Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos biotecnológico e biomédico, como quais são as bases moleculares por trás dos efeitos Warburg e Crabtree. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo de alto rendimento dos efeitos de certas substâncias no metabolismo respiratório e fermentativo. Comece inoculando um tubo cônico de 15 mililitros contendo três mililitros de leveduras frias e estéreis de 2% extrato de peptone dextrose, ou caldo YPD, com 250 microliters de células de levedura S.cerevisiae preservadas em glicerol a 20 graus negativos Celsius.
Incubar a levedura durante a noite em um agitador orbital a 30 graus Celsius e 200 rpm. para streaking em um 60-milliliter, 2%YPD ágar-filled placa Petri na manhã seguinte. Cultura o prato a 30 graus Celsius até colônias isoladas serem observadas.
Em seguida, inocular uma única colônia isolada em um novo tubo cônico contendo 10 mililitros de caldo fresco e estéril 2%YPD para cultura durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Para a configuração da curva de crescimento de microplapes, adicione 145 microliters de um meio cultural experimental apropriado para cada poço de uma microplata estéril de 10 por 10 poços com uma tampa e inocula cada poço com cinco microliters da cultura da noite para o dia. Em seguida, incubar a placa multi-poço em um leitor de microplato a 30 graus Celsius com agitação constante a 200 rpm por 48 horas, medindo a densidade óptica em 600 nanômetros a cada 30 ou 60 minutos.
Para a configuração de curva de crescimento de frascos cônicos abalados, inoculam frascos cônicos de 20 mililitros contendo 4,8 mililitros de uma mídia de cultura estéril apropriada com 200 microliters de cultura pré-inóculo a uma densidade óptica de 600 nanômetros de dois para incubação a 30 graus Celsius e 250 rpm. A agitação a 250 revoluções por minuto é fundamental para alcançar um crescimento adequado em baixas concentrações de fontes de carbono que exercem crescimento respiratório, como observamos um crescimento reduzido da levedura em condições respiratórias a velocidades de agitação mais baixas. Para permitir a medição da densidade óptica a 600 nanômetros a cada duas horas durante 24 horas, diluir 100 microliters da cultura de frascos cônicos abalados em 900 microliters de água destilada em um cuvette espectrótmetro de um milímetro e misturar suavemente por pipeta.
Para o processamento de dados, em um software de pacote estatístico apropriado, crie um novo arquivo de projeto, abra a nova tabela e o menu gráfico e selecione XY. No menu de dados da amostra, selecione iniciar com uma tabela de dados vazia e um gráfico de pontos e linha de conexão. Deixe a seção X não eleita em subcolumns para réplicas ou valores de erro. Na seção Y, selecione inserir 10 valores de réplica em subcolumns lado a lado e digite e erro SD. Em seguida, clique em criar.
Insira o tempo em que as medidas de OD foram obtidas na coluna X e os valores de OD obtidos a partir das culturas na coluna Y. Para identificar a fase de crescimento exponencial transformando os dados da coluna Y em logaritmos, clique em analisar e selecionar a análise de transformação. Use Y é igual a log Y para selecionar os valores Y e abrir a galeria de resultados.
Selecione a tabela de dados de transformação, clique em analisar e selecione a análise de regressão linear, excluindo os valores de densidade óptica que não seguem uma tendência linear selecionando os valores na tabela e deprimindo o controle e E.In galeria de tabelas de dados, selecione a tabela de dados e clique em analisar. Selecione a análise de ajuste da curva de regressão não linear e os conjuntos de dados para analisar e clique em OK. Em seguida, aplique pelo menos quadrados adequados aos dados, deixando a seção interpolada não eleita e clique em OK. Em seguida, abra um novo arquivo de projeto e, na nova tabela e menu gráfico, selecione a escolha da coluna, comece com uma tabela de dados vazia e o gráfico desejado. Defina o gráfico para traçar a média com o desvio padrão e clique em criar.
Copie os valores médios ou delta da tabela de resultados de ajuste não linear na galeria de resultados e cole os dados em uma coluna. Por fim, clique em analisar e selecione a análise de interesse no menu de análises da coluna para comparar os parâmetros cinéticos das diferentes condições nutritivas. Os valores do limiar cinético de crescimento variam entre pontos fortes e devem ser avaliados de acordo com as condições que usamos na análise.
Culturas que demonstram um fenótipo fermentativo têm uma pequena fase de defasagem e uma fase exponencial com alta taxa de crescimento. Culturas que obtêm energia principalmente por fosforilação oxidativa apresentam uma fase de defasagem mais longa com uma taxa lenta de crescimento durante a fase exponencial. O cálculo da taxa de crescimento específica e o tempo de duplicação das curvas de crescimento usando a equação de crescimento exponencial permitem a definição de limiares para os valores de crescimento respiratório e fermentativo.
Por exemplo, nestes experimentos representativos, os efeitos de diferentes concentrações de resveratrol em células S.cerevisiae BY4742 revelam a modificação do estado energético celular em resposta a diferentes concentrações de glicose. Aqui, a suplementação com 10% de glicose demonstra que as concentrações mais baixas de amônio favorecem o metabolismo fermentar, como evidenciado por uma fase de crescimento exponencial prolongada nessas culturas, enquanto uma maior concentração induz um metabolismo respiro-fermentativo como evidenciado por uma fase de defasagem prolongada e uma taxa de crescimento mais lenta durante a fase exponencial. Finalmente, podem ser observadas diferenças robustas nos valores de tempo de duplicação fermentares entre essas duas cepas diferentes de levedura cultivadas sob as mesmas condições, destacando a necessidade de validar o limiar de duplicação para cada cepa analisada.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este protocolo é usado apenas para rastrear fenótipo. Os efeitos específicos sobre a respiração e a fermentação devem ser confirmados por ensaios de consumo de oxigênio ou pelo acúmulo de subprodutos de fermentação, respectivamente.
