DNAzyme依存性消化は、スノRNAの機能を研究するのに有用な方法である。部位特異的なRNAメチル化を分析する迅速かつ簡単な方法です。それは、任意の分子生物学の研究室に存在する短いDNAオリゴヌクレオチドと基本的な試薬を必要とします。
まず、目的のシーケンスの DNAzyme を設計します。適切なデータベースを使用して、RNA配列または推定メチル化部位を見つけます。S.cerevisiae snoRNA標的については、酵母スノRNAデータベースを使用してください。
関心のあるメチル化部位を見つけるには、例えば、snR13依存性部位を、snR13を選択し、修飾されたヌクレオチドの位置をメモする。サッカロマイセスゲノムデータベースなどの適切なデータベースを使用して、修飾されたヌクレオチドの上流および下流の配列を見つけます。ターゲット遺伝子名を検索します。
10~23個のDNAzymeアッセイを使用する場合は、メチル化部位の上流および下流に10〜15ヌクレオチドを選択します。8-17 DNAzymeを使用する場合は、20ヌクレオチドを選択してください。5素数および3素数の腕の相補的な配列を作成し、それらを使用して、3素数および5素数の端にDNAzyme触媒配列を隣接させます。
DNAを正常なDNAオリゴヌクレオチドとしてオーダーする。適切な培地や条件で目的の酵母株を成長させます。細胞が中指数相に達すると、摂氏4度で3分間1,000回gの遠心分離機でペレットし、培地を捨てます。
原稿の指示に従ってRNAの単離を進める。その後、RNAペレットをRNaseおよびDNaseフリー水の30マイクロリットルで再懸濁する。チューブを氷の上に置き、マイクロスペクトロフォトメーター上のRNA濃度を測定します。
10~23個のDNAzymeを用いてDNAzymeの消化を行うために、5マイクログラムのRNA、10~23個のDNAzymeの200個のピコモール、および10マイクロリットルの1-X10~23インキュベーションバッファーをインキュベーションミックスを調製します。その後、乾燥したヒートブロックにチューブを95°Cに設定して3分間インキュベートします。その直後に、チューブを氷の上に置き、5分間そこに置きます。
チューブを簡単に回転させ、氷の上に戻します。RNase阻害剤を20単位加え、10分間摂氏25度に設定された乾燥したヒートブロックにチューブを置きます。一方、4-X10~23反応バッファーの5マイクロリットルを、300モル塩化マグネシウムと1マイクロリットルの4マイクロリットルと組み合わせて反応混合物を調製する。
この反応ミックスを37°Cに設定した乾燥熱ブロックに予熱します。37°Cのドライヒートブロックにインキュベーションミックスを入れたチューブを置き、プリウォーム反応ミックスの10マイクロリットルを加えます。37°Cで1時間インキュベートし、チューブを氷の上に置きます。
8-17 DNAzymeを用いてDNAzymeの消化を行うために、6マイクロリットルの総体積で5マイクログラムのRNAを用いた1.5ミリリットルマイクロチューブを調製する。次に、8-17 DNAzymeの400ピコモールを用いて別のチューブを作製する。作業中は、両方のチューブを氷の上に置いてください。
両方のチューブを摂氏95度に設定した乾燥したヒートブロックに移し、2分間インキュベートします。RNAサンプルを氷の上に戻し、DNAzymeと一緒にチューブを5秒間回転させます。DNAzymeを摂氏25度で10分間インキュベートします。
DNAzymeがインキュベートしている間に、2-X 8-17反応バッファーの10ミルコリターを調製し、摂氏25度に予熱します。DNAzymeでチューブに温め込まれたバッファーを追加し、この反応ミックスの14マイクロリットルをRNAと共に、20単位のRNase阻害剤と共にチューブに移します。2時間摂氏25度で反応をインキュベートし、氷の上にチューブを置きます。
DNAzyme消化後にRNAを精製するには、350マイクロリットルの水と400マイクロリットルのクロロホルムを反応管に加えます。渦は30秒間、遠心分離機は20,000倍gで5分間。遠心分離後、上相を1ミリリットルエタノール、酢酸アンモニウム7.5モルの40マイクロリットル、グリコーゲン1マイクロリットルを含む新しいチューブに移します。
チューブを数回ひっくり返して、マイナス80°Cで2時間、または一晩マイナス20度で混ぜてインキュベートします。原稿の指示に従ってRNAの精製を進め、それから、10マイクロリットルRNaseおよびDNaseフリー水のRNAペレットを再中断する。精製後すぐにRNAチューブを氷の上に置きます。
RNA電気泳動を行うために、マイクロ波で混合物を加熱することによって127.5ミリリットルの二重蒸留水に1.5グラムのアガロースを溶解させることから始めます。次に、10X MOPSの15ミリリットルと37%ホルムアルデヒドの7.5ミリリットルをアガロース溶液に加えます。アガロース溶液に適量のゲル染色剤を加えます。
アガロースをトレイに注ぎ、45分間冷まします。消化および精製されたRNAの10マイクロリットルを5マイクロリットルのサンプル変性バッファーと0.5マイクロリットルの6-X負荷染料と組み合わせてRNAサンプルを調製します。サンプルを摂氏70度で5分間インキュベートし、氷の上で5分間インキュベートします。
調製したゲルを電気泳動タンクに入れ、タンクに1-X MOPSバッファーを充填します。サンプルの15マイクロリットル全体をゲルに積み込み、ブロモチモールブルーがゲル長の2/3に達するまで80ボルトでゲルを実行します。適切なイメージャーでゲルを分析します。
この技術の値は、誘導性スノRNA転写システム上で実証することができる。snR13またはsnR47遺伝子のいずれかの誘導可能なGAL1プロモーターを上流に挿入することで、25SリボソームRNAのスノRNA依存的メチル化の分析が可能になります。ガラクトース上で細胞が増殖すると、25SリボソームRNAはスノRNA誘導部位でメチル化され、DNAzyme処理後もそのまま残ります。
これに対して、ガラクトースの欠如のためにスノRNA発現が遮断されると、DNAzyme依存性切断が生じる。さらに、スノRNA発現はガラクトースに依存しないため、野生型コントロールではRNAの消化は認められていません。我々のrRNA修飾の分析におけるDNAzyme依存性切断の活性は、最近、スノRNA成熟の文脈で示されている。
DNAzyme依存性アッセイは、5素数およびプレスノRNA処理の欠如がサッカロマイセス・セレビシエのメチル化レベル25Sおよび18S rRNAに影響することを示すために使用された。このプロトコルは、有毒であるフェノールとクロロホルムを使用する必要があり、ヒュームフードの下で処理する必要があります。
