この作業によって支えられた全米科学財団は a. s. (DEB #1427772、1745411、1750037) に付与します。

1. マダニ コレクションと表面殺菌
<ol><li>ダニ ダニ削除ティック関連する生息地の上 1 m2白い布をドラッグしてホスト種に添付またはラボ15,16刻み飼育収集。微細鉗子を使用してダニを操作し、-80 ° C で保存</li>
	<li>個々 の PCR チューブにダニを置き、15 のボルテックスによって表面の汚染物質を除去を過酸化水素 (H2O2)、70% エタノール、ddH2O を 500 μ l 連続 s</li>
	<li>新しい PCR チューブにダニを置き、空気乾燥させます。</li>
	<li>このチューブの機械的に乳鉢と乳棒 (本研究で使用される)、ビーズ ビーターの小さなビーズを使用してダニを粉砕してティック組織を中断またはメスと離れて目盛りを切断します。</li>
</ol>2. DNA 精製
<ol><li>市販 DNA 抽出キットで提供される指示に従って個々 のタイマー刻みから DNA を浄化します。100 μ L の最終巻を溶出します。 注: は、2.2 2.8 の手順の概要については図 1を参照してください。キレート材料20,21抽出やエタノール沈殿物19フェノール-クロロホルム抽出17,18代替抽出方法があります。</li>
	<li>蛍光光度計や分光光度計を使用して成功の DNA の浄化を確認します。蛍光分析、190 μ L 二本鎖 DNA 分析の DNA のテンプレートの 10 μ L を使用します。予想収量は 0.1 〜 1.0 ng/μ L22。吸光光度法、核酸定量で 1 μ L の DNA のテンプレートを使用します。予想される A260/280 の比率は約 1.823です。</li>
	<li>増幅にすぐに進むは、-20 ° C で試料を保存されていない場合</li>
</ol>3. 16S rRNA 遺伝子増幅
<ol><li>27.5 μ L 反応含むで PCR 増幅を設定: 1 μ m; 各プライマーの 5 μ L市販の 12.5 μ L PCR ミックス;5 ng/μ L の濃度で各タイマー刻みから抽出した DNA の 5 μ L。 注: は 16S rRNA 遺伝子13の超可変 V3 V4 領域の拡大のため次のプライマーを使用します。 5 ' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3' 5 ' - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3'</li>
	<li>たちのためにプログラムにチューブを移動: 3 分; 95 ° C で初期変性25 サイクル 1) 95 ° C の 30 s、2) 57 ° C、30 秒、3) 72 ° C、30 s;5 分; 72 ° C で最終的な拡張10 ° C で最終開催</li>
	<li>PCR が終わったら、4-6 μ L/1.5% の agarose のゲルにサンプルをロードすることによって PCR の製品を視覚化します。460 でバンドを探す bp の増幅を確認します。 注: 増幅 PCR の製品が表示されない、ゲルのサンプル濃度が低すぎる場合 (< 10 ng)。プライマー二量体の存在は、低濃度のサンプルで共通です。他の非ターゲットのバンドが存在する場合、アニーリング温度を調整またはサイクルの数を減らします。</li>
	<li>浄化にすぐに進むが 4 ° C で試料を保存されていない場合</li>
</ol>4. 16S 私アンプリコン浄化
<ol><li>新しい PCR チューブを使用すると、各サンプルの ddH2O 60 μ L の合計を取得すると PCR の製品を組み合わせます。低濃度の DNA サンプルは、増幅バイアスを軽減し、集中するサンプルをプールに 3 通で PCR 増幅を実行します。</li>
	<li>それらを使用する前によく部屋の温度と渦に常磁性ビーズをもたらします。</li>
	<li>60 μ L のサンプルを常磁性ビーズの 48 μ L を追加し、5 分管磁気ラック ソリューションになるまで 5 分とオフの場所間インキュベートします。上澄みを除去します。 注: このビーズ濃度対象プライマー二量体 (< 60 bp) の除去です。必要な場合は、他の非固有のバンドを削除するビーズ濃度を調整します。</li>
	<li>磁気ラックにチューブ、出来立ての 80% の 500 μ L を追加江藤。全ての試験管にエタノールを追加した直後に、液体をピペットします。ビーズを削除しないでください。エタノール付加と除去 1 つのより多くの時間を繰り返します。</li>
	<li>磁気ラック 5 分または小さいひびがビーズで表示されるまでにチューブを開いたままで余分なエタノールを削除するサンプルを風乾します。</li>
	<li>TE バッファーの 20 μ L を追加し、5-10 分の室温で磁石をサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>背面磁石チューブを配置します。一度ビーズと液体を分離、洗浄の PCR の製品を取得する新鮮なチューブに上清を転送します。</li>
	<li>(省略可能)4-6 μ L/1.5% のゲルにサンプルをロードすることによって成功した私アンプリコン浄化を確認する製品を視覚化します。460 bp のバンドは見えるべきであるおよびプライマー二量体はないはず。</li>
	<li>PCR のインデックスにすぐに進んでいない場合のサンプルを格納 4 ° C</li>
</ol>5. サンプルのバーコードと浄化
<ol><li>前方または逆プライマーまたは市販ライブラリ インデックス キットから、両方を選択して、各サンプルに特異的プライマーの組み合わせを割り当てます。 注: シーケンスの後の微分をラベル見本を一意にできます。キットは通常 96 384 サンプルをシーケンス処理するのに十分なプライマーを提供します。</li>
	<li>デュアル プライマーまたはインデックスを各プライマー (N7xx と S5xx)、12.5 μ L の市販 PCR マスター ミックス、ddH2O、5 μ L、掃除私アンプリコン製品の 2.5 μ L の 2.5 μ L を含む 25 μ L 反応で PCR を行うことでサンプルに添付します。</li>
	<li>たちのためにプログラムにチューブを移動: 3 分; 95 ° C で初期変性8-14 サイクル 1) 95 ° C の 30 s、2) 55 ° C、30 s、30 ° C、3) 72 s;5 分; 72 ° C で最終的な拡張10 ° C で最終開催</li>
	<li>PCR が終わったら、4-6 μ L/1.5% の agarose のゲルにサンプルをロードすることによって PCR の製品を視覚化します。550 でバンドを探す bp の増幅を確認します。 注: インデックス PCR の循環状態を通知するための可視化結果を使用します。非特異的結合を緩和したり、サンプルごとに目に見えるバンドを取得するサイクル数を増やすサイクル数を下げます。</li>
	<li>手順 4 に記載されている、クリーンアップ手順を繰り返します。クリーンアップ中に希釈を避けるためには、重複してインデックスの PCR を実行し、プールをここの製品。</li>
	<li>いない場合はライブラリの定量化と正規化にすぐに進むの 4 ° C でサンプルを格納</li>
</ol>6. ライブラリの定量化と正規化
<ol><li>ステップ 5.5 蛍光光度計や分光光度計を使用して各精製、バーコード製品の濃度を推定 (手順 2.2 参照)。約 13 の濃度を得るために TE バッファーでサンプルを希釈します。 注: ライブラリ定量化試料シーケンス プラットフォームの推奨濃度を達成するために必要です。ライブラリの定量化、qPCR、によって達成されるが、qPCR 前サンプル濃度試薬と時間の節約します。13 濃度を定量キット24qPCR 基準の濃度の平均値は、このライブラリ定量の精度を最大限に推奨します。</li>
	<li>QPCR マスター ミックス (ライブラリ定量キット) から、ddH2O、2.0 μ L、サンプルまたは標準の 2.0 μ L の 6.0 μ L を含む 10 μ L 反応の qPCR を実行します。各サンプルと標準より高い精度と精度の 3 通を実行します。3 つ以上の希釈レベルで各サンプルを実行 (e.g。、12:01、1 pm、および推定開始濃度 22) 定量の正確さを確保するため。 注: 指定されたプライマーと基準の詳細については、使用数量キットによって異なります、製品テクニカル データ シートで利用できます。本研究で用いた定量キットの材料表を参照してください。</li>
	<li>QPCR プレートまたはチューブのプログラム リアルタイム PCR 機器に移動: 95 ° C、5 分; の初期変性35 サイクル 1) 95 ° C の 30 s の 45 ° C、2) 60 s;解離ステップ 1) 95 ° C、15 s、2) 60 ° C、30 s、および 3) 95 ° C、15 s。</li>
	<li>QPCR の結果から得られた定量値と使用サンプルの希釈レベルを使用して、各サンプルの濃度を始めて平均を計算します。 注: たとえば、サンプル希釈 1: 100,000 の 14 の平均濃度が得られます 200 の元の開始濃度 nM。定量化結果が正確にできない場合があります標準曲線の範囲内である特定のサンプルの希釈レベルのいずれもしないする場合その場合は、希釈を調整し、再 qPCR を実行します。</li>
	<li>4 各精製、バーコード サンプルを希釈ステップ 7.5 で計算された平均濃度を用いた TE バッファーで nM。 注: たとえば、平均サンプル濃度 200 nM、希薄、サンプル 1:50 で TE バッファー 4 nM 濃度を達成するために。正確なサンプル濃度は使用されるシーケンス システムと試薬キットによって異なります。推奨濃度のシーケンス システムのユーザー ガイドを参照してください。</li>
	<li>単管に等しいボリューム (通常 5-10 μ L) を追加することによってすべての個々 のライブラリの結合されたライブラリを作成します。 注: すべてのサンプルは 4 nM 濃度にする必要があります等しいボリュームの追加プールされたライブラリのすべてのサンプルの等しい濃度を実現しています。</li>
	<li>6.2 6.4 4 nM 濃度を確認するため結合されたライブラリの手順を繰り返します。</li>
	<li>結合されたライブラリの濃度を計算して希釈または再 4 を達成するために必要に応じて Tris バッファーを使用して、プールに最終的なライブラリを構成する nM。</li>
	<li>サンプル ロードにすぐに進むは、-20 ° C で試料を保存されていない場合損失や貯蔵中の DNA 濃度への変更を最小限に抑えるための定量化の直後に実行シーケンスを実行します。</li>
</ol>7. ライブラリ変性および希釈、およびシーケンスを実行 (同じ日に実行)
<ol><li>4 ステップ 6.9 naoh から nM 結合されたライブラリを変化させなさい。 メモ: 最後のライブラリの準備手順は、シーケンス システムごとに異なります。詳細かつ最新のプロトコル シーケンス システムのユーザーズ ガイドを参照してください。新しいユーザーは、シーケンス処理プラットフォームの使用に関するトレーニングを受ける必要があります。 またはコア シーケンス処理施設を自分たちのライブラリを送信可能性があります。</li>
	<li>シーケンス試薬キット (材料表) で指定されたバッファーを使用して必要な読み込み濃度変性ライブラリを希釈します。 注: 最適な読み込み濃度はシーケンス システムと通常 1 250 午後25からの範囲によって異なります。</li>
	<li>変性し、シーケンス制御を希釈します。 注: はシーケンス制御を追加する低多様性ライブラリから生じるシーケンス処理の問題を修正します。NaOH を使用してシーケンス制御を変化させなさいし、ライブラリと同じ濃度に希釈します。</li>
	<li>ライブラリとシーケンス制御を組み合わせます。 注: ライブラリの多様性とシーケンス システムを使用すると、結合されたライブラリに、シーケンス制御の比率によって異なりますが、それは通常の 1:1 の26。</li>
	<li>結合されたライブラリを読み込み、シーケンス フロー セルにシーケンス制御混合します。</li>
</ol>8. 私アンプリコン シーケンス解析
<ol><li>使用シーケンス システムに対応するクラウド コンピューティング環境で実行の指標を調べることによって実行の全体的な成功を評価します。 注: 配列読み取りの数など、実行のメトリックは使用されるプラットフォームと試薬キットをシーケンスに基づいて異なります。一般的なシーケンス システムの目標値は、表 1に表示されます。</li>
	<li>生シーケンス データをダウンロードし、必要なバイオインフォマティクスのオープン ソース ソフトウェア、微生物生態学 (QIIME)27または Mothur28に量的な洞察力。 注: 両方 QIIME と Mothur、オープン ソースと無料でダウンロードします。これらのプログラムを使用しての詳細についてはオンライン見つけることができ、初めてユーザーの詳細が十分に。以下の手順は、QIIME で実施したバイオインフォマティクス パイプラインの広範な概要を提供します。Python に精通している必要はありませんが、以下のスクリプトの実装を容易にします。</li>
	<li>作成し、QIIME の"validate_mapping_file.py"のスクリプトを使用してマッピング ファイルを検証します。 注意: マッピング ファイルには、サンプル ID、私アンプリコンのプライマー シーケンス サンプルの説明など、データ分析を実行に必要なすべてのメタデータが含まれています。検証手順は、すべての必要なデータを適切な形式で入力されていることを確認します。</li>
	<li>デマルチプレックスして"split_libraries.py"のスクリプト (図 1) を使用してシーケンスをフィルター処理します。 注: このスクリプトを割り当てるバーコード読み取りインデックス プライマーの組み合わせに基づいてサンプル サンプル Id で入力してマッピング ファイル。また、いくつかの品質が最低限の品質スコア、シーケンスの長さ、および終了トリミング カットのトレードオフをユーザー定義に基づいてエラーのシーケンス制御の手順をフィルタ リングを実行します。</li>
	<li>運用分類単位 (OTUs) を"pick_open_references_otus.py"のスクリプトを使用してシーケンスに割り当てます。 注: この手順のシーケンス id (通常 97%) のしきい値に基づいて参照シーケンスのコレクションに対してクラスター化されています。参照シーケンスのコレクションと一致しない読み取りは互いに対してクラスター化します。・ デ ・ ノボと終了参照乙ピッキング オプションも用意していますが、QIIME の開発者によって開く参照ピッキングお勧め。</li>
	<li>"Alpha_rarefaction.py"または"normalize_table.py"のスクリプトを使用して乙テーブルを正規化します。 注: この手順を修正列合計の変化かモダンなシーケンス テクノロジーに起因するサンプルあたり合計シーケンスを読み取ります。従来の真空を使用して正規化を実行することができますまたは累積合計スケーリングなどの代替方法。</li>
	<li>いくつかのアルファ多様性、ベータ多様性と"core_diversity_analysis.py"のスクリプトを使用して、一度に分類群組成多様性解析を実行します。 注: また、これらの解析実行できる個々 のスクリプトを使用して個別 (など、"alpha_diversity.py")。</li>
</ol>

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16S rRNA の次世代シーケンシング、微生物同定のための標準的なアプローチになるし、病原体の感染に影響を与えるベクトル内細菌叢解析の研究。ここで説明したプロトコル詳細I. スルメライム病の媒介種の微生物コミュニティ アセンブリを調査するこのメソッドを使用してただし、他のカチカチ種または節足動物媒介種勉強に簡単に適用することができます。
確?...

復活と最近十年間に媒介性疾患の広がり世界的な人間と野生動物の健康に深刻な脅威をもたらします。効果的なワクチンは、これらの疾患の大部分の欠けているし、コントロールの努力はベクトルとベクトル ホスト相互作用の複雑な生物学的性質によって妨げられます。これらの課題を回避する新しい戦略の開発のため病原体の感染でベクター内微生物相互作用の役割を理解することができます。特に、ベクター関連微生物共生生物と共生、マイクロバイと呼ばれる病原体の相互作用は、病原体の感染に重要な結果があります。圧倒的な証拠を今、ベクトル マイクロバイ オームおよびライム病1,2,3ジカ、マラリアなどの病気のための能力の間のリンクを示す例とこのアサーションをサポートします。ただし、疾病管理のための戦略にこれらの調査結果を翻訳構造、関数、およびベクター内細菌叢解析の起源のはるかに詳細な理解が必要です。変化する生態学的なおよび実験条件下でのベクトルの微生物コミュニティの同定と解析進むこの分野で重要なパスを構成します。
病原体のベクトルの微生物の居住者を識別するためのプロシージャは、西黒脚ダニセイブクロアシマダニライム病ライム病病原体の媒介種を利用してここで提供されます。ダニは、他の節足動物以上の人間の病原体の種類港中、比較的ティック内細菌叢解析4の生物学およびコミュニティの生態について少し知られています。ダニがウイルス、細菌、菌類、原生動物によって、共生、一過性微生物住民5,4などの多様な配列を抱くことは明らかです。前の仕事は、地理、種、セックス、ライフ ステージ、吸血ソース6,7、8に関連付けられているマダニ内細菌叢解析に強い変化を実証しています。しかし、この変化の基になるメカニズムは不明のまま、起源の調査とこれらの微生物コミュニティのアセンブリの詳細を保証します。ダニは垂直感染微生物を得ることができるホスト、気門、口、アナル孔9を通じて環境から吸収と接触。初期形成とティック マイクロバイの開発の形成要因を理解するには、相対的な上下環境伝送、具体的には目盛りの変化、自然なパターンを理解するために重要ですマイクロバイの多様性と疾患またはベクター コントロールに適用できるの病原体感染中のこれらのコミュニティの対話方法。
次世代シーケンスなどの強力な分子技術は今微生物を識別するため存在し、多様な環境や実験条件の下でベクトル内細菌叢解析を特徴づけるために用いることができます。これらの高スループット シーケンスのアプローチの出現で、前に微生物の同定は顕微鏡と文化主に依存。顕微鏡検査は迅速かつ簡単な方法が、微生物を識別するための形態学的方法は本質的に主観的な粗と低感度と検出10によって限られました。文化ベースのメソッドは微生物同定のため広く使用されて、薬物治療11微生物の感受性を決定するため使用することができます。ただし、このメソッドも、感度が低いと苦しんで環境微生物の 2% 未満を設定12研究室で培養できることが推定されています。組織の染色方法は、検出し、ベクトル内の特定微生物をローカライズ、ダニの内様々 な分類群の分布の調査を有効にして微生物の相互作用についての仮説を研究に採用されています。ただし、微生物のアイデンティティの知識はこのアプローチを作る微生物の特性と同定適して適切な汚れを選択するため必要です。さらに、組織染色は非常に時間がかかり、骨の折れるプロセスであり大規模なサンプル サイズにも対応していません。シーケンスは、感度と多様な微生物の検出に限られている同様にサンガーなど従来の分子アプローチ。
次世代シーケンサーは、サンプル数が多いから微生物の迅速同定のためことができます。標準的なマーカー遺伝子のデータベースをさらに有効に参照の存在は、属や種のレベルに多くの分類学的解像度を増強しました。リボソームの小サブユニット Rna は、16 s rRNA の遺伝子領域を節約され、変数の存在のために最も一般的である各細菌のユニークな産物と普遍的なプライマーを作成すると、この目標を達成するためによく使用されます。種13,14。このレポートは 16S rRNA 次世代シーケンスをティック マイクロバイのイチイを識別するための手順を詳しく説明します。特に、このプロトコルは、シークエンシングのためのサンプルを準備するための手順を強調します。もっと一般化順序の詳細については、バイオインフォマティクスの手順提供されており、現在利用可能なさまざまなシーケンスのプラットフォームおよび解析プログラムがあるのでそれぞれ豊富な既存ドキュメント。この次世代シーケンサー アプローチの全体的な可能性が主病のベクター内の微生物群集構造アセンブリの調査に適用することによって実証します。

<table><tbody><tr><td>Item</td><td>Name of Material/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog #</td></tr><tr><td>1</td><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>2</td><td>Qubit 4 Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q3326</td></tr><tr><td>3</td><td>NanoDrop 8000 Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td></tr><tr><td>4</td><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td></tr><tr><td>5</td><td>AMPure XP beads</td><td>Agen Court</td><td>A63880&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6</td><td>Magnetic Rack</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MR02</td></tr><tr><td>6</td><td>TE buffer</td><td>Teknova</td><td>T0223</td></tr><tr><td>7</td><td>Nextera Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1011</td></tr><tr><td>8</td><td>KAPA Library Quantification Kit</td><td>Roche</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>9</td><td>MiSeq System</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td></tr><tr><td>10</td><td>MiSeq Reagent Kit v3&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td></tr><tr><td>11</td><td>10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20</td><td>Teknova</td><td>T7724</td></tr></tbody></table>

tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing

最近十年間に媒介性疾患が再登場し、驚くべき速度、かなり罹患率と死亡率の世界の原因で展開します。効果的な広く利用可能なワクチンは、小説病軽減戦略の開発を必要とこれらの疾患の大部分の欠けています。この目的のためには、疾病の有望な道は、ベクトル マイクロバイ、ベクターに棲息する微生物のコミュニティを対象とする場合します。ベクトル マイクロバイ病原体ダイナミクスにおける極めて重要な役割を果たしているし、マイクロバイの操作は、ベクトル耐えられた病気の一握りの減らされたベクトルの豊富なまたは病原体伝送につながっています。ただし、病気、制御アプリケーションにこれらの調査結果を翻訳ベクトル微生物生態学、この分野で十分な技術によって歴史的に制限の徹底理解が必要です。次世代シーケンス アプローチの出現は、多様な微生物の迅速、高並列シーケンスを可能にしました。非常に節約される 16S rRNA 遺伝子をターゲットと変化する生態学的、実験条件の下でベクトル内に存在する細菌の特性を促進しています。この技法が PCR のシーケンス、フローセルに読み込みサンプルによってサンプル バーコード 16S rRNA 遺伝子の増幅とバイオインフォマティクスの系統情報を持つシーケンス データを一致するようにアプローチします。種または複製の高数の属レベルでの識別はこのアプローチにより、検出、解決、および伝統的な培養、顕微鏡、または組織学的染色からの出力の課題を回避通常達成することができます。テクニック。したがって、このメソッドはベクトル微生物多様な条件下での特性評価に最適ですが、現在微生物機能、ベクトル、または抗生物質による治療への応答内の場所に関する情報を提供できません。全体的にみて、16 次世代シーケンサーは、アイデンティティとベクトル病気ダイナミクスにおける微生物の役割を理解強力な手法です。

3 つの独立した卵から 42 タイマー刻みの合計クラッチし、0 と土中では、2 週間の 2 つの環境曝露期間マイクロバイ シーケンスの処理されました。各治療のグループ、1 つのクラッチと露出時間、6-8 目盛りサンプルの複製が含まれていると見なされます。これらの処理されたダニの抽出は次世代シーケンサーに読み込まれ、フィルターを渡す 12,885,713 のペアエンド リ?...

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Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

16S rRNA 配列ベクトル内で微生物の同定と解析を可能にするための次世代シーケンス プロトコルをご紹介します。このメソッドには、DNA 抽出、増幅し、pcr 法によって、フローセルとバイオインフォマティクスをシーケンス処理シーケンス データを系統情報に合わせてサンプルのバーコードが含まれます。

次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

tick-microbiome-characterization-next-generation-16s-rrna-amplicon

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K ビュー.  San Francisco State University. 16S rRNA 配列ベクトル内で微生物の同定と解析を可能にするための次世代シーケンス プロトコルをご紹介します。このメソッドには、DNA 抽出、増幅し、pcr 法によって、フローセルとバイオインフォマティクスをシーケンス処理シーケンス データを系統情報に合わせてサンプルのバーコードが含まれます。

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Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

遺伝学

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as with all these technologies, reproducible results depend on a laboratory workflow that incorporates appropriate precautions and controls. This is particularly important with low-biomass samples where contaminating bacterial DNA can generate misleading results. This article details a semi-automated workflow to identify microbes from human breast milk samples using targeted sequencing of the 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 region on a low- to mid-throughput scale. The protocol describes sample preparation from whole milk including: sample lysis, nucleic acid extraction, amplification of the V4 region of the 16S rRNA gene, and library preparation with quality control measures. Importantly, the protocol and discussion consider issues that are salient to the preparation and analysis of low-biomass samples including appropriate positive and negative controls, PCR inhibitor removal, sample contamination by environmental, reagent, or experimental sources, and experimental best practices designed to ensure reproducibility. While the protocol as described is specific to human milk samples, it is adaptable to numerous low- and high-biomass sample types, including samples collected on swabs, frozen neat, or stabilized in a preservation buffer.

A semi-automated workflow is presented for targeted sequencing of 16S rRNA from human milk and other low-biomass sample types.

人間のミルクのサンプルのターゲット 16S シーケンス法

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

免疫・感染学

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

生物学

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

16S rRNA Sequencing: A PCR-based Technique to Identify Bacterial Species

Source: Ewa Bukowska-Faniband1, Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Planet Earth is a habitat for millions of bacterial species, each of which has specific characteristics. Identification of bacterial species is widely used in microbial ecology to determine biodiversity of environmental samples and medical microbiology to diagnose infected patients. Bacteria can be classified using conventional microbiology methods, such as microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. In recent decades, molecular microbiology methods have revolutionized bacterial identification. A popular method is 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing. This method is not only faster and more accurate than conventional methods, but also allows identification of strains that are difficult to grow in laboratory conditions. Furthermore, differentiation of strains at the molecular level enables discrimination between phenotypically identical bacteria (1-4).
16S rRNA joins with a complex of 19 proteins to form a 30S subunit of the bacterial ribosome (5). It is encoded by the 16S rRNA gene, which is present and highly conserved in all bacteria due to its essential function in ribosome assembly; however, it also contains variable regions which may serve as fingerprints for particular species. These features have made the 16S rRNA gene an ideal genetic fragment to be used in identification, comparison, and phylogenetic classification of bacteria (6).
16S rRNA gene sequencing is based on the polymerase chain reaction (PCR) (7-8) followed by DNA sequencing (9). PCR is a molecular biology method used to amplify specific fragments of DNA through a series of cycles that include:
i) Denaturation of a double stranded DNA template 
ii) Annealing of primers (short oligonucleotides) that are complementary to the template 
iii) Extension of primers by the DNA polymerase enzyme, which synthesizes a new DNA strand
A schematic overview of the method is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig1.jpg" /> 
Figure 1: Schematic overview of the PCR reaction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
There are several factors that are important for a successful PCR reaction, one of which is quality of the DNA template. Isolation of chromosomal DNA from bacteria can be performed using standard protocols or commercial kits. Special care should be taken to obtain DNA that is free of contaminants that can inhibit the PCR reaction.
Conserved regions of the 16S rRNA gene permit the design of universal primer pairs (one forward and one reverse) that can bind to and amplify the target region in any bacterial species. The target region can vary in size. While some primer pairs can amplify most of the 16S rRNA gene, others amplify only parts of it. Examples of commonly used primers are shown in Table 1 and their binding sites are depicted in Figure 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primer name</td>
			<td>Sequence (5&#39;&#8594;3&#39;)</td>
			<td>Forward/ reverse</td>
			<td>Reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8F b)</td>
			<td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td>
			<td>forward</td>
			<td>-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27F</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td>forward</td>
			<td>-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515F</td>
			<td>GTGCCAGCMGCCGCGGTAA</td>
			<td>forward</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>911R</td>
			<td>GCCCCCGTCAATTCMTTTGA</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1391R</td>
			<td>GACGGGCGGTGTGTRCA</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1492R</td>
			<td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Examples of standard oligonucleotides used in amplification of 16S rRNA genes a). 
a) The expected lengths of the PCR product generated using the different primer combinations can be estimated by calculating the distance between the binding sites for the forward and the reverse primer (see Figure 2), e.g. the size of the PCR product using primer pair 8F-1492R is ~1500 bp, and for primer pair 27F-911R ~900 bp. 
b) also known as fD1
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig2.jpg" /> 
Figure 2: Representative figure of the 16S rRNA sequence and the primer-binding sites. Conserved regions are colored in grey and variable regions are filled with diagonal lines. To allow for the highest resolution, primer 8F and 1492R (name based on location on rRNA sequence) are used to amplify the whole sequence, allowing for the sequencing of several variable regions of the gene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Cycling conditions for PCR (i.e. the temperature and time required for the DNA to be denatured, annealed with primers, and synthesized) are dependent on the type of polymerase that is used and the properties of the primers. It is recommended to follow the manufacturer&#39;s guidelines for a particular polymerase.
After the PCR program is completed, the products are analyzed by agarose gel electrophoresis. A successful PCR yields a single band of expected size. The product must be purified prior to sequencing to remove residual primers, deoxyribonucleotides, polymerase, and buffer which were present in the PCR reaction. The purified DNA fragments are usually sent for sequencing to commercial sequencing services; however, some institutions perform DNA sequencing at their own core facilities.
The DNA sequence is automatically generated from a DNA chromatogram by a computer and must be carefully checked for quality, as manual editing is sometimes needed. Following this step, the gene sequence is compared with sequences deposited in the 16S rRNA database. The regions of similarity are identified, and the most similar sequences are delivered.

16S rRNA Sequencing: Identifying Bacterial Species by PCR

16S rRNAシーケンシング:細菌種を同定するPCRベースの技術

Source: Ewa Bukowska-Faniband1, Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, ...

次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

要約

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探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

人間のミルクのサンプルのターゲット 16S シーケンス法

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

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次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

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