Agradecemos a todos os antigos e atuais membros Kunkel laboratório para os seus trabalhos e discussões relacionadas ao protocolo e reutilizados dados aqui apresentados. Este trabalho foi financiado pelo projeto Z01 ES065070 para T.A.K. da divisão de pesquisa Intramural dos institutos nacionais de saúde (NIH), National Institute de Ciências de saúde ambiental (NIEHS).

1. alcalina hidrólise e vertente específica de Southern Blot (Figura 1)
<ol><li>Crescimento da célula e isolamento de DNA genômico<ol>
<li>Isole o DNA genômico de levedura usando um kit de purificação de DNA seguindo as instruções do fabricante do fermento. Use as culturas que estão na fase exponencial de crescimento entre (uma densidade óptica de 0.5) e 1. Resuspenda o pellet de DNA final em 35 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) 1x.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de 5mg/mL RNase ao DNA e incube por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Precipitar o DNA utilizando 0,1 volumes de acetato de sódio 3M (pH 5.2) e 2,5 volumes de etanol 100% por 20 min no gelo.</li>
		<li>Centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Lave o pellet duas vezes com 500 mL de etanol a 70%. Remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Secar a pelota no banco e ressuspender em 35 ml de tampão TE 1x.</li>
		<li>Dose o DNA usando um fluorímetro (Tabela de materiais) com o kit de ensaio BR dsDNA.</li>
		<li>Precipitar a 5 mg de DNA de cada amostra utilizando 0,1 volumes de acetato de sódio 3M, volumes de pH 5.2 e 2.5 de 100% EtOH para um volume total de 200 mL (adicionar H2O, se necessário, adicional de 5 mg de DNA é necessário se o controle de gel neutro é necessário). Incube no gelo por 20 min.</li>
		<li>Centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Seque a pelota no banco. Resuspenda o DNA em 14 mL de H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Eletroforese de gel e hidrólise alcalina<ol>
<li>Adicione 6 mL de 1m KOH e incubar a 55 ° C por 2 h.</li>
		<li>Incube as amostras no gelo por 5 min.</li>
		<li>Adicionar 4 mL de 6x do amortecedor do carregamento de DNA alcalina: 300mm KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, polysucrose 18% (Tabela de materiais), 0,15% verde de bromocresol e 0,25% xileno cianol FF.</li>
		<li>Converter um gel alcalino que é composto de agarose a 1%, 50mm NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Use um pente que permite 24 mL de amostra de DNA para ser carregado por faixa.</li>
		<li>Funcione o gel à temperatura ambiente em tampão de eletroforese alcalina 1x: 50mm NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Incluem um marcador de tamanho apropriado do DNA.</li>
		<li>Spin para baixo os tubos brevemente e carregar o inteiro 24 mL de amostra para o gel de agarose alcalina. Electrophorese por 30 min em 30 V, seguido por 18-20 h em 10 V.</li>
		<li>Neutralize o gel para incubação 2 de 45 min à temperatura ambiente com agitação suave na neutralização Buffer i: 1 M Tris-HCl, 1,5 M de NaCl.</li>
		<li>Mancha o DNA embebendo o gel neutralizado em 200 mL de água contendo uma diluição de 1/10.000 da mancha SYBR Gold para 2 h à temperatura ambiente com agitação suave.</li>
		<li>Visualize o DNA usando um transiluminador UV. Alcaloide-sensibilidade aumentada provoca o aparecimento de pequenos fragmentos de DNA, indicando uma maior densidade de ribonucleotídeos não reparados no DNA5.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência do Sul<ol>
<li>Transferi o DNA do gel alcalino para a membrana de nylon positivamente carregado por ação capilar10. Um exemplo de como esta transferência pode ser configurada é fornecido no manual Sapeka e Russell está10.</li>
		<li>Mergulhe o gel alcalino para 15 min à temperatura ambiente em tampão alcalino transferência: 0,4 M de NaOH, 1 M de NaCl.</li>
		<li>Molhe a membrana de nylon (corte ao tamanho do gel) brevemente com água e em seguida, mergulhe por 5 min em tampão alcalino transferir.</li>
		<li>Configurar a plataforma de transferência invertendo-se 3 copos de vidro (100 mL) em um assadeira de vidro. Este prato deve ser ligeiramente maior que o tamanho do gel do agarose. Defina uma placa de vidro por cima deles.</li>
		<li>Drape 2 pedaços grandes de 3mm CHR cromatografia em papel (corte ao tamanho da largura do gel plus mais lados que podem armar sobre as bordas no reservatório tampão) sobre a placa de vidro.</li>
		<li>Despeje Alkaline Buffer de transferência sobre o papel para cromatografia e metade encher o prato de vidro. Suavizar as bolhas usando uma pipeta de vidro de 5 mL.</li>
		<li>Coloque o gel de agarose em cima, outra vez, suavizar as bolhas. Cerca todas as bordas do gel com parafilme. Despeje uma pequena quantidade de Buffer alcalino de transferir para o gel.</li>
		<li>Coloque a membrana de nylon previamente embebido em cima do gel. Suavizar as bolhas.</li>
		<li>Molhados 2 pedaços de papel cortado para o tamanho do gel do agarose. Coloque-os em cima da membrana e suavizar as bolhas.</li>
		<li>Coloque uma pilha de toalhas de papel (corte para um tamanho ligeiramente maior do que o gel de agarose) em cima do sanduíche de transferência. Cuidadosamente coloque uma placa de vidro em cima as toalhas de papel. Adicione um objeto ponderado para o topo (um livro com uma massa de 400 g funciona bem).</li>
		<li>Deixe a transferência prosseguir durante a noite em temperatura ambiente.</li>
		<li>Cuidadosamente, desmontar a pilha de transferência e mergulhe a membrana durante 15 minutos à temperatura de neutralização Buffer II: 0.5 M Tris-HCl, pH 7.2, 1 M de NaCl.</li>
		<li>Crosslink o DNA para a membrana de nylon carregado usando um agente reticulante UV. Coloque a membrana no cross-linker e usar a configuração de autocrosslink.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do Sul da sonda Nota: A abordagem descrita aqui para detectar sites sensíveis ao alcaloide no líder emergente-contra atraso-fio de uma cadeia de DNA é baseado em um protocolo previamente publicado11. Para a nossa experiência, a sondagem é realizada no gene repórter URA3 que tem sido inserido em uma das duas orientações (OR1 ou OR2) adjacentes à origem de replicação de ARS306 no cromossomo III (Figura 3A). A presença do alcaloide-sensíveis sites no DNA genômico de levedura é um indicador de incorporação ribonucleotídeo, permitindo o uso de ribonucleotídeos como os biomarcadores de DNA polimerase atividade12,13,14. Esta abordagem, usando uma sequência de DNA adjacente à eficiente ARS306 origem de replicação, de destino deve ser passível de outras localizações genômicas e genes-alvo também.<ol>
<li>PCR-amplificação de uma base de 520 segmento de par do gene repórter URA3 usando o seguinte par de primer: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) e URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Realizar a reação de PCR usando 10-20 ng de DNA genômico de levedura como um modelo, 4 μL de cada primer (estoque de 10 μM), 10 μL de 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL da mistura do dNTP (2,5 mM cada), 0,5 μL de Ex Taq DNA polimerase (5 U/μL) e ajustar o volume final de 100 μL com H2O.</li>
		<li>Execute o seguinte programa PCR: 95 ° C por 5 min; 30 ciclos de 95 ° C por 1 min, a 55 ° C por 1 min, 72 ° C por 2 min; 72 ° C por 10 min e espera a 4 ° C.</li>
		<li>Purificar o produto do PCR usando um kit de purificação de PCR e eluir o DNA com 50 mL de H2O. Isso agora pode ser usado como o modelo na reação de radiolabeling.</li>
		<li>Use os seguintes primers para vertente específica radioativos: uso URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) para a visualização de DNA que anneals a sonda A. Isso corresponde o nascente principal vertente DNA quando URA3 está em OR2 e o tnascent ficando strand DNA quando URA3 está em OR1. Usar URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) para a visualização de DNA nascente que anneals a sonda B. Isso corresponde o nascente principal vertente DNA quando URA3 estiver em OR1 e revestimento nascente strand DNA quando URA3 está em OR2 (Figura 3).<ol>
<li>Realizar a reação radiolabeling usando 10-20 ng amplificado URA3 fragmento como modelo de DNA, 2 μL da primeira demão (estoque de 10 μM), 5 μL de 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 4 μL de dNTPs 2,5 mM (menos dCTP), 5 μL (50 μCi) de um -32P-dCTP , 0,5 μL de ExTaq DNA polimerase (5 U/μL) e ajustar o volume final de 50 μL com H2O. executar o seguinte programa para radioativos: 94 ° C por 5 min; 25 ciclos de 94 ° C por 1 min, a 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min; 72 ° C por 5 min e espera a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use uma coluna de rotação G-25 para remover marcador radioativo sem personalidade jurídica. Antes de adicionar a amostra radiolabeled, centrifugar a coluna por 1 min em 720 x g e removero tampão pipetando. Carrega o produto da reação radiolabeled e centrifugar por 2 min a 720 x g para eluir a sondas marcadas.</li>
		<li>Incube a 95 ° C por 5 min desnaturar a sonda imediatamente antes da hibridização. Cool brevemente no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridação do Sul<ol>
<li>Roll a membrana imersos em um tubo de hibridização e adicionar 25 mL de tampão de hibridização preparado: tampão de fosfato de sódio 0,5 M, pH 7,2, 7% Dodecil sulfato de sódio (SDS), 1% albumina de soro bovino (BSA). Incube a 65 ° C, durante 1-2 h com a rotação em um forno de hibridização.</li>
		<li>Cuidadosamente, decantar a solução e adicionar 25 mL de tampão de hibridização mais a sonda marcadas com radioisótopos. Incube a 65 ° C para 16-18 h com a rotação.</li>
		<li>Decantar a solução em um recipiente de resíduos radioactivo. Realizar 5 lavagens de 5 min à temperatura ambiente com tampão de fosfato de sódio fosfato-SDS lavagem solução i: 40 mM, pH 7,2, pH de 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 8.0.</li>
		<li>Executar 2 lavagens de 15 min a 65 ° C, com solução de lavagem fosfato-SDS II: 40 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Remover a membrana no tubo de hibridização usando uma pinça e coloque em um protetor de manga de plástico aberto. Cobrir e expor a uma placa de imagem. Tente um número de diferente tempos que variam de 4 h a 4D de exposição.</li>
		<li>Se necessário, strip e re-sonda blot usando uma sonda diferente aproximadamente 3 - 4 vezes. Para tira, incube a membrana para h 2 a 65 ° C, em 25 mL de uma formamida 50%, solução de x SSPE 2. Nota: 20 x SSPE solução: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, EDTA 0,02 M, pH 7,4.</li>
		<li>Decantar a solução em um recipiente de resíduos radioactivo. Execute 2 lavagens de 15 min a 65 ° C em solução de lavagem fosfato-SDS II.</li>
		<li>Verifique se a membrana com um contador Geiger e repita o descascamento protocolo se sinal permanece.</li>
		<li>Realizar pré-hibridização e hibridação conforme descrito acima.</li>
	</ol></li>
</ol>2. medir a taxa de mutação e especificidade em cepas de S. cerevisiae
<ol><li>Preparar a cultura de células<ol>
<li>Inocular uma colônia única (colônias de 2-3 dias a 30 ° C, a forma adequada de porte do leva de células de levedura saudável) cultivada em ágar YPD suplementado com adenina de 100 mg/mL em 5 mL de caldo YPDA suplementado com adenina 250mg/mL (suplementação de adenina é necessário apenas se a tensão utilizada é um auxotroph de adenina). Cresce em uma incubadora shaker ou em rotacao a 30 ° C até que a cultura atinja a saturação (36-48 h para uma tensão sem um defeito grave de crescimento).</li>
		<li>Gire para baixo as células a ~ 2000 x g por 5 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e lavar as células com 5 mL de água estéril.</li>
		<li>Ressuspender as células em 500 mL de água estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluição da cultura de pilha e chapeamento<ol>
<li>Para controles de não selecção, dilua as células em uma placa de 96 poços por um fator de 1.600.000 e placa 100 mL de cada cultura em um prato (COM) completa.</li>
		<li>Para selecionar para ura3 mutantes, placa 100 mL de células não diluídas em uma placa de 5-FOA para uma estirpe do selvagem-tipo (WT). Dilua as células em conformidade, se a taxa de mutação da estirpe de interesse deverá ser maior do que em uma cepa WT.</li>
		<li>Para selecionar para mutantes can1 , diluir as células 5-fold e placa 100 mL em uma placa contendo canavanine (CAN) para uma tensão WT. O factor de diluição é 0,5.</li>
		<li>Incube as placas a 30 ° C até formar colônias de levedura. Para cepas sem um defeito de crescimento, 2-3 dias é geralmente suficientes para COM e placas e 3-5 dias para placas 5-FOA. Para comparar as taxas de mutação entre estirpes diferentes, é melhor escolher o mesmo dia de crescimento para a contagem das colónias. Armazene as placas prontas a serem contados no quarto frio (~ 4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cálculo da taxa de mutação espontânea<ol>
<li>Contagem das colónias visíveis em cada prato e tome nota dos números de colônia</li>
		<li>Calcular a taxa de mutação, usando a fórmula do Drake: μ = f ÷ ln (μNt). f é a frequência de mutação calculada pelo número de mutantes, dividido pelo número de células em cultura final. NT é o número de células em cultura final e μ é a taxa de mutação. Esta equação pode ser resolvida por um método iterativo, como o método de Newton-Raphson. Existem outros métodos de estimador, incluindo o teste de Lea e Coulson, para calcular a taxa de mutação15.</li>
		<li>Calcule o intervalo de confiança supondo log distribuição normal das taxas individuais isolados de utation. O intervalo de confiança de 95% é usado mais frequentemente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de espectro de mutação<ol>
<li>Escolher uma única colônia de cada 5-FOA ou pode da placa e atualize-se sobre uma placa YPDA.</li>
		<li>Executar a colônia PCR para amplificar o gene URA3 ou CAN1 e sequência para detectar mutações usando os seguintes primers: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') e URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') para ambos os amplificação por PCR e sequenciamento do gene URA3 bp 800; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') e CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') para amplificação e CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') e (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') para o sequenciamento do gene repórter 1800 bp CAN1 .</li>
		<li>Para realizar o PCR de colônia, resuspenda uma única colônia em 5 μL de H2O e 1 μL, usar como modelo. Adicionar 1 μL de cada um dos primers (estoque de 5 μM), 2 μL de tampão de x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0,5 μL de dNTP (2,5 mM), 0,5 μL de KAPA2G rápido DNA polimerase, 12 μL de H2O.</li>
		<li>Para a amplificação do gene URA3 , execute o seguinte programa PCR: 95 ° C por 5 min; 5 ciclos de 95 ° C por 10 s, 61 ° C, por 15 s, 72 ° C por 30 s; 35 ciclos de 95 ° C por 10 s, 61 ° C, por 15 s, 72 ° C por 30 s; 72 ° C por 2 min e espera a 4 ° C. Para a amplificação do gene CAN1 , execute o seguinte programa PCR: 95 ° C por 5 min; 5 ciclos de 95 ° C por 10 s, 61 ° C, por 15 s, 72 ° C por 45 s; 35 ciclos de 95 ° C por 10 s, 61 ° C, por 15 s, 72 ° C por 45 s; 72 ° C por 2 min e espera a 4 ° C.</li>
		<li>Alinhe os resultados de sequenciamento para uma sequência de referência usando um programa como o DNASTAR Seqman Pro ou Sequencher para identificar as mutações.</li>
		<li>Compile os dados de mutações por tipo de mutação (Figura 4) ou localização de mutação (Figura 5). Calcule as taxas de mutação específica pela frequência de uma mutação (o número de eventos observados dividido pelo número de mutantes sequenciados) multiplicaram pela taxa de mutação global.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+sugar:+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate.">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li><li>Sparks, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha,+epsilon,+delta,+and+zeta.">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li><li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+{alpha}+and+{delta}.">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li><li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon.">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity.">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).</li><li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development.">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition.">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos os protocolos para dois conjuntos de experiências que são frequentemente usados para analisar semi-quantitativamente ribonucleotídeos incorporados durante a replicação do DNA e os efeitos mutagênicos de ribonucleotídeos não reparados. Embora essas abordagens envolvem a eucariota modelo S. cerevisiae, estas técnicas podem ser facilmente adaptadas para outros micróbios e eucariontes ainda maiores.
Sondagem para ribonucleotídeos não reparados no DNA utilizando eletroforese alcalina-agarose juntamente com mancha do Sul fornece informações importantes sobre o número de ribonucleotídeos presentes e a vertente na qual eles foram incorporados. No entanto, é importante notar que do alcaloide-a sensibilidade também pode ser causada por outras lesões de DNA, como um site da básica. Outro meio de detecção de ribonucleotídeos no DNA é pelo tratamento com enzima purificada de RNase H2, como foi feito em células de mamíferos,21. Embora nossa abordagem envolve sondagem para sites sensíveis ao alcaloide na nascente líder contra atraso vertentes no gene repórter da URA3 usada em nossos experimentos de análise mutacional, é possível projetar as sondas que recozem em outros locais, em ordem para obter informações importantes sobre a densidade ribonucleotídeo em outros locais do genoma. O borrão do Sul parte do procedimento também pode ser usado como referência para outras experiências sondagem genéricas de DNA.
Medição de taxas de mutação usando um teste de flutuação tem sido amplamente utilizada para a análise de vários eventos mutagênicos em microorganismos e, portanto, não se limita à análise das consequências mutagénicas de ribonucleotídeos no DNA. Para este experimento, aumentando o número de culturas independentes pode aumentar consideravelmente a precisão da medição. Colônias independentes podem ser obtidas por estrias uma estirpe de interesse no médio YPDA ou pela análise das colônias de esporos independentes obtidos por dissecação Tétrade de uma mancha de levedura diploide. Idealmente, o uso de várias cepas de leveduras haploides independente (ex., de dissecação Tétrade) é incentivado para minimizar o impacto da variação de tensão-à-tensão. Isto é particularmente importante quando a taxa de mutação espontânea é alta, ou quando a tensão tem um defeito de crescimento. Um método adicional que pode ser empregado para medir espontânea a taxa de mutação é uma acumulação de mutação experimentar22. Nesta análise, frequência de mutação é determinada para as células, após crescimento extensivo e pode ser usada para calcular a taxa de mutação. Acoplamento de um experimento de acumulação de mutação com a tecnologia de sequenciamento profundo tem demonstrado para ser uma poderosa ferramenta para analisar a taxa de mutação e especificidade através do genoma.

Durante a replicação do DNA eucariótica nuclear, ribonucleotídeos são incorporados ao genoma por todos os três principais replicases de DNA, DNA polimerase (Pols) α, ε e δ1,2. Reparo de excisão do RNase H2-dependente ribonucleótido (RER3) remove a maioria destes ribonucleotídeos incorporados.
Um ribonucleótido no DNA é suscetível à hidrólise, como 2' grupo hidroxila da fracção de açúcar pode atacar o fosfodiéster adjacente, liberando uma extremidade com um fosfato cíclico 2' - 3' e o outro com uma 5'-OH4. Condições alcalinas grandemente podem acelerar esta reação. Assim, a hidrólise de ribonucleotídeos incorporados durante a incubação em uma solução básica causa a fragmentação de DNA genômico, que pode ser visualizado por electroforese de agarose alcalina5. Este DNA pode ser transferido para uma membrana e analisado pela análise de Southern blot utilizando sondas de vertente específicas que permitem a identificação dos locais sensíveis ao alcaloide causada por ribonucleotídeos incorporados para o nascente líder - ou revestimento-strand DNA, respectivamente.
Em células de levedura, falta de atividade RNase H2, remoção de ribonucleotídeos pode ser iniciada quando topoisomerase eu (Top1) rouba o DNA incorporado ribonucleótido6,7. No entanto, quando Top1 fende do lado 3' o ribonucleotídeo, isso gera 5'-OH e 2' - 3' fosfato cíclica DNA extremidades que são refratárias a religation. A reparação ou transformação aberrante destas extremidades' sujas' pode provocar instabilidade genômica. Além disso, se a incisão ocorre dentro de uma sequência de DNA a repetição, o processo de reparação pode levar a mutações de exclusão. Isto é particularmente problemático para repetições em tandem, onde curto exclusões (de entre dois e cinco pares de bases) são comumente observados em células de RNase H2-deficiente. Os efeitos deletérios de Top1-dependente na ausência de levedura RNase H2 atividade são exacerbados em um mutante ε da DNA polimerase (pol2-M644G) promíscuo para incorporação ribonucleótido durante a síntese de vertente principal nascente.
Processamento de ribonucleotídeos no DNA leva a mutações espontâneas e este mutagênese pode ser detectada usando genes repórter apropriado e selecionando para a mudança fenotípica que acompanha. Um teste de flutuação ou experiência de Luria e Delbrück é um dos métodos mais comumente utilizados para medir taxas de mutação espontânea, usando o repórter selecionável genes8,9. Fermento, os genes URA3 e CAN1 podem ser usados como repórteres em um ensaio de mutação para a frente, o que permite a detecção de todos os tipos de mutação que resultam em perda da função do gene. A taxa de mutação espontânea é estimada como a mediana de observadas em múltiplas culturas paralelas, iniciadas a partir de colônias única sem mutações no gene repórter do alvo. Uma levedura RNase H2-deficiente estirpe como rnh201Δ tem uma taxa de mutação espontânea em geral moderadamente elevados em grande parte causada por uma elevada incidência de exclusões de 2-5 bp em tandem repeat sequências. Assim, para caracterizar totalmente os efeitos mutagênicos de ribonucleotídeos no genoma, taxas de mutação específica precisam ser determinado. Neste caso, os genes repórter URA3 ou CAN1 podem ser amplificados e sequenciados para determinar os tipos e locais das mutações, e taxas de mutação específica podem ser calculadas. Compilar as mutações identificadas em vários mutantes independentes de URA3 ou CAN1 então pode ser usado para gerar um espectro de mutação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &#8211; 35 ml per plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAN plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 56 &#176;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &#176;C and cool down to 60 &#176;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Canavanine sulfate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FOA</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>F5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass culture tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture rotator in 30 &#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shaker incubator can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterile, any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm glass beads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-312A</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq DNA Polymerase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>MPY80200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Newer model available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Dot Scientific Inc.</td>
			<td>DSF10400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromocresol green</td>
			<td>Eastman</td>
			<td>6356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>International Technologies Inc.</td>
			<td>72120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 MM CHR Chromotography paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>7560-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-25 spin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-5325-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NaH2PO4 (S9638); 
			Na2HPO4 (S9390)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

A presença de ribonucleotídeos no DNA nuclear tem demonstrada ser uma fonte de instabilidade genômica. A extensão da incorporação do ribonucleotídeo pode ser avaliada por hidrólise alcalina e electroforese do gel como o RNA é altamente suscetível à hidrólise em condições alcalinas. Isto, em combinação com a análise de Southern blot pode ser usado para determinar a localização e a vertente em que foram incorporados os ribonucleotídeos. No entanto, este procedimento só é semiquantitativo e pode não ser suficientemente sensível para detectar pequenas alterações no conteúdo do ribonucleotídeo, apesar de Southern blot vertente específica de sondagem melhora a sensibilidade. Como uma medida de uma das consequências mais marcantes de ribonucleotídeos no DNA biológicas, mutagênese espontânea pode ser analisado usando um ensaio de mutação para a frente. Usando genes repórter apropriado, raras mutações que resulta na perda de função podem ser selecionada e total e taxas de mutação específico podem ser medidas pela combinação de dados das experiências de flutuação com o sequenciamento de DNA do gene repórter. O ensaio de flutuação é aplicável para examinar uma ampla variedade de processos mutagênicos no fundo genético específico ou condições de crescimento.

Tratamento de DNA genômico com alcaloide seguido por eletroforese em gel alcalina permite detecção semi-quantitativa da fragmentação de DNA devido à abundância de ribonucleotídeos estàvel incorporados. A Figura 2 mostra as imagens de gel de levedura DNA genômico tratado com ou sem KOH5. A variante M644L de Pol2, a subunidade catalítica de Polε, reduziu a capacidade de incorporar ribonucleotídeos enquanto o mutante M644G incorpora ribonucleotídeos mais do que o polymerase WT. Conforme detalhado no protocolo, o gel alcalino pode ser ainda mais sondado por Southern blot vertente específica análise. Com o conhecimento da localização do site genômica sondado em relação a suas origens adjacentes, nós pode seletivamente sonda incorporados a nascente de ribonucleotídeos levando ou vertentes de retardamento. A Figura 3 mostra os resultados de Southern blot, sondando o gene repórter URA3 inserido em duas orientações opostas, perto de uma origem de replicação de acionamento do início, ARS30616. Usando o levando a sondas específicas de vertente, observamos que o padrão de fragmentação de DNA causadas por álcali-clivagem de ribonucleotídeos no DNA de vertente principal nascente em uma cepa WT e em cepas expressando as variantes de polymerases α, δ e ε que são promíscuas para incorporação de ribonucleotídeo.
Usando um experimento de flutuação, podemos medir as taxas de mutação de cepas de leveduras contendo genes de repórter. A Figura 4 mostra as taxas de mutação no locus CAN1 cepas expressando WT polimerase ou o mutante pol2-M644G com ou sem funcional RNase H2 e URA3. A falta de RNase H2 causa um aumento moderado em geral taxas de mutação em ambos os planos de fundo. No entanto, uma análise mais aprofundada da especificidade de mutação revela que em cepas faltando RNase H2 (Figura 5), há um forte aumento da taxa de mutação para exclusões curtas, particularmente em sequências de repetição em tandem. Figura 5A compara a especificidade de mutação em WT e rnh cepas201Δ e Figura 5B exibe o efeito mutacional do mais elevado ribonucleótido incorporação a cadeia de DNA principal nascente por Pol ε.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig1.jpg"> Figura 1: etapas envolvidas na vertente específica detecção sensível do alcaloide sites causada pela incorporação de ribonucleotídeo no DNA genômico de levedura do protocolo. Uma visão geral das várias etapas principais envolvidas nesse procedimento, começando com isolamento de DNA genômico de levedura e prosseguindo através da análise final Southern blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig2.jpg"> Figura 2: uma imagem representativa dos resultados obtidos por eletroforese em gel de agarose alcalina. Esta figura foi adaptada de Nick McElhinny, et al . S. A. 5. levedura DNA genômico de cepas de diferentes genótipos foi tratado com KCl (neutro) ou KOH (alcalina) e, em seguida, separados em um gel de agarose alcalina. "WT" e "M644G" indicam o status de Pol ε. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig3.jpg"> Figura 3: Strand-específicos de um gel de agarose alcalina de probing Southern blot. Esta figura foi adaptada da Williams, et al . J. S. 13. (A) , as sondas radiolabeled recozem a nascente principal cadeia do DNA dentro do gene repórter URA3 que foi inserida em duas orientações opostas (OR1 e OR2) perto de ARS306 . (B) resultados representativos da mancha do Sul usando as nascentes principais vertente específica sondas. Exibido são os resultados de sondagem para a vertente principal nascente em uma cepa com as polimerases de DNA WT, ou o pol1-L868M, pol2-M644G ou o pol3-L612M variantes cepas com ou sem RNase H2. Os genes POL1, POL2 e POL3 codificam subunidades catalíticas de Pols α, ε e δ, respectivamente. As variantes são mais promíscuas para ribonucleótido incorporação5,12,17. (C) a quantificação do sinal radioativo por fração do total em cada faixa da (B). Valores são expressos em percentagem do total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig4.jpg"> Figura 4: taxas de mutação espontânea em cepas de leveduras. Esta figura foi adaptada de Nick McElhinny, et al . S. A. 5. os genes repórter URA3 e CAN1 foram utilizados no ensaio de mutação para a frente para medir as taxas de mutação das estirpes indicadas. URA3 repórter está na "orientação 2" (OR2, Figura 3A). O intervalo de confiança de 95% (IC) é incluído para cada medição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58020/58020fig5.jpg"> Figura 5: espectros de mutação para o gene repórter URA3-OR2. Esta figura foi adaptada de publicações anteriores5,18,19,20. O tipo de posição e mutação observado em cada colônia 5-FOA-resistente independente selecionada no ensaio de mutação para a frente são retratados no 804 bp a sequência de código URA3 . Letras indicam base substituições, triângulos abertos indicam exclusões de base única, fechados triângulos indicam inserções de base única, e linhas sólidas indicam curtas exclusões. (A) espectros de mutação em cepas WT e rnh201Δ . Etiquetas vermelhas acima a sequência são mutações observadas no WT enquanto rótulos azuis abaixo a sequência são aqueles observados com uma tensão de rnh201Δ . (B) espectros de mutação em cepas pol2-M644G e rnh201Δ pol2-M644G . Etiquetas vermelhas acima a sequência são mutações observadas em pol2-M644G enquanto azul abaixo a sequência para estirpes pol2-M644G rnh201Δ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58020/58020fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K visualizações.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS. Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.

Vídeo: Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Biologia

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...