Name: odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
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著者らは、米国国立衛生研究所からのJDAへのU54 RR022220およびP50 GM076547の付与により、この研究の支持を認めている。 FDMは、カナダ研究所の健康研究の博士研究員です。また、ルクセンブルグのシステムバイオメディシンセンターとルクセンブルグ大学のサポートにも感謝します。

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著者は何も開示することはない。

ODELAYアッセイは、再現可能で信頼できる表現型測定を確実にするためにいくつかの重要な点を有する。第1の重要な点は、酵母培養物の一貫した調製である。酵母細胞を対数増殖から収穫するように注意しなければならない。培養物が飽和していると、それらの集団の異種性が増加し、遺伝的または環境的（ 例えば、炭素源）因子11によって引き起こされる異質性を不明瞭にすることがある11 。第2の重要な点は、メディアの一貫した準備です。一般に、多量の10倍ストック培地溶液を生成し、経時的に使用してバッチ効果を最小限に抑える必要があります。可能であれば、培地を重量で処方することは、寒天の密度およびアガロースの全水分含量を注意深く監視することによって、時間の経過とともに培地の一貫性を改善するのに役立つ。第3の重要な点は、アガロースの機械的変形を最小化または排除することである直径培地の機械的変形は、ガラススライドからのアガロースの分離中に最も一般的に起こる。多くの実験技術と同様に、このステップを習得するためには練習が必要です。 図4に示すラグタイムの変動は、アガロース培地の機械的変形、寒天の厚さの変化、または不安定な光源の3つの要因の1つに関連することがよくあります。アガロース媒体がスポットアレイ内でZ高さが変化する場合、高さの変動はオートフォーカスルーチンの範囲を圧倒し、初期画像にわずかに焦点が合わないことがあります。このため、中央の複数のスポットで、フォーカスされたアレイのエッジに沿ってフォーカスの高さを確認し、オートフォーカスルーチンがフォーカスを見つけるのに十分なZ範囲を持つことを確認します。必要に応じて、オートフォーカスパネルを使用してフォーカス範囲を広げ、フォーカスのステップ数を増やします。 3番目に可能な条件イオンは、不安定またはちらつきのある光源であり、特定のZ高さについて計算された焦点スコアを乱す可能性があります。タングステンハロゲン電球は電球が燃える前によくちらつく傾向があります。弱い焦点の効果は、第1および第2の時点（ 図 5A ）の間に成長曲線がディップし、隣接する点が同じディップを有さない（ 図 5B ）一例で観察される。この場合、タングステンハロゲン光源を交換することにより、不十分な焦点条件が緩和された。 実際には、100Wのタングステンハロゲン電球のちらつきを低減するためには、顕微鏡を大量に使用している場合、電球を500時間ごとまたはおよそ2ヶ月に1回交換する必要があることが実証されている。ちらつき球からのフォーカスの問題を避けるため、タングステンハロゲン光源を頻繁に交換するか、ハロゲン球をダイオード光源に交換してください。アン倍加時間のばらつきが小さく、より均一なラグタイムを示すデータセットの例を図6に示します 。このデータセットは、オートフォーカスを実行しながら時間の経過とともにより安定した照明を提供するダイオードイルミネータで撮影されました。 文献では、メディアの準備を最適化するためにここで述べた多くの点が明白であるように見えるかもしれませんが、最も大規模なスクリーンはお互いにうまく複製しません8,11。したがって、より再現性のある表現型のスクリーニングが生成されるように、我々は培養およびアガロース培地の調製を注意深く記述した。 ODELAYアッセイは、現在のところ、合成遺伝子アレイまたはScan-O-Maticアッセイなどのピニングに基づくアッセイと比較した場合、スループットが制限されている。これらの方法は、測定される菌株の数を増加させるが、個々の細胞を分解する能力が欠如しているしたがって、クローン酵母株内で観察される集団の異種性を測定することはできない。この集団の異質性の起源は現在理解されていませんが、ここに示されている技術と計算の融合は、基礎となる細胞メカニズムを客観的に扱う機会を提供します12 。 著者はODELAYは現在特定の顕微鏡ブランドとボディタイプにのみ最適化されていることに注意したい。他の顕微鏡システム用にODELAYを変更することは簡単ですが、オープンソースAPI 13の知識が必要です。しかし、APIおよびODELAYスクリプトの両方は、異なるシステムおよび実験的アッセイに容易に適合するように書かれている。 ODELAYはもともと酵母用に開発されましたが、 Mycobacterium smegmatisの増殖を観察するためにそのまま使用することができました。他のコロニー形成微生物の観察は提供されたソースコードに変更を加えることが可能です。一般に、ODELAYは、異なる環境条件および遺伝的撹乱下で増殖した微生物を比較するための強力かつ柔軟なツールである。

微生物の増殖表現型は、所与の環境条件に対するそれらの根底にある遺伝的適合性の強力な指標である。成長は、古典的に3つの異なる成長レジーム、すなわち、ラグ期、対数期および定常期の成長に分けられる。各成長段階は、様々な環境および遺伝的条件に依存する適応性の異なる側面を明らかにすることができる。例えば、生物が指数関数的増殖の開始前に遅滞期に費やす遅れ時間または時間は、変化した環境条件に応答する生物の能力を示すことができる2 。対数増殖期の2倍の時間、最も一般的な細胞適合度は、複製に環境物質を代謝および利用することによって分裂する生物の全体的な効率を明らかにする。対数期後の成長が急速に減少する定常期は、適格性のもう一つの指標であり、定期的スポットベースの酵母増殖アッセイにおいて成長エンドポイントとして使用される。 現在、いくつかの酵母増殖アッセイが利用可能であり、酵母3,4,5における増殖表現型を評価するための標準的な方法と考えられている。これらのアッセイは、主として固体培地または液体培地のいずれかで酵母を成長させる方法に基づいている。固体培地では、コロニーピニングアッセイは、ピンを用いて固体寒天上に少数の細胞を移動させ、酵母細胞を一定期間増殖させる。次いで、コロニーを画像化し、それらのサイズを終点のエンドポイント6で比較する。これらのコロニーピニングアッセイは、ゲノムワイドスクリーンを生成するために堅牢でスケーラブルであることが証明されている。より最近では、フラットベッドスキャナーおよびSLR（Single Lens Reflex）カメラを用いた周期的な画像化が、これらのアッセイに組み込まれて、時間の経過とともにコロニーの成長が記録される7,8、 9 。しかしながら、これらの装置の分解能は、それらが単一細胞を検出することを妨げ、したがって、これらのコロニー固定アッセイは、ラグタイムを直接観察せず、コロニーに成長する個々の細胞間の変異を観察することができない。 ゲノムワイドスクリーンを行うために、液体ベースの成長アッセイも採用されている3 。液体成長アッセイを経時的顕微鏡と組み合わせることにより、遺伝的に同一の個々の細胞の倍加時間における集団の異質性が明らかとなり、これは遺伝的調節および環境適応を理解するための重要な視点を提供する。しかしながら、このアッセイは、ラグタイムおよびキャリー能力などの成長の他の側面を測定しない。ここでは、ODELAY 11と呼ばれるアッセイを用いて、固体培地上のコロニー形成微生物の3つの成長段階のすべてを特徴付ける方法を提示する。 ODELAYはutiliで構成されていますハイスループットの時間分解顕微鏡を用いて固体培地上のコロニーに成長する単一細胞の画像を記録する。コロニーに成長する個々の細胞のこの集団は、基礎となる集団の異種性を明らかにするが、これは、終点のエンドポイントのスコアリングなどの他の感度の低い測定によっては検出されない。私たちは酵母でこの方法を実証していますが、ODELAYは明視野顕微鏡検査でコントラストを示す生物に適用されるかもしれません。

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Yeast Extract Peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 case</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate flat bottom</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Hydra liquid handleing robot</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA objective</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB with image processing tool box</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Chamber</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td></tr></tbody></table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

微生物の増殖表現型は、それらの根底にある遺伝的適応性の強い指標であり、3つの成長レジーム、すなわち、ラグ期、対数期、および定常期に分離することができる。それぞれの成長段階は、様々な環境および遺伝的条件に関連する適応性の異なる側面を明らかにすることができる。 3つの成長段階すべての高分解能および定量的測定は、一般に入手が困難である。ここでは、酵母の生きた配列（ODELAY）の1細胞倍加評価と呼ばれるアッセイを用いて、固体培地上の3つの成長段階のすべてを特徴付ける詳細な方法を提示する。 ODELAYは、時間経過顕微鏡法を用いて固体培地上でコロニーに成長する個々の細胞の増殖表現型を定量化する。この方法は、コロニーに成長する遺伝的に同一の細胞における各成長パラメータでの集団の異質性を直接観察することができる。この集団の異質性は、遺伝的および後成的な調節を理解するためのユニークな視点を提供し、遺伝的および環境的摂動。 ODELAY法は酵母を用いて実証されているが、明視野顕微鏡法で見える任意のコロニー形成微生物に利用することができる。

<html>タイムラプス顕微鏡法で増殖する酵母の例示的な画像を図3Bに示す。時間経過画像を処理した後、酵母株BY4741およびBY4742を比較する代表的なデータセットを図4に示す。この例のデータセットでは、プレート上の異なる位置の間の倍加時間にはほとんど変化がありません。アガロース培地が十分に調製されていない場合、アガロースゲルの変形領域と一致するスポット位置において、倍加時間および遅延時間の両方の明らかな偏差が明らかであろう。倍加時間は比較的均一であるように見えるが、この実施例は遅延時間測定の変化を示す。より一貫性のあるデータセットを図6に示します 。このデータセットでは、ラグタイムとダブリングタイムの両方が均一です。 files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：寒天モールドアセンブリ。 寒天鋳型の成分を（ A ）に示す。 （ B ）に示すようにベースを組み立て、小さなバインダークリップでベースを固定します。より長い垂直の部分をベースのキャビティ（ C ）に置き、（ D ）に示すようにスライドを金型にキャンプキャンプします。スライドガラス（ E ）からの寒天の一貫した分離に必要な金型の角度および型切れの方向を示す側面図。親指と人​​差し指の位置、および寒天の直線をスライド（ F ）から分離し、水平の矢印に注意してください。分離線は、垂直の矢印の方向に均等に移動する必要があります。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> = &quot;jove_content&quot; fo：keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> 図2：音波処理およびスポッティング法。 プレートを氷水中で超音波処理し、プレート（ A ）を支持するために遠心分離バケットホルダーを使用する。アガロースプレート（ B ）上にスポッティングするために、3.8.1のステップのプレートを置きます。また、チップの最左端にC10の位置にチップが1つ、他の4つの先端が切断されてプレートホルダー（ C ）が破損しないようにヒントを配置します。内側の24の先端位置が占有されるように残りの先端を4つのボックスに配置する（ D ）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：ODELAYグラフィカルユーザインタフェース。 &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot;（ A ）のグラフィカルユーザーインターフェイスのスクリーンショット。このインターフェースは、カメラの監視を可能にし、落射蛍光及び明視野モードの顕微鏡照明設定を調整する。赤い矢印は、カメラを起動して画像をすばやく取得し、送信された光シャッターを開くための[フォーカス]ボタンと[送信]ボタンを示しています。青い矢印は、原点のステージを移動させ、「原点移動」ボタンと「設定」ボタンを使用して原点を設定するために使用されます。緑色の矢印は「リセット」と「ODELAY !!!」を指します。 ODELAY画像モードを現在の状態にリセットし、ODELAY画像収集を開始するボタン。スポッティング後0,3,6、および9時間で固体培地上で増殖する酵母の経時的画像（ B ）。 &quot;ODELAY_IPT.m&quot;またはthのグラフィカルユーザーインターフェイスのスクリーンショット<html>イメージ処理ツール（ C ）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> 図4：ODELAY出力の例 このデータセットは、YPD培地上のBY4741株およびBY4742株を比較する。この図は、十分に調製されたアガローススライドの例である。しかし、オートフォーカスの設定は最適ではありません。各列には、左から右に提示されるデータは次のとおりです。倍加時間、分で与えられる;遅れ時間は、minで与えられる。この例では、寒天スライド上のすべてのスポットの倍加時間は、カラムに向かう少量の倍加時間を伴って上がります。しかし、このデータセットでは、遅延時間がかなり異なる。_upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> 図5：成長曲線の例 この例は、不十分な初期焦点が、どのように隣接する位置がより短い遅延時間（ B ）を示す一方で、推定遅延時間（t lag ）を増加させる（ A ）かを示す。 t dは分単位の倍加時間であり、t lagは分単位の遅延時間である。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> 図6：よく実行されたテスト実験の例 電子タングステンハロゲンバルブをダイオードイルミネータに交換し、オートフォーカスが正しく設定されていることを確認した後に試験されたBY4742株の一例。すべての倍加時間はよく重なるように見え、遅れ時間は一貫しているように見える。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

私たちは、個々の酵母細胞の成長表現型を、酵母（ODELAY）の生存アレイの1細胞倍加評価と称する経時的顕微鏡法を用いて固体培地上でコロニー中に増殖させる際に定量する方法を提示する。コロニーに成長する遺伝的に同一の細胞の集団の異種性を直接観察および定量することができる。

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.1K ビュー.  Institute for Systems Biology. 私たちは、個々の酵母細胞の成長表現型を、酵母（ODELAY）の生存アレイの1細胞倍加評価と称する経時的顕微鏡法を用いて固体培地上でコロニー中に増殖させる際に定量する方法を提示する。コロニーに成長する遺伝的に同一の細胞の集団の異種性を直接観察および定量することができる。 

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Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

遺伝学

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

生物学

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

免疫・感染学

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

細菌の増殖の高精度、高スループットの分析

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

酵母呼吸と発酵代謝を分析するバッチ文化の指数関数的成長カイネティクス

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

要約

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酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

出芽酵母の複製寿命の測定

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

細菌の増殖の高精度、高スループットの分析

酵母呼吸と発酵代謝を分析するバッチ文化の指数関数的成長カイネティクス

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

要約

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酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

出芽酵母の複製寿命の測定

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

細菌の増殖の高精度、高スループットの分析

酵母呼吸と発酵代謝を分析するバッチ文化の指数関数的成長カイネティクス

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で