이 방법은 워버그와 크랩트리 효과의 분자 기초가 무엇인지와 같은 생명 공학 및 생물 의학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 호흡기 및 발효 대사에서 특정 물질의 효과에 대한 높은 처리량 연구를 허용한다는 것입니다. 먼저 시원하고 멸균 된 2 % 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 또는 YPD 국물의 3 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원뿔 관을 접종하여 시작하며, S.cerevisiae 효모 세포의 250 마이크로 리터가 음의 섭씨 20도에서 글리세롤에 보존됩니다.
섭씨 30도, 200rpm의 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 효모를 배양합니다. 다음날 아침, 60밀리리터, 2%YPD 의 한마가 가득한 페트리 요리에 줄지어 서 있습니다. 고립된 식민지가 관찰될 때까지 요리는 섭씨 30도에서 문화합니다.
그런 다음 10 밀리리터의 시원한 멸균 2 %YPD 국물을 포함하는 새로운 원추형 튜브에서 하나의 고립 된 식민지를 접종하여 섭씨 30도에서 흔들림으로 밤새 문화를 제공합니다. 마이크로 플레이트 성장 곡선 설정의 경우, 145 마이크로리터의 적절한 실험 문화 매체를 각 웰에 뚜껑이 있는 멸균 10-10 웰 마이크로 플레이트에 추가하고 하룻밤 문화의 5 마이크로리터로 각각 잘 접종합니다. 그런 다음 마이크로 플레이트 판독기에서 섭씨 30도에서 48시간 동안 200rpm에서 일정한 교반을 하여 30 또는 60분마다 600 나노미터의 광학 밀도를 측정합니다.
흔들리는 원추형 플라스크 성장 곡선 설정의 경우, 30섭씨와 250rpm에서 배양을 위한 600나노미터 광학 밀도에서 200나노미터의 사전 접종 배양 배지가 있는 적절한 멸균 배양 배지의 4.8 밀리리터를 함유한 20밀리리터 원추형 플라스크를 접종한다. 분당 250개의 회전에서 의 동요는 우리가 낮은 동요 속도로 호흡 조건에서 감소효모 성장을 관찰했기 때문에 호흡 성장을 발휘하는 탄소 원의 저농도에 있는 적당한 성장을 달성하는 것이 중요합니다. 24시간 동안 2시간마다 600 나노미터의 광학 밀도를 측정할 수 있도록 1밀리리터 분광광미터 큐벳에 증류수 900 마이크로리터로 흔들리는 원뿔 플라스크 배양의 100마이크로리터를 희석하고 파이펫으로 부드럽게 혼합합니다.
데이터 처리의 경우 적절한 통계 패키지 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만들고 새 테이블 및 그래프 메뉴를 열고 XY를 선택합니다. 샘플 데이터 메뉴에서 빈 데이터 테이블과 점 및 연결 선 그래프로 시작합니다. 복제 또는 오류 값에 대해 하위 열에 X 섹션을 선택 해제하지 않은 상태로 둡니다. Y 섹션에서는 나란히 서브열에 복제 값 10을 입력하고 평균 및 오류 SD를 플롯합니다. 그런 다음 만들기를 클릭합니다.
X 컬럼에서 OD 측정값을 얻은 시간과 Y 열의 배양에서 얻은 OD 값을 입력합니다. Y 열 데이터를 로지반스MS로 변환하는 기하급수적 성장 단계를 식별하려면 변환 분석을 클릭하고 선택합니다. Y를 사용하여 로그 Y를 사용하여 Y 값을 선택하고 결과 갤러리를 엽니다.
변환 데이터 테이블을 선택하고, 분석하고, 선형 회귀 분석을 선택하고, 테이블의 값을 선택하고 컨트롤을 누르고 데이터 테이블 갤러리를 E.In 선형 추세를 따르지 않는 광학 밀도 값을 제외하고, 데이터 테이블 한 테이블을 선택하고 분석을 클릭합니다. 비선형 회귀 곡선 적합 분석 및 데이터 세트를 선택하여 분석하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 데이터에 맞는 사각형을 최소한 으로 적용하여 보간 섹션을 선택해제한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로 새 프로젝트 파일을 열고 새 테이블 및 그래프 메뉴에서 열 선택을 선택하고 빈 데이터 테이블및 원하는 그래프로 시작합니다. 표준 편차로 평균을 플롯하도록 그래프를 설정하고 만들기를 클릭합니다.
결과의 갤러리에 비선형 적합 결과 테이블에서 평균 또는 델타 시간 값을 복사하고 데이터를 열에 붙여 넣습니다. 마지막으로 열 분석 메뉴에 대한 관심 분석을 분석하고 선택하여 다양한 영양 조건의 운동 매개 변수를 비교합니다. 성장 운동 임계값은 강점마다 다르며 분석에 사용하는 조건에 따라 평가되어야 합니다.
발효 표현형을 보여주는 배양은 작은 지연 단계와 높은 성장률을 갖는 기하급수적 단계를 가지고 있습니다. 산화 인산화에 의해 주로 에너지를 얻는 배양은 지수 단계 동안 성장속도가 느린 더긴 지연 단계를 나타낸다. 기하급수적 성장 방정식을 사용하여 성장 곡선의 특정 성장 속도 및 두 배의 시간을 계산하면 호흡기 및 발효 성장 값에 대한 임계값을 설정할 수 있습니다.
예를 들어, 이러한 대표적인 실험에서, S.cerevisiae BY4742 세포에 대한 상이한 레스베라트롤 농도의 효과는 다양한 포도당 농도에 반응하여 세포 정력 상태의 변형을 드러낸다. 여기서, 10%의 포도당을 함유한 보충제는 이러한 배양에서 기하급수적인 성장 단계에 의해 입증된 바와 같이 암모늄의 낮은 농도가 발효 대사를 선호하는 반면, 높은 농도는 증가지연 단계와 기하수단계 동안 느린 성장속도에 의해 입증된 바와 같이 호흡발효대사를 유도한다. 마지막으로, 발효 이중 시간 값의 강력한 차이는 동일한 조건에서 자라는 이 두 가지 다른 효모 균주 사이에서 관찰될 수 있으며, 분석된 각 균주에 대해 두 배시간 임계값을 검증할 필요성을 강조한다.
이 절차를 시도하는 동안이 프로토콜은 표현형을 선별하는 데만 사용된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 호흡 및 발효에 대한 구체적인 영향은 산소 소비 측정또는 발효 부산물의 축적에 의해 각각 확인되어야 합니다.
