この方法は、ウォーバーグの背後にある分子基盤やクラブツリー効果など、バイオテクノロジーおよび生物医学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、呼吸および発酵代謝における特定の物質の効果のハイスループット研究を可能にすることです。3ミリリットルの冷たい無菌2%酵母エキスペプトンデキストロース(YPDスープ)を含む15ミリリットルの円錐チューブを接種し、250マイクロリットルのS.cerevisiae酵母細胞を20°Cの陰性グリセロールで保存します。
30°Cと200 rpmで軌道シェーカーで酵母を一晩インキュベートします。翌朝、60ミリリットル、2%YPD寒天で満たされたペトリ皿にストリーキングのために。分離されたコロニーが観察されるまで、30°Cで皿を培養します。
その後、10ミリリットルのクールで無菌の2%YPDスープを含む新しい円錐形のチューブに単一の単一の単一のコロニーを接種し、摂氏30度で一晩培養します。マイクロプレートの成長曲線セットアップでは、ふた付きの無菌10-10ウェルマイクロプレートの各ウェルに適切な実験文化培地の145マイクロリットルを加え、一晩培養物の5マイクロリットルで各ウェルを接種します。その後、マイクロプレートリーダーに30°Cでマルチウェルプレートを200rpmで一定の攪拌で48時間インキュベートし、30分または60分ごとに600ナノメートルで光学密度を測定します。
振られた円錐形のフラスコ成長曲線のセットアップのために、摂氏30度および250rpmでインキュベーションのための2の600ナノメートル光学密度で200マイクロオノキュラム培養の適切な無菌培養の4.8ミリリットルを含む20ミリリットルの円錐形のフラスコを接種する。1分間に250回転での撹拌は、低い攪拌速度で呼吸状態における酵母の増殖の減少を観察したため、呼吸成長を発揮する低濃度の炭素源で適切な成長を達成するために重要です。2時間毎に600ナノメートルでの光学密度を24時間測定できるように、1ミリリットル分光光度計キュベットで900マイクロリットルの蒸留水で振った円錐形フラスコ培養液の100マイクロリットルを1ミリリットルの分光光度計キュベットで薄め、ピペットで穏やかに混合する。
データ処理の場合、適切な統計パッケージソフトウェアで、新しいプロジェクトファイルを作成し、新しいテーブルとグラフメニューを開いて、[XY]を選択します。サンプル データ メニューで、空のデータ テーブルとポイントと接続線グラフで開始を選択します。複製またはエラー値の場合は、サブ列で X セクションを選択解除したままにします。[Y] セクションで、[並べて並べられたサブ列に 10 個の反復値を入力し、平均とエラー SD をプロットする] を選択します。次に、[作成] をクリックします。
X列にOD測定値を取得した時間と、Y列の培養から得られたOD値を入力します。Y 列データを対数に変換する指数成長フェーズを識別するには、[解析] をクリックして変換分析を選択します。Y は、Y 値を選択し、結果のギャラリーを開くには、ログ Y を使用します。
変換データテーブルを選択し、分析をクリックし、線形トレンドに従わない光学密度値を除外して、表内の値を選択し、データテーブルギャラリーをE.Inして、データを1つのテーブルを選択して分析をクリックします。非線形回帰曲線適合解析と分析するデータセットを選択し、[OK]をクリックします。次に、補間セクションが選択されていない状態で、データに適合する最小二乗を適用し、[OK]をクリックします。次に、新しいプロジェクト ファイルを開き、新しいテーブルとグラフ メニューで列の選択を選択し、空のデータ テーブルから始めて、目的のグラフを選択します。標準偏差を使用して平均をプロットするようにグラフを設定し、[作成]をクリックします。
結果のギャラリーの非線形適合結果テーブルから平均時間またはデルタ時間の値をコピーし、データを列に貼り付けます。最後に、[分析]をクリックし、カラム分析メニューで対象の分析を選択して、さまざまな栄養条件の運動パラメータを比較します。成長速度閾値は強度によって異なり、解析で使用する条件に従って評価する必要があります。
発酵型を示す培養物は、小さなラグ相と高成長率の指数相を有する。酸化リン酸化によってエネルギーを得る培養物は、指数相の成長速度が遅いほど長いラグ相を呈する。指数成長方程式を使用して成長曲線の特定の成長率と倍率の時間を計算することで、呼吸および発酵成長値の閾値を設定することができます。
例えば、これらの代表的な実験では、S.cerevisiae BY4742細胞に対する異なるレスベラトロール濃度の影響は、様々なグルコース濃度に応答して細胞のエネルギー状態の修飾を明らかにする。ここで、10%グルコースの補充は、アンモニウムの低濃度がこれらの培養における拡張指数成長期によって証明されるように発酵代謝を好むが、より高い濃度は、指数関数相の間に拡張ラグ相および遅い増殖速度によって証明されるように、呼吸発酵代謝を誘発することを示す。最後に、発酵倍時間値の強い違いは、同じ条件下で成長したこれら2つの異なる酵母株の間で観察することができ、分析された各株の倍時間閾値を検証する必要性を強調する。
この手順を試みる際には、このプロトコルは表現型のスクリーニングにのみ使用されることを覚えておくことが重要です。呼吸と発酵に対する具体的な影響は、酸素消費アッセイまたは発酵副産物の蓄積によってそれぞれ確認されなければならない。
