2 欠損株rnh201Δ はタンデムで 2-5 bp 削除の発現率が上昇によって引き起こされる主穏やかに上昇の全体的な突然変異率などの酵母は、シーケンスを繰り返します。したがって、リボヌクレオチドのゲノムの変異原性の効果を完全に特徴づける、特定の突然変異率を決定する必要があります。この場合は、 URA3またはCAN1のレポーター遺伝子を増幅し、シーケンスの種類と、突然変異の場所を決定することができます、特定の突然変異率を算出することができます。複数の独立したURA3またはCAN1変異体の突然変異をコンパイルは、突然変異スペクトルを生成する使用できます。

<table><tbody><tr><td>YPD media</td><td></td><td></td><td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td></tr><tr><td>COM plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &amp;ndash; 35 ml per plate.</td></tr><tr><td>CAN plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &amp;deg;C and cool down to 56 &amp;deg;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td></tr><tr><td>5-FOA plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &amp;deg;C and cool down to 60 &amp;deg;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td></tr><tr><td>L-Canavanine sulfate</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mL glass culture tube</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Culture rotator in 30 &amp;deg;C incubator</td><td></td><td></td><td>Shaker incubator can be used instead</td></tr><tr><td>96 well round bottom plates</td><td></td><td></td><td>Sterile, any brand</td></tr><tr><td>3 mm glass beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>12-channel pipettes</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polymerase</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Newer model available</td></tr><tr><td>dsDNA BR Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSF10400</td><td></td></tr><tr><td>Bromocresol green</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>UV transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Chromotography paper</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 spin column</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (S9638);&lt;br/&gt; Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

核 DNA のリボヌクレオチドの存在は、ゲノム不安定性の源であると示されています。リボヌクレオチド定款のエクステントがアルカリ加水分解によって評価される、電気泳動のゲルの RNA は非常にアルカリ条件で加水分解しやすい。これは、南しみ分析との組み合わせで使用できます場所を決定し、リボヌクレオチドが組み込まれてに鎖。ただし、この手順は半定量的のみと感度は向上しますがアンチセンス サザンブロット プロービングにリボヌクレオチド コンテンツの小さな変化を検出する十分な区別できない場合があります。DNA のリボヌクレオチドの最も顕著な生物学的影響の 1 つとしては、前進突然変異試験を使用して自然発生突然変異を分析できます。適切なレポーター遺伝子を使用すると、選択した、全体的な機能の喪失の結果まれな突然変異ができるし、レポーターの遺伝子の DNA 塩基配列と変動実験からのデータを組み合わせることで特定の突然変異率を測定できます。変動アッセイは、さまざまな特定の遺伝的背景や成長条件で変異原性のプロセスを調べるに適用されます。

アルカリ アルカリ電気泳動続いて付いている genomic DNA の治療安定法人リボヌクレオチドの豊かさによる DNA 断片化の半定量的な検出が可能です。酵母ゲノム DNA 治療島5の有無のゲル画像を図 2に示します。Pol2、Polε の触媒サブユニットの M644L バリアントは、M644G 変異体を組み込んだ WT ポリメラーゼよりもより多くのリボヌクレオチド中リボヌクレオチドを組み込む能力を削減しています。プロトコルの詳細、アルカリのゲルは、アンチセンス サザンブロット法によりさらに検出できます。隣接する原点を基準にしてプローブのゲノムのサイトの場所の知識を持つ我々 は選択的に組み込まれて、新生リボヌクレオチドを調べることができるリードまたはラギング繊維。図 3は、発火初期複製の起源ARS30616の近くに 2 つの反対方向に挿入URA3レポーターの遺伝子を調査南しみ結果を示しています。リードするアンチセンス プローブを使用して、初期の主要な鎖 dna WT ひずみと系統の差別ポリメラーゼ α, δ, ε のバリエーションを表現するリボヌクレオチドでアルカリ胸の谷間による DNA フラグメント パターンを観察します。リボヌクレオチド設立。
変動実験を使用して、レポーター遺伝子を含む酵母の突然変異率を測定できます。図 4は、裏3 とCAN1 WT ポリメラーゼまたは機能の RNase H2 の有無pol2 M644G変異株の遺伝子突然変異率を示しています。RNase H2 の欠如は、全体的な突然変異率が両方の背景で適度な増加を引き起こします。ただし、変異特異性を綿密に検討は、系統の RNase H2 を欠けていることを明らかにする (図 5)、特にタンデム繰り返しシーケンス内の短い削除の突然変異率の強力な増加があります。WT および rnh201Δ系統の突然変異特異性を比較して図 5 aと図 5B Pol で初期の主要な DNA 鎖にさらに高架リボヌクレオチド定款の突然変異の効果が表示されます ε。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig1.jpg"> 図 1: 酵母ゲノム DNA にリボヌクレオチド添加によるアルカリに敏感なサイトの特異的検出の手順をプロトコルします。酵母ゲノムの DNA の隔離に始まり、最終南しみ分析を通して進むこの手順でさまざまな主な手順の概要です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig2.jpg"> 図 2: アルカリ agarose のゲルの電気泳動結果の代表的な画像を取得します。この図は、ニック McElhinny、s. A.らから適応されています5します。 異なる遺伝子型の系統から酵母ゲノム DNA KCl (ニュートラル) または水酸化カリウム (アルカリ性) を施した、中性またはアルカリ性の agarose のゲルの分離と。「重量」と"M644G"ポルのステータスを示す ε.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig3.jpg"> 図 3: アンチセンス サザンブロットによるアルカリ agarose のゲルのプロービングします。この図から適応されているウィリアムズ、司法書士ら13。 (A) URA3レポーターの遺伝子 (または 1 つと OR2) 2 つの反対の方向でARS306の近くに挿入されている内初期の主要な DNA の繊維に radiolabeled プローブ アニール。(B)南しみが付く初期主要な特異的プローブを用いた代表的な結果。表示されるpol3 L612M pol2 M644Gまたはpol1 L868MWT DNA ポリメラーゼにひずみの初期の主要な繊維のプロービングの結果バリアント系統 RNase H2 の有無。POL1、 POL2、およびPOL3遺伝子は、それぞれ政治家 α、ε、δ の触媒サブユニットをエンコードします。バリアントは、リボヌクレオチド定款5,12,17より無差別。(C) (B)から各レーンの合計の割合によって放射性の信号の定量化。値は、合計の割合として表されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig4.jpg"> 図 4: 酵母の自然突然変異率。この図は、ニック McElhinny、s. A.らから適応されています5. URA3とCAN1レポーター遺伝子が指定された系統の突然変異率を測定するため前進突然変異試験で使用されました。URA3 記者は、「オリエンテーション 2」(OR2、図 3 a).95% 信頼区間 (CI) は測定ごとに含まれています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig5.jpg"> 図 5: URA3 OR2 レポーターの遺伝子の突然変異スペクトル。この図は、前の出版物5,18,19,20から適応されています。前進突然変異試験で選択した各独立の 5 耐 FOA 植民地に観察位置と変異型は、804 で描かれている bp URA3コーディング シーケンス。文字を示すベース オープン三角形の置換を示す単一基本削除、閉じた三角形を示す単一の基本挿入、実線を示す短い削除。WT ・ rnh201Δ系統(A)突然変異スペクトル。シーケンスの上に赤いラベルは、シーケンスの下青ラベルは、 rnh201Δ株で観察しながら、WT で観察された突然変異です。Pol2 M644Gとpol2 M644G rnh201Δ系統(B)突然変異スペクトル。シーケンスの上に赤いラベルは、 pol2 M644G pol2 M644G rnh201Δ系統の順序の下に青の中で観察された突然変異です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis at Jo

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

リボヌクレオチドは真核生物の核 DNA 複製時にゲノムに組み込む最も豊富な非正規のヌクレオチドです。正しくない削除、DNA 損傷と突然変異誘発リボヌクレオチドが発生します。リボヌクレオチド混入 DNA とその変異原性効果の豊かさを評価するために使用される 2 つの実験的アプローチを紹介します。

勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K ビュー.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS. リボヌクレオチドは真核生物の核 DNA 複製時にゲノムに組み込む最も豊富な非正規のヌクレオチドです。正しくない削除、DNA 損傷と突然変異誘発リボヌクレオチドが発生します。リボヌクレオチド混入 DNA とその変異原性効果の豊かさを評価するために使用される 2 つの実験的アプローチを紹介します。

ビデオ: Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

生化学

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

遺伝学

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

生物学

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

rRNA 2'-O-メチル化のDNAzyme依存性分析

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

発生生物学

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this yeast model is relevant to many organisms, including humans, since DNA repair and DNA damage response factors are well conserved across diverse species. However, S. cerevisiae has not yet been used to fully address whether the rate of accumulating mutations changes with increasing replicative (mitotic) age due to technical constraints. For instance, measurements of yeast replicative lifespan through micromanipulation involve very small populations of cells, which prohibit detection of rare mutations. Genetic methods to enrich for mother cells in populations by inducing death of daughter cells have been developed, but population sizes are still limited by the frequency with which random mutations that compromise the selection systems occur. The current protocol takes advantage of magnetic sorting of surface-labeled yeast mother cells to obtain large enough populations of aging mother cells to quantify rare mutations through phenotypic selections. Mutation rates, measured through fluctuation tests, and mutation frequencies are first established for young cells and used to predict the frequency of mutations in mother cells of various replicative ages. Mutation frequencies are then determined for sorted mother cells, and the age of the mother cells is determined using flow cytometry by staining with a fluorescent reagent that detects bud scars formed on their cell surfaces during cell division. Comparison of predicted mutation frequencies based on the number of cell divisions to the frequencies experimentally observed for mother cells of a given replicative age can then identify whether there are age-related changes in the rate of accumulating mutations. Variations of this basic protocol provide the means to investigate the influence of alterations in specific gene functions or specific environmental conditions on mutation accumulation to address mechanisms underlying genome instability during replicative aging.

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Mutation rates in young Saccharomyces cerevisiae cells measured through fluctuation tests are used to predict mutation frequencies for mother cells of different replicative ages. Magnetic sorting and flow cytometry are then used to measure actual mutation frequencies and age of mother cells to identify any deviations from predicted mutation frequencies.

母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するために<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

同時マッピングとヒトのミトコンドリア DNA のリボヌクレオチドの定量

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出

要約

さらに動画を探す